全 文 ：华北农学报·2013，28 ( 4 ) : 62 -65
收稿日期:2013 － 05 － 10
基金项目:国家自然基金项目(31000907) ;宁波市创新团队项目(2011B82020) ;宁波市农业重大攻关项目(2010C10012)
作者简介:宋 慧(1979 －) ，女，甘肃兰州人，农艺师，博士，主要从事瓜类分子辅助育种与生物工程研究。
通讯作者:王毓洪(1968 －) ，男，浙江常山人，高级农艺师，硕士，主要从事瓜菜育种研究。
瓠瓜耐湿涝相关根系性状遗传规律及分子标记筛选
宋 慧，张香琴，高 旭，王毓洪
(宁波市农业科学研究院 蔬菜研究所，浙江 宁波 315040)
摘要:以耐湿涝瓠瓜材料 JZS和不耐湿涝材料 T2002 及其杂交 F2 群体为材料，选择湿涝条件下不定根数目作为
耐湿涝鉴定指标，分析瓠瓜耐湿涝特性遗传规律，并采用集团混合分离分析法筛选相关分子标记。结果表明，瓠瓜亲
本 JZS的耐湿涝特性由 1 对显性单基因控制，F1 的不定根数目比耐湿涝亲本 JZS 增多，表现出超亲优势。在 600 个
RAPD和 100 对瓠瓜 SSR 引物中，共有 18 个引物(14 个 RAPD 和 4 对 SSR)在双亲中显示多态性。最终筛选到瓠瓜
SSR引物 S87 /88，在双亲及基因池间稳定扩增出片段大小为 230 bp的差异条带。通过 F2 153 个单株验证，确定表型
调查耐湿涝结果与分子标记 S87 /88 鉴定结果相关性极显著(相关系数 0． 78) ，利用 Mapmaker 3． 0 软件对分子标记与
表型结果进行连锁分析，S87 /88 与瓠瓜耐湿涝相关的不定根数目基因的连锁距离为 8． 8 cM，为进一步利用分子辅助
育种加速耐湿涝瓠瓜新品种的选育提供有效标记。
关键词:瓠瓜;耐湿涝;遗传规律;分子标记
中图分类号:S642． 03 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2013)04 － 0062 － 04
Inheritance of Water Logging Tolerance and Molecular Marker
Linked to Related Root Trait in Bottle Gourd
SONG Hui，ZHANG Xiang-qin，GAO Xu，WANG Yu-hong
(Institute of Vegetable，Ningbo Academy of Agricultural Sciences，Ningbo 315040，China)
Abstract:The tolerant parent JZS，susceptible parent T2002 and their F2 generation were used to analysis of
the inheritance of water logging tolerance and identification of the linked molecular marker by BSA method (Bulked
Segregate Analysis)with the identification index of adventitious root number under water logging in bottle gourd．
The results showed that the inheritance of water logging tolerance of JZS was controlled by one pare single dominant
gene，and the heterosis was showed in F1 with more adventitious root number than the tolerant parent JZS． Among
600 RAPD and 100 bottle gourd SSR primers，total number of 18 markers (14 RAPD and 4 SSR)showed the poly-
morphism between two parents，and among which one SSR primer of S87 /88 was screened a polymorphic lolus (230
bp)between two parents and between tolerant and susceptible bulks． S87 /88 showed the significant correlation with
the water logging tolerance of the F2 population identified by adventitious root number，and the genetic distance be-
tween them was 8． 8 cM determined by Mapmaker 3． 0 software，which provided the useful molecular marker to as-
sistant select the new variety with water logging tolerance in bottle gourd．
Key words:Bottle gourd;Water logging tolerance;Inheritance;Molecular marker
湿涝胁迫是世界农业普遍面临的自然灾害之
一［1］。我国长江中下游地区平均降水量 224． 3 ～
626． 5 mm，土壤湿涝逆境严重影响了黄瓜、西瓜和
甜瓜等瓜类作物的产量［2］。瓠瓜(Bottle gourd，Lag-
enaria siceraria(Molina)Standl．) ，别名瓠子、扁蒲，隶
属葫芦科葫芦属一年生攀援草本植物，根部发达，常
用作瓜类作物的砧木，以增强接穗耐逆性，提高产
量［3］。耐湿涝瓠瓜砧木的选育已成为瓠瓜育种的
重要目标之一。
集团混合分离分析法(Bulked segregate analy-
sis，BSA法) ，是筛选作物重要农艺性状分子标记的
通用方法。钱凯［4］和张江丽等［5］分别利用 BSA法，
4 期 宋 慧等: 瓠瓜耐湿涝相关根系性状遗传规律及分子标记筛选 63
构建大麦和小麦的耐湿和感湿基因池，通过两池间
SSR和 RAPD标记筛选，得到 SSR标记 WMC1E8 和
RAPD标记 s1249，在双亲和池间均检测出多态性。
经过群体分析，确定该标记与耐湿性呈极显著相关，
揭示耐湿性表型变异分别为 29． 9%和 13． 9%，可用
以大麦和小麦的耐湿性分子标记筛选。
目前关于瓠瓜耐湿涝的研究多为田间筛选工
作，有关瓠瓜耐湿涝遗传规律和分子标记筛选的研
究未见报道。为此，本研究拟根据前期对 8 份瓠瓜
类型砧木材料(T2002、JZS、京欣砧 1 号、JTT、甬砧 1
号、甬瓠 2 号、C2002 和 Z063-1)的根系鉴定结果与
耐湿涝特性观察，筛选出耐湿涝材料 JZS 和不耐湿
涝材料 T2002，构建 F1 和 F2 群体。通过 BSA法，采
用不定根数目作为湿涝害的鉴定指标，利用 RAPD
和 SSR标记研究瓠瓜耐湿涝特性，寻找紧密连锁的
分子标记，用以瓠瓜耐湿涝分子标记辅助育种。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
耐湿涝瓠瓜材料 JZS 和不耐湿涝材料 T2002，
及其 F1 和 F2 后代分离群体。播种于 32 孔穴盘中，
常规田间管理，播种量见表 1。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 淹水处理与耐湿涝鉴定指标 待植株长至
四叶一心时，开始湿涝处理。具体方法是:将穴盘放
入绿色餐盒(60 cm ×40 cm ×10 cm)中，灌水直至水
面没到土面以上 1 cm，保持淹水状态。20 d 后，统
计 JZS 和 T2002 及 F1 和 F2 单株根茎部的不定根
(长度大于 1 cm)数目。F2 群体单株中，不定根数
目≤8，确定为不耐湿涝;不定根数目 ＞ 8 确定为耐
湿涝。分别统计耐湿涝与不耐湿涝分离单株数目。
表 1 JZS、T2002、F1 及 F2 群体的播种量与不定根数目统计
Tab． 1 Sowing number and adventitious root number of JZS，T2002，F1 and F2 generation
名称
Name
播种总数
Sowing number
统计总数
Observation number
不定根数目(Mean ± SE)
Adventitious root number
耐湿涝性
Water logging tolerance
JZS 32 27 12． 3 ± 3． 9 耐
T2002 32 30 4． 4 ± 2． 3 不耐
F1 22 20 14． 0 ± 4． 0 耐
F2 224 153 13． 0 ± 5． 5 耐∶不耐 = 3∶ 1
1． 2． 2 DNA 提取 材料播种后，待植株长至 5 ～ 6
片真叶时，每份样品各取 10 个单株的混合叶片，每
株采集嫩叶 1 g，－ 80 ℃保存。参照 CTAB 法，提取
新鲜叶片总基因组 DNA。
1． 2． 3 耐湿涝基因池与不耐湿涝基因池的构建
根据 BAS法的原理，在 F2 群体 153 个单株中，依据
不定根数目鉴定的耐湿涝结果，分别挑选 6 株耐湿
涝单株和不耐湿涝单株，提取 DNA，检测浓度后，等
量混合，建立耐湿涝基因池(A)和不耐湿涝基因池
(B)。选择在双亲中表现多态性的 RAPD 引物和瓠
瓜 SSR引物在基因池 A和 B中进行扩增，筛选耐湿
涝分子标记。
1． 2． 4 分子标记分析 瓠瓜 SSR 引物序列由浙江
省农科院蔬菜研究所李国景研究员提供。RAPD 和
SSR的混样体系为 20 μL，其中包括 3． 24 μL dNTP
(1． 25 mmol /L) ，1． 5 μL 10 × Buffer，2． 43 μL MgCl2
(25 mmol /L) ，1． 35 μL 引物(5 mmol /L) ，5 μL DNA
(10 ng /μL) ，0． 05 μL Taq(1 U)。RAPD 和 SSR 的
PCR产物分别使用 2%琼脂糖胶和高分辨率 MS-6
琼脂糖胶(TAKARA，上海) ，水平电泳检测。
1． 3 数据记录与连锁分析
某个等位基因扩增出条带记为 1，同一位置无
带记为 0。选择在双亲中有差异的引物作为抗感基
因池筛选耐湿涝分子标记的候选引物。利用
Mapmaker 3． 0 软件对分子标记与表型鉴定结果进
行连锁分析。
2 结果与分析
2． 1 瓠瓜耐湿涝性状遗传规律分析
对瓠瓜耐湿涝材料 JZS 与不耐湿涝材料
T2002，及其构建的 F1 和 F2 杂交群体，进行淹水后
不定根数目的统计。耐湿涝鉴定结果见表 1，JZS 的
不定根数目为 12． 3 ± 3． 9，不定根数目 ＞ 8，表现为
耐湿涝;T2002 的不定根数目为 4． 4 ± 2． 3，不定根数
目≤8，表现为不耐湿涝;F1 的不定数目达到 14． 0 ±
4． 0，不定根数目 ＞ 8，表现为耐湿涝，且 F1 比耐湿涝
亲本 JZS的不定根数目 12． 3 ± 3． 9 增多，表现出超
亲优势(图 1)。在对 F2 群体 153 个单株的调查中
发现(表 2) ，不定根数目 ＞ 8 的耐湿涝单株有 122
株，不定根数目≤8 不耐湿涝的单株有 31 株，分离
比例 3 ∶ 1。经卡方测验，分离比例符合孟德尔分离
规律，瓠瓜亲本 JZS 的耐湿涝特性由 1 对显性单基
因控制。
64 华 北 农 学 报 28 卷
表 2 F2 群体中田间指标和分子标记分离情况
Tab． 2 Identification results of adventitious root number and molecular marker in F2 generation
指标 Index
不定根数目
Adventitious
root number
分子标记
Molecular marker
分子标记与不定根数目鉴定结果
Identification results
＞ 8 ≤8 χ2
扩增
Amplification
缺失
Deletion χ
2 相关系数
Correlation coefficient
连锁距离 /cM
Genetic distance
F2 群体分离
F2 generation
122 31 符合 3∶ 1 114 36 符合 3∶ 1 0． 78 8． 8
图 1 T2002、JZS和 F1 不定根的生长情况
Fig． 1 Adventitious root growth of T2002，JZS and F1
2． 2 RAPD和瓠瓜 SSR揭示双亲 JZS和 T2002 的
多态性比例
600 对 RAPD引物在双亲 JZS和 T2002 中分别
扩增出 4 186，4 194 个条带，平均每个引物产生条带
6． 95 个(表 3)。筛选到 14 个 RAPD 引物(编号为
s12、s14、s15、s56、s93、s104、s106、s115、s122、s205、
s213、s249、s254、s374) ，共扩增出 16 个差异位点。
RAPD引物揭示双亲的多态性比例为 0． 38%(表 3)。
100 对瓠瓜 SSR引物在双亲 JZS 和 T2002 中扩
增出 852 个条带，平均每个引物产生条带 8． 52 个
(表 3)。筛选到 4 对引物(S35 /36、S43 /44、S49 /50
和 S87 /88) ，共扩增出 4 个差异位点。瓠瓜 SSR 引
物揭示亲本材料的多态性比例为 0． 47%，比 RAPD
揭示的多态性比例(0． 38%)高，表明瓠瓜 SSR是瓠
瓜材料分子标记筛选的最佳引物类型。
表 3 RAPD和瓠瓜 SSR在亲本材料中的多态性
Tab． 3 Polymorphism between two parents of RAPD and bottle gourd SSR primer
标记类型
Type
引物使用
Number
扩增位点 Loci
JZS T2002
扩增位
点数 /引物
Loci /Primer
差异引物
Polymorphism
primer
多态性位点
Polymorphism
loci
多态性比例 /%
Polymorphism
ratio
RAPD 600 4 186 4 194 6． 95 14 16 0． 38
SSR 100 852 852 8． 52 4 4 0． 47
合计 Total 700 5 038 5 046 7． 20 24 26 0． 52
1． JZS;2． T2002;3． F1;4．基因池 A;5．基因池 B;
M． 50 bp DNA ladder Marker;黑色箭头．差异位点。
1． JZS;2． T2002;3． F1;4． Bulk (A) ;5． Bulk (B) ;M． 50 bp DNA
ladder Marker;Black arrow． Polymorphic fragments．
图 2 多态性瓠瓜 SSR引物在亲本、F1 及
基因池 A和基因池 B中的扩增
Fig． 2 Amplification of polymorphism bottle gourd
SSR primer in two parents，F1，Bulk (A)and Bulk (B)
2． 3 双亲多态性引物在基因池 A和 B中的筛选
选择双亲中表现多态性的 14 个 RAPD 引物和
4 对瓠瓜 SSR引物，在基因池 A(耐湿涝基因池)和
B(不耐湿涝基因池)中进行扩增。筛选到 1 对瓠瓜
SSR引物 S87 /88，在 2 个基因池中出现与双亲多态
性结果一致的差异片段，大小为 230 bp(图 2) ，耐湿
涝亲本 JZS(泳道 1)、F1(泳道 3)和耐湿涝基因池 A
(泳道 4)有差异片段扩增，不耐湿涝亲本 T2002(泳
道 2)与不耐湿涝基因池 B(泳道 5) ，此差异片段缺
失。验证亲本 JZS 的耐湿涝特性由显性基因控制。
其他双亲多态性引物由于在基因池中没有扩增出相
应差异，予以淘汰(图 2，S49 /50，120 bp)。
2． 4 耐湿涝分子标记在 F2 群体中的验证
利用瓠瓜 SSR引物 S87 /88 对 153 株 F2 群体进
行验证。有 3 个单株扩增失败，剩余的 150 个单株
中，114 株植株出现 230 bp 差异片段，36 个单株该
片段缺失(图 3)。分离比例 3 ∶ 1，经卡方测验，分离
比例符合孟德尔分离规律，瓠瓜亲本 JZS 的耐湿涝
特性由 1 对显性单基因控制。通过相关系数计算，
不定根数目调查结果与分子标记结果相关性极显
著，相关系数为 0． 78;利用 Mapmaker 3． 0 软件对分
子标记与表型鉴定结果进行连锁分析，瓠瓜 SSR 引
物 S87 /88 与瓠瓜耐湿涝相关的不定根数目基因的
4 期 宋 慧等: 瓠瓜耐湿涝相关根系性状遗传规律及分子标记筛选 65
连锁距离为 8． 8 cM(表 2)。
M． 50 bp DNA ladder Marker:左侧黑色箭头．差异位点;
下侧黑色箭头．条带缺失的不耐湿涝单株。
M． 50 bp DNA ladder Marker;Black arrow at left．
Polymorphic fragments;Black arrow at bottom． Susceptible
individuals with polymorphic fragment deletion．
图 3 瓠瓜 SSR引物 S87 /88 在部分 F2 群体单株中的扩增
Fig． 3 Amplification of S87 /88 in the
partial individuals of F2 generation
3 讨论
国内外众多研究表明，作物的耐湿涝特性为数
量性状，受主基因控制，遗传机理复杂。有关瓜类作
物耐湿涝遗传规律的研究较少，仅见扬州大学陈学
好教授在黄瓜中的报道。Yeboah 等［6 － 7］利用耐湿
涝黄瓜品种(PW0832)和感涝品种(PW0801)配置
F3家系，首先明确新根形成(Adventitious root forma-
tion，ARF)、茎尖干质量(Shoot dry weight，SDW)和
茎长(Vine length，VLH)3 个表型性状与黄瓜耐湿涝
性呈显著相关，在 144 个 F3家系单株中呈连续分
布，为数量性状;其遗传规律分析的结果表明，F1 表
现超亲优势，各性状以加性效应为主，显性效应不明
显。其他作物，如小麦、玉米和油菜等耐湿涝研究比
较深入。Poysa［8］利用代换系研究小麦品种 Chey-
enne的耐湿涝性，指出小麦耐湿性属主基因控制的
遗传行为。曹旸等［9］认为，湿涝抗性受单个显性基
因控制;Boru等［10］利用小麦感湿涝自交系与耐湿涝
自交系构建杂交种，在三叶期和第一节间发生期进
行淹水处理，以叶绿素含量为指标，研究发现，耐湿
涝性受加性效应控制，至少受 4 个基因控制。丛野
等［11］利用耐湿涝性遗传差异较大的 2 个甘蓝型油
菜纯系中双 9 号和 GH01，构建油菜耐湿涝性遗传体
系，研究表明，中双 9 号 × GH01 组合的耐湿性遗传
受 2 对完全显性主基因 +加性-显性多基因控制，表
现为耐湿对不耐湿完全显性。本研究结果与前人报
道比较一致，表型和分子标记在 F2 群体中的分离数
据均符合卡方比例 3 ∶ 1(耐湿涝∶感湿涝) ，表明瓠瓜
亲本 JZS的耐湿涝特性由 1 对显性单基因控制，且
F1 的不定根数目比耐湿涝亲本 JZS 增多，表现出超
亲优势。
探明作物耐湿涝遗传规律，筛选紧密连锁分子
标记，对利用分子辅助育种加速耐湿涝作物新品种
的选育，具有重要的理论和现实意义。鉴于耐湿涝
性状为数量性状，通过 QTL分析筛选连锁标记的报
道较多［2，12 － 13］，同时，该性状又受主基因控制，因
此，通过构建耐感湿涝基因池，利用 BSA 法筛选主
效连锁标记也有成功报道［4 － 5］。本研究通过对耐湿
涝瓠瓜材料 JZS 和不耐湿涝材料 T2002，及其 F2 群
体构建的耐感基因池进行分子标记分析，筛选到瓠
瓜 SSR引物 S87 /88-230 bp与表型调查耐湿涝结果
相关系数为 0． 78，与瓠瓜耐湿涝相关的不定根数目
基因的连锁距离为 8． 8 cM，为进一步利用分子标记
辅助选育耐湿涝瓠瓜新品种提供有效标记。
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