全 文 ：第 10卷 第 4期
2 0 0 2年 1 2月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vo1．10 NO．4
Dec．， 2002
利用RAPD与SSR技术进行野生大豆种群内分化的研究*
周 晓馥 庄炳 昌 王 玉民 赵 洪琨
(吉林省农业科学院农业生物技术重点开放实验室 公主岭 136100)
摘 要 利用RAPD和 SSR技术对 25。N野生大豆种群 16个样本进行分子标记，从 150多个 RAPD引物中筛选出
具有多态性的引物 20个 ，共扩增出146个标记位点，其中具有多态性的有 60个，占总位点的40．8％，平均遗传距
离为0．1536，杂合度为0．3248。从60对 SSR引物中筛选出 14对具有多态性的引物，平均遗传距离为 0．2209，杂
合度为 0．6961。聚类分析可将 25。N野生大豆 16个样本分成 5类，表明种群内存在大量的遗传变异。为研究野生
大豆种群内及种群间的遗传多态性探索了有效方法，并提 出野生大豆核心种质资源的保存及取样对策。
关键 词 RAPD SSR 种 群分化 野 生大豆 分 子标记
Population differentiation of wild soybean based on the RAPD and SSR analysis．ZH0U Xiao-Fu．ZHUANG Bing-
Chang，WANG Yu—Min，ZHAO Hong—Kun(Key Open Lab．On Agro-Biotechnology，Jilin Academy of Agricultural Sci—
ence，GongzhuLing 136100)，CJEA，2002，10(4)：6～9
Abstract Random amplified polymorphic DNA (RAPD)and simple sequence repeat(SSR)analyses were applied tO 16
samples of wild soybeans(Glycine soja sieb and Zucc)originated from the region of 25。N．Twenty primers screened with
150 ones yielded 146 RAPD bands which had 60 polymorphic products and 40．8％ of total bands．the average heterozy—
gosity(He)was 0．3248 and the average genetic distance among the 16 samples was 0．1536．Fourteen pairs of soybean
SSR primers screened had polymorphism．the average heterozygosity was 0．6961 and the average genetic distance was
0．2209．Cluster analysis showed there are five smal classes divided from the 16 samples and there are some evidence
showing genetic variations in the population．The genetic resource is also put forward．
Key words RAPD，SSR，Population diferentiation，Glycine soia，Molecular markers
野生大豆(Glycine soja)是栽培大豆的野生近缘种 ，开展野生大豆的研究 ，特别是野 生大豆种群 内遗传
分化多样性的研究，对保护和开发野生大豆资源具有重要意义。以往的野生大豆小种群内遗传分化研究是
在同工酶和等位酶水平上进行的，证明了野生大豆小种群内存在着大量的遗传分化。庄炳昌 对不同纬度
不同进化类型大豆的 RAPD分析也表明 Clycine亚属内种间存在明显差异，且指出25。N在大豆资源研究中
具有重要意义。为此 ，对 25。N野生大豆种群进行了RAPD和 SSR研究分析，探讨了种群内遗传结构及种群
内遗传分化程度，为野生大豆分子生态学提供若干参数及理论基础，并提出大豆核心种质资源采集对策。
1 试验材料与方法
供试材料选择我国25。N野生大豆种群，该种群共包括 16份材料，由吉林省农业科学院提供，引物购 自
Operon公司。DNA提取按照Rogrers和Bendish(1988)报道的CTAB(Cetyl thylammonium bromide)方法，并
参考忻骅等(1997)的方法，稍作改进 ，提取新鲜叶片的总 DNA。RAPD反应体系总体积 25t~L，其中模板
DNA 50ng，200t~mol dNTP，引 物 200nmol，2．5“L 10×buffer(100mmol Tris—HCL pH=8，3mmol KCl，
200mmol MgC1 ，0．001％ geltatin，0．1％ Np一40)，1．5单位 TaqDNA聚合酶，加 2滴石蜡油防止蒸发。反
应循环参数为 94℃变性 5min后：94℃ 30s，52℃ 30s，68℃ 30s，45个循环；最后 72℃延伸 10min，反应在
UNO l PCR循环仪上进行，PCR产物采用 1．4％琼脂糖电泳检测，电泳结果在透式紫外灯上照相记录，
RAPD引物序列见表 1。SSR反应体系总体积 25t~L，其中模板 DNA 60ng，200t~mol dNTP，引物 200nmol，
2．5 L 10×buffer(100mmol Tris—HCL pH=8，3mmol KC1，200mmol MgC12，0．001％ geltatin，0．1％ Np一
40)，1．5单位 TaqDNA聚合酶，加 2滴石蜡油防止蒸发，反应循环参数为 94℃ 5min 1个循环：94℃ 30s，
* 国家自然科学基金项目(39730330，39670448)和国家基础研究(973)发展规划项 目(G1998010200)资助
收稿 日期：2001—06—30 改回日期：2001—07—30
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第 4期 周晓馥等：利用 RAPD与 SSR技术进行野生大豆种群内分化的研究 7
52℃ 30s，68℃ 30s，30个循环；最后 72℃延伸 10min，反应在 UNO l】PCR循环仪上进行，PCR产物采用
10％聚丙烯酰胺 150V电泳检测，电泳结果在透式紫外灯上照相记录，SSR引物序列见表 2。数据处理是对
不同的个体所扩增 DNA条带量化为 1或 0(有条带为 1，无条带为 0)，在相同实验条件下迁移相同的条带视
为同源位点。统计结果用软件 NTSYS—PC Version 1．70 Qualitative进行矩阵分析，然后进行 SHAN Cluster—
ing亲缘关系分析，并给出亲缘关系树状图。
表 1 RAPD引物序列
Tab．1 RAPD primer sequences
I物号 I物序列 I物号 引物序列
No of primers Primer sequences No．of primers Primer sequences
OPB1 5 G T T T C G C T C C 3 0P013 5 G T C A G A G T C C 3
OPF16 5 G G A G T A C T G G 3 OPO19 5 G G T G C A C G T T 3
OPG18 5 G G C T C A T G T G 3 OP08 5 C C T C C A G T G T 3
OPG2 5 G G C A C T G A G G 3 OPP2 5 T C G G C A C G C A 3
OPG7 5 G A A C C T G C G G 3 OPP3 5 C T G A T A C G C 3
OPG8 5 T C A C G T C C A C 3 OPP7 5 G T C C A T G C C A 3
OPH20 5 G G G A G A C A T C 3 OPP8 5 A C A T C G C C A 3
OPH5 5 A G T C G T C C C C 3 OPF14 5 T G C T G C A G G T 3
OPH7 5 C T G C A T C G T G 3 OPF4 5 G G T G A T C A G G 3
OPH17 5 C C C A G C T G T G 3 OPH12 5 A C G C G C A T G T 3
表 2 SSR 引物 序列
Tab．2 SSR primer sequences
I物号 I物序列 I物号 I物序列
No d prim~ Primer sequences No．of primeas Primer seqlenc~
161／162 5 TTT TTG TTT AAC TTA CTG TAC TFr3 209／210 5 CCA ACT TGA AAT TAC TAG AGA AA3
5 GCT AGT CTT CTA CAA CCT TCT A3 5 CTT ACT AGC GTA TTA ACC CTT3
163／164 5 GGA AGA AAG TAT TGG TCT GT3 225／226 5 TGG TTT CTA CT TCT ATA ATT ATT T3
5 AGG AGA GAG TGG AGA GAT TA3 5 ATG CCT CTC CCT CCT3
179／180 5 AAA GGA GTA GGA TGT AAG AGA3 227／228 5 AAA ATA ACT AAA ATG TCT TCT CA3
5 CAA ACC ACC AGT GAC C3 5 TTG GTC AGA TTA TTA TAA GAT TG3
181／182 5 GCC TTT TCT GAC TGT TAA3 235／326 5 GAT cTA AAG TcT GAT A1vr TTT AAC TA3
5 CAG TGA CTA AAA CTT ACT AT3 5 AAA AGG AGA AGG AAT GC3
195／196 5 AAA AAA TAT TTA TAG GTT ACA TGT G3 173／174 5 GAT ACG ACC AAA AAT TGT T3
5 TTA CCA CTA AGA ATT AGG TCT AA3 5 AAC TGA GAA GAT ACT ACC C3
197／198 5 CGA AAC GCA AAA TCT C3 215／216 5 GAG AAA GAA ATG TGT TAG TGT AA3
5 AAA ACG TAT CTG AAG TAG TGG3 5 CTT TCC CTT CTT ATT CTT TGA3
199／200 5 TCG CCG GTA CAA AAG3 217／218 5 TGT AT TTA CCT TAC CTT TGA3
5 CGA ATG AAC AAA CAA ACA3 5 ACC TGC CAC CAA TGA C3
2 结果与分析
RAPD多态性分析，从 150个随机引物中筛选出20个有效引物(即在 25。N野生大豆种群 16个样本的
基因组 DNA中都扩增 出 DNA片段的引物)，该 20
个有效引物共获得 146个标记位点，其中 60个表现
出多态性，占总位点的40．8％，平均每个引物扩增的
DNA带数为 7．3条，不同引物得到各自不同的25。N
野生大豆种群 16个样本的基因组 DNA指纹图谱，
其中用引物 OPG7扩增得到的 DNA指纹图谱见图
1。SSR多态性分析，从 60对引物中筛选出对 16个
样本扩增产物具有明显多态性的引物 14对(引物序
列见表 2)，扩增产物的多态性可通过 4％琼脂糖凝
胶电泳或 10％聚丙烯酰胺 150V电泳检测，研究发
图 1 用引物 OPG7扩增得 到的基 因组 NDA指纹 图谱
Fig．1 Genomic DNA fingerprints amplified with the primer OPG7
现采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率明显优于琼脂糖电泳，因而本实验采用后者，用引物 163／164扩增得到
的DNA指纹图谱见图2。UPGA聚类分析，本实验对 14对 SSR引物在 25。N野生大豆种群 16个样本扩增
的产物进行 UPGA聚类分析的基础上，建立了 16个样本 25。N野生大豆遗传关系树状图(见图3)，同时对
20个随机引物在 16个样本扩增的 146条 DNA带进行 UPGA聚类分析结果与图3基本相符。图3表明，16
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8 中 国 生 态 农 业 学 报 第 10卷
图2 用引物163／164扩增得到的基因组DNA指纹图谱
Fig．2 C,er~ c DNA fingerprints amplified with the primers 1631164
个样本可划分为 5个类群 ，I类包括 1，2号样
本，Ⅱ类包括 3，4，5和 9号样本，Ⅲ类包括
12，13，14，15和16号样本 ，Ⅳ类包括6，8，10
0．480 0 560 0．640 0．720 0．800 0．880 0 960
0．480 0 560 0 640 0．720 0．800 0 880 0．960
图 3 25。N野生大豆 l6个样本的 SSR聚类分析树状图
Fig．3 Dendrogram of 16 sampled from 25 N wild soybean based on SSR markers
和 11号样本，V类包括 7号样本，这 5个类群之间遗传距离分别为 0．350，0．315，0．386，0．463。25。N野生
大豆小种群内遗传多态位点比例(RAPD)1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16号样本分别为
22．5％ ，34．12％ ，3．0％ ，31．67％ ，31．69％ ，43．33％ ，38．33％ ，44．12％ ，39．17％ ，32．5％ ，30．83％ ，28．33％ ，
34．12％，33．33％，40．0％，35．00％。假设每条谱带代表 1个基因座位 ，多态座位比例 =多态座位数／所测座
位总数。这一结果符合 Ayala F．J． 5 的判断(即对大部分有机体而言 1个群体多态位点的比率介于 20％～
50％间，表明25。N野生大豆小种群内存在着大量的遗传分化，25。N野生大豆遗传多态位点比例在 0．225～
0．4333之间。25。N野生大豆小种群群体杂合度(Population heterozygosity，He)：
He=1一∑X； (1)
其中 为第 i等位基因或基因频率。从基因频率可计算出 25。N 16个样本的平均杂合度 SSR He为
0．6961，RAPD He为 0．3248。由于野生大豆是 白花授粉植物，实际测量的 He值应大大低于期望值 ，从群
体杂合度看，同样可以得出25。N野生大豆小种群内存在着大量的遗传多样性这一结论。遗传距离和遗传
一 致性 (genetic identity，f)：
f= X Y ／( ；y；)／1／2 (2)
表 3 25。N种群内 4类间遗传距离与遗传相似性(SSR)
Tab．3 The genetic distances and genetic identity between
式中，X 、y 为群体 、y的第 i等位基因或基因
型频率。遗传距离(Genetic distance，D)D=in／，
聚类分析将 16个样本分成5类。25。N种群内4类
间遗传距离与遗传相似性见表 3。
3 小结与讨论
本实验采用 RAPD和 SSR技术分别对样本进
行标记，2类标记的结果大致相同，但也存在一些
差异。RAPD技术操作简单，灵敏度高，但 目前应用过程中最主要问题是RAPD扩增的带型不稳定。本研究
发现扩增产物中弱带较多，导致条带识别中的误差增大，并可能引起实验重复性不好的后果。条带数目是决
定 RAPD分析性的最主要因素 ，故本实验对 RAPD扩增的弱带不做统计。SSR技术具有高共显性、多态
性等特点，是 1种很有价值的分子标记，它的 PCR产物除主带以外，上下还有一些阴影带，这是由于扩增微
卫星 DNA时 TaqDNA聚合酶滑动造成的，但这些带一般均>300～400个碱基，不影响 SSR分析⋯利用聚
丙烯酰胺凝胶电泳提高分辨率，SSR技术分辨率高，误差小，分析结果更为可靠，本实验采用 RAPD与 SSR
相结合技术，这为今后应用于野生大豆种群间的研究奠定了基础。关于小种群的遗传分化问题，国内外应用
O O ● 5 5 5 ● 2 5 2 4 4 ● 3 7 2 5 4 6 6 8 3 ● 7 8 ● O 2 5 38 6 9 8 7 6 9 9 6 8 9 8 5
●
O O O O O O O O O O O O O O O d
2 3 4 5 6 O ● L ● 2 3 4 5 9 ● ● ● l l 6 8 ● l 7 I
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第 4期 周晓馥等：利用 RAPD与 SSR技术进行野生大豆种群内分化的研究 9
同工酶、等位酶技术对多种植物进行大量种间、种内变异的研究 。 ，表明了各样本的生化遗传结构与环境
之间不存在显著的相关性。本研究采用 RAPD技术对 25。N野生大豆种群内样本进行分子标记，进一步探
讨了野生大豆种群内高度遗传多态性。根据“复等位基因以0．01以上频率共存”的遗传多态定义看，则种群
多态位点的比例为0．3350，这一结果符合 Ayala F．J． 的判断，即对大部分有机体而言 1个群体多态位点
比率为 20％～50％间，此结果略低于 Chiang Y．C．[6 3的分析结果，造成这一差异的原因可能是本研究系小
范围内种群 ，但从中仍可看到25。N野生大豆小种群内存在的大量遗传分化。25。N野生大豆种群的平均遗
传距离为 0．221，平均相似系数为0．779，这说明在 DNA水平上供试样本的多态性并不丰富，这符合 自交群
体的特点 ，与野生大豆在自然条件下只有 0．1％左右的异花授粉率一致，说明野生大豆在 自然条件下是 自
交，同时也证明本研究数据的可信性。种群是进化的基本单位 ，种群内高度遗传分化为生态型的形成提供
了丰富的物质基础。核心种质是以最小的资源数量，最大程度的代表整个资源的多样性，因此对资源多样性
的正确评价是核心种质构建的基础。以表型的变异评价资源的多样性虽简单易行，但有些性状尤其是产量
性状易受环境的影响；同工酶位点数较少，基因表达也有时空性。RAPD和 SSR标记克服了形态和同工酶
标记的缺点，可计算不同基因在不同群体中出现的频率以估计不同群体乃至整个特种的基因多样性，且可了
解不同群体及整个物种在所检测的位点上总的等位基因数及基因型数，本研究利用此技术进行研究结果表
明，野生大豆小种群内存在高度的遗传变异，确定野生大豆种群的群体遗传结构及其变异程度，可制定合理
的取样保存方案，同时为大豆基因组的遗传作图和基因定位、基因克隆等奠定了理论基础。
参 考 文 献
胡志昂，王洪新．北京地区野生大豆天然群体遗传结构．植物学报，1985，27(6)：599～604
李 军等．同工酶水平上野生大豆种群内分化的研究．植物学报，1995，37(9)：669～676
庄炳昌，惠东威等．中国不同纬度进化类型大豆的 RAPD分析．科学通报 ，1994，39(23)：2178～2180
庄炳昌主编．中国野生大豆生物学研究．北京：科学出版社，1999．88～89
Ayala F．J．现代遗传学．长沙：湖南科学技术出版社，1987．704～890
Chiang Y．C．Genetic and quantitative variation in wild soybean populations．Dissertation Abstracts International，1985，47：490
Ramaparkhe M ．B．，et a1．Genetic fingerprinting of pigeonea and its wild relatives using RAPD markers．Theoretical and Applied Genetics，
1995。91：893～898
Skroch P．，et a1．Impact of scoring error and reproduciblity of RAPD data on RAPD besed estimates of genetic distance．Theoretical and Ap—
p1ied Genetics，1995，91：1086～1091
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