全 文 ：第 13卷 第 3期
2 0 0 5年 7月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
V0I．13 NO．3
July， 2005
DGGE法与常规培养法对稻田蓝细菌多态性分析结果比较*
宋铁英 林智敏 郑伟文 L0TTA Martens0n ULLA Rusmusen
(福建省农业科学院生物技术 中心 福州 350003)(瑞典斯德哥尔摩大学植物系 斯德哥尔摩 )
摘 要 研究运用蓝细菌和硅 藻 16S rDNA特异引物，将晚季水稻生长后期稻 田土壤 中提取 的总 DNA进行 PCR
扩增后，以 DGGE技术对 PCR产物进行分析结果表明，14条 DGGE带经克 隆测序，经 NCBI基 因库比对得晚季水
稻生长后期存在 10种蓝细菌，包括 4种 Leptol3mgbya、1种 Chamaesiphon、1种 Nost~、1种 Oscillatoria、2种 S3me—
chococcus和 1种 Chroococcidiopsis。 同层不同位置土壤 中蓝细菌种群亦有所不同，但每个取样点都有一些特有的蓝
细菌种类。用常规方法对 同一稻田土壤样 品进行分离培养 ，根据蓝细菌鉴定 图谱观察到类似 L3mgbya、Oscillatori—
a、Chroococcidiopsis及Nostoc的蓝细菌，但显微镜下无法准确分类。比较结果表 明采用 DGGE法比常规培养法能更
准确进行蓝细菌多态性鉴定。
关键词 稻田 蓝细菌 DGGE技术
Analysis on the species diversity of cyanobacteria in paddy field by comparison between normal culture and DGGE
method．SONG Tie—Ying，LIN Zhi—Min，ZHENG Wei—Wen(Biotechnology Center，Fujian Academy of Agricultural Sci—
ences，Fuzhou 350003，China)，LOTTA Martensson，ULLA Rusmussen(Department of Botany，Stockholm University，
Sweden)，CJEA，2005，13(3)：140～143
Abstract Segments of 1 6S rDNA genes from cyanobacteria were retrieved from paddy field samples by DNA extraction
and polymerase chain reaction(PCR)，and subsequently analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)．The
cyanobacterial community was analyzed in the rice paddy field by nested PCR using universal 1 6S rDNA primers and sub—
sequently primers targeting cyanobacterial specific regions in the 1 6S rDNA genes．The amplified products were analyzed
by denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)．14 dominating bands were excised from the gels and further se—
quenced and determined by BLAST search against the GenBank database．10 bands were identified as cyanobacteria，repre—
senting 6 different cyanobacerial genera．4 of the bands were identified as belonging tO the genus Leptolyngbya，1 tO the
genus Nostoc，2 tO the genus Synechococcus，and 1 tO each of the genera Oscilatoria，Chroococcidiopsis and Chamaeaiphon，
respectively．The cyanobacterial diversity varied both in the upper and the deeper soil fractions and different sampling
points．Lyngbya，Oscilatoria，Chroococcidiopsis and Nostoc were identified under microscope by normal culture method，
but can not be identified exactly，indicated that DGGE method can reflect the complex and dynamic of cyanobacteria in the
com munity．
Key words Paddy field，Cyanobacteria，DGGE technology
(Received NOV．12，2004；revised De c．1，2004)
采用传统分析方法诸研究已证实稻田中栖息着多处蓝细菌群落 ~3，5 J，近年来变性梯度凝胶电泳技术
(DGGE)已更多地应用于蓝细菌遗传多态性方面研究。Rasmussen U．等 J对从根乃拉草 中分离培养的 10
株蓝细菌进行 DGGE检测结果表明，培养后的 10株蓝细菌具有高度分子多态性。Ntibel U． 应用 DGGE
技术对不同盐浓度下蓝细菌及硅藻培养物 的测定结果证 明，不 同盐浓度培养 的蓝细菌及硅藻种类不 同。
Eler G．等Is J将水 田土壤风干、粉碎过筛后 ，在人工光照、水肥和湿度条件下种植水稻，并应用 DGGE技术分
析研究水稻生长周期甲烷氧化菌的动态变化和种群结构。但有关应用 DGGE法对稻 田蓝细菌多态性 的分
析研究 目前尚未见报道。本研究通过提取稻 田土壤总 DNA，并用蓝细菌特异的 16S rDNA引物进行扩增
后 ，应用 DGGE法对扩增产物进行 DNA遗传多态性分析 ，较准确地表达了稻 田蓝细菌各 时期 的遗传多
态性。
瑞典 SIDA项 目“蓝细菌固氮在持续水稻产量中的意义”资助
收稿 日期 ：2004·11-12 改回日期：2004·12·01
第 3期 宋铁英等：DGGE法与常规培养法对稻田蓝细菌多态性分析结果比较 141
l 试验材料与方法
试验在福建省农业科学院稻麦研究所稻 田进行，试验地面积 22．5m×25m，2001年晚季水稻生长后期
(10月 10日)按米字型在稻 田四角和中间各取约 400g土样 ，充分混匀置牛皮纸上凉干后于福建省农业科学
院土壤肥料研究所化验室检测土壤 pH、有机质、全 N、全 P、全 K、碱解氮、有效磷 、速效钾及重金属元素 Cd、
Pb、As和 Hg含量。稻田蓝细菌常规调查在同一地块四角和中心 5个取样点取样。土壤样品分别取 自各点
0～5cm土层 ，取 0．5g土样溶于 4．5mL HB111(含 N 40mg／kg)培养液中，混匀后进行 4级 10倍对数稀释，
稀释液直接在试管中光照培养，蓝细菌菌落长出后用同样培养基挑取单菌落纯化，并在显微镜下观察蓝细
菌种类。DGGE法对稻田蓝细菌多态性分析取样地点与常规稻 田蓝细菌调查样品取样点相 同，分别取各点
0～5cm土层及 10～15cm土层土壤样品各 5g，冷藏带回实验室进行样品的DNA提取。样品总 DNA提取按
Zhou J．等 ]方法，DNA纯化按 Stach J．E．M．等_1 0_方法进行。纯化样品按宋铁英等_4 J方法进行套式 PCR
扩增和 DGGE分析。
2 结果与分析
经检测试验田晚季水稻收割后稻田土壤呈偏酸性，pH5．93，有机质含量 49．08g／kg，全 N 3．38g／kg，全
P 0．27g／kg，全 K 23．68g／kg，碱解氮 251．09mg／kg，速效磷 50．8mg／kg，速效钾 119．65mg／kg。参考土壤
农化分析手册中我国主要土壤类型养分含量变幅表数值 ，试验 田有机质及 N、P、K含量均属正常值范围。
稻田土壤重金属含量 Hg为 0．274mg／kg，Cd为 1．718mg／kg，Pb为 78．61mg／kg，As为 2．18mg／kg，根据我
国颁布的土壤环 境质量标准 (GB15618—1995)，自然 土壤 中重 金属 含量 应 Hg≤0．15mg／kg，Cd≤0．20
mg／kg，Pb≤35mg／kg，As≤15mg／kg，试验稻 田Cd已超标 7．59倍 ，Pb超标 1．25倍 ，Hg超标 0．83倍 ，表明
试验稻田已受 Cd、Pb和 Hg污染。用常规方法将同一稻田土壤样品的蓝细菌进行分离培养后 ，显微镜下观
察并对照蓝细菌图谱 ，观察到类似 Lyngbya、Oscilatoria、Chroococcidiopsis及 Nostoc的蓝细菌及硅藻，但无法
在显微镜下准确分类。该结果表明用常规法分离鉴定蓝细菌需深厚 的蓝细菌分类学实验经验，且与分离培
养条件密切相关。
将稻田土样用 DGGE法分析得到 DGGE图谱见图 1。DGGE图谱中不同带型表示表土和底层土 中分
别存在不同种类的蓝细菌，每 1条带分别显示 1种蓝细菌种类。因本实验所用 16S rDNA引物 CyA359F、
CyA781R(a)和CyA781R(b)[1]特异于蓝细菌且能扩增出硅藻及植物质粒，将上述图谱中的条带分别切下
并克隆后，通过基因序列比对 ，得知试验稻 田中生长的蓝细菌有 4种 Leptolyngbya、1种 Chamaesiphon、1种
Nostoc、1种 Oscilatoria、2种 Synechococcus和 1种 Chroococcidiopsis，条带 a与硅藻 Haslea wawrikae的基因
最相似，而条带 A、B、C则为质粒 DNA(见表 1)。由图 1可知一些蓝细菌种群生长在稻田不同位置和深度，
如 I号条带代表的 Leptolyngbya和 2号条带代表的 Chamaesiphon蓝细菌为优势种类 ，表层土壤优势菌群如
表面土壤
图 1 稻田蓝细菌多态性的 DGGE图谱
．
1 DGGE band patterns after DNA amplifcation from paddy field
*图中 a-$，b-s，C．S，d．S和 e-S分别为 5个取样点的表面土壤样品，
a-d，b-d，C．d，d．d和 e-d分别为 5个取样点的深层土壤样品。
表1 16S rDNA扩增片段经DGGE分离后各条带的基因相似性比较
Tab．I Sequ∞ce similarities of 16S rDNA fragments excised by DGGE
1 Leptolyngbya
2 Chamaesiphon(管胞藻属)
3 Oscilatoria(颤 藻 属)
4 Nostoc(念 珠 藻 属)
5 Synechococcus(聚胞藻属)
6 Synechococcus(聚胞藻属)
7 01∞∞0cdd 萄s(聚球藻属)
8 Leptolyngbya
9 Leptolyngbya
10 Leptolyngbya
a Haslea wawrikae(硅藻属)
A Solarium chloroplast
B Solanum chloroplast
C Physcomitrela chloroplast
蓝细菌
蓝细菌
蓝细菌
蓝细菌
蓝细菌
蓝细菌
蓝细菌
蓝细菌
蓝细菌
蓝细菌
硅 藻
质 粒
质 粒
质 粒
桶 55398
AY170472
桶 17508
s06238
448074
448074
AJ344557
桶 17507
桶 17507
桶 55398
西s14855
CPY18934
CPY18934
APo05672
∞ ∞
曼■ 纂 蕺 番 鹜一
曼■■■■■露曩 ■
142 中 国 生 态 农 业 学 报 第 13卷
9号条带代表另 1种 Leptolyngbya，但深层土壤较少出现，且同一土层不同位置土壤蓝细菌种群亦有所不同，
如 a—S，b—S，c—S，d—S和 e—S均为稻田不同位置表面土壤 ，但每一取样点均有一些特有的蓝细菌种类 ，如 b—S点的
条带 10(Leptolyngbya)，c—S点的条带 5(Synechococcus)、条带 6(Synechococcus)和条带 7(Chroococcidiopsis)，
d．S点的条带 3(Oscilatoria)，深层土壤 中 c—d点 的条带 8(Leptolyngbya)，e—d点 的条带 4(Nostoc)等。将
DGGE法与常规分离法对稻田蓝细菌种类调查及相关结果l1,5,12-¨ J综合比较见表 2。用常规法分析稻田蓝
细菌多态性的 5篇相关文章中，蓝细菌分离贯穿整个水稻生长季节 ，且取样为整个地区稻 田，试验亦显示不
同时期蓝细菌的优势菌群有所变化。有些研究检测到 Nostoc(念珠藻属)、Oscilatoria(颤藻属)、Phormidium
(席藻属)、Anabaena(鱼腥藻属)、Cylindrospermum(筒胞藻属)和 Lyngbya(鞘颤藻属)在稻田生长。本研究用
常规法和 DGGE分析法亦检测到 Nostoc(念珠藻属)、Oscilatoria(颤藻属 )和 Lyngbya(鞘颤藻属 )，但通过
DGGE法检测到的 Leptolyngbya、Synechococcus(聚胞 藻属)、Chamaesiphon(管胞藻属)和 Chroococcidiopsis
(聚球藻属)则常规检测未出现。与其他研究结果相比常规检测中出现频率很高的 Ana-baena、Phormidium、
Cylindrospermum及 Tolypothrix、Pseudanabaena、Gloeocapsa、Aphanocapsa、Gloeothece、Scytonema和 Nodularia
未见于本实验常规检测和 DGGE检测结果中。其原因一是常规分析法需深厚的蓝细菌分类学实验经验，有
些蓝细菌如 Leptolyngbya和 Lyngbya，Nostoc和 Anabaena在外形上十分相似，用形态学方法容易混淆 ；二是
常规分析法需依靠对稻田蓝细菌分离纯化培养后鉴定，样品采集、分离和培养条件决定蓝细菌分离种类，但
前人研究表明样品中仅<1％的微生物可经实验室培养成功l_6 ；三是蓝细菌的多态性受环境 因素影响而有
所变化 ，各试验田气候环境 、取样时间及稻田土壤化学成分不同，蓝细菌多态性亦有所不同。且本试验田位
于车行道旁边，人为活动如采矿、金属冶炼、施用污泥、污水灌溉及汽车尾气污染等导致试验稻田重金属 CA、
Pb和 Hg含量超标 ，该因素也可能是导致本试验田蓝细菌种类明显不同于其他田块的原因。
表 2 DGGE法与常规分离法对稻田蓝细菌种类调查结果比较
Tab．2 Comparison of cyanobacteria types in paddy field with DGGE method and normal method
Nostoc ( 念 珠 藻 属 ) √ √
Osci|atoria (颤 藻 属 ) √ √
Chroococcidiopsis(聚球藻属) √ √
Synechococcus(聚 胞藻 属 ) √
Chamaesiphon(管 胞 藻 属 ) √
Leptolyngbya √
Phormidium (席 藻 属 )
Anabaena(鱼 腥 藻 属 )
Cyhndrospermum(筒胞藻属)
Lyngbya(鞘 颤 藻 属 ) √
Tolypothrix ( 单 歧 藻 )
Microcoleus(微 鞘 藻 属 )
Gloeocapsa(胶 球 藻 属 )
Aphanocapsa(隐 球 藻 属 )
Pseudanabaena(假鱼腥藻属 )
Gtoeotheee(粘 杆 藻 属 )
Scytonema(双 歧 藻 属 )
Nodularia(节 球 藻 属 )
CMothrix ( 眉 藻 属 )
Fisherella(飞 氏 藻 属 )
Plectonema(织 线 藻 属 )
Porphyrosiphon
Limnothrix
Synechosystis(集 胞 藻 属 )
Microcystis( 微 囊 藻 )
Chroococcus(色 球 藻 属 )
Myxosarcina(粘八叠蓝菌属)
Schizothfix(裂 须 藻 属 )
√
√
√
√
*表中√表示该种蓝细菌在调查中出现。
3 小 结
通过 DGGE法检测稻田蓝细菌的多态性不需分离、培养 ，且将分离的 DNA条带直接通过基因比对鉴定
蓝细菌种类，可避免因纯化、培养以及人为经验判断等因素造成的误差，能更准确地判定蓝细菌的多态性。
第 3期 宋铁英等 ：DGGE法与常规培养法对稻 田蓝细菌多态性分析结果比较 143
参 考 文 献
1 董俊德 ，商树 田，苏宝林．北京地区稻 田固氮蓝藻研究 ：I．固氮蓝藻种类与群落演替．北京农业大学学报，1994，20(1)：15～20
2 黄维淦 ．热带水田中与氮素循环有关的微生物区系．Soil Science and Plant Nutrition，1979，25(3)：297～308
3 莫文英 ，贾小明，钱泽澍．有机肥对水稻根际固氮活性的影响．浙江农业大学学报 ，1985，11(3)：331～335
4 宋铁英 ，包晓东，郑伟文等．DGGE法检测稻田蓝细菌及硅藻 的遗传多态性 ．厦门大学学报 ，2002，41(5)：669～673
5 Quesada A．，Fernandez—Valiente E．Relationship between abundance of N2一fixing cyanobacteria and environmental features of spanish rice
fields．Microbio1．Eco1．，1996，32：59～71
6 Rasmussen U．，Sc venning M ．M ．Characterization by genotypic methods of symbiotic Nostoc strains isolated from five species of Gunnera．
Arch．Microbio1．，2001，176(3)：204～210
7 Ni~bel U．，Garcia—Pichel F．，Muyzer G．PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria．App1．Environ．Microbio1．，1997，63(8)：
3327～3332
8 Eller G．，Frenzel P．Changes in activity and community structure of Methane—Oxidizing Bacteria over the growth period of rice．App1．Environ．
Microbio1．，2001，67(6)：2395～2403
9 Zhou J．，BrunsM ．A．，Tiemdje J．M．DNA recoveryfrom soils of diverse composition．App1．Environ．Microbio1．，1996，62(2)：316～322
10 Stach J．E．M ．，Bathe S．，Clapp J．P．，et a1．PCR‘SSCP comparison of16S rRNA sequence diversityinsoilDNA obtained using diferentisola-
tion an d purification method s．FEMS Microbio1．Eco1．，2001，36：139～ 151
11 Nobel U．，Garcia—Picbel F．，Muyzer G．PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria．App1．Environ．Microbio1．，1997，63(8)：
3327～ 3332
12 Khan Z．U．M ．，Tahmida Begum Z．M．，Mandal M ．，et a1．Cyanobacteria in rice soils．World J．Microbio1．Biotech．，1994，10：296～298
13 Irisarri P．，GonnetS．，Monza J．CyanobacteriainUruguayan ricefield：diversity，nitrogenfixing abilityandtoleranceto herbicides and combined
nitrogen．Journal of Biotechnology，2001，91：95～103
14 Tiwari0．N．，DharD．W ．，PrasannaR．，et a1．Growth and nitrogenfixation by non—heterocystousfilament cyanobacteria of ricefields ofUttar
Pradesh，India．Philippine J．Science，2000，129：101～107
欢 迎 订 阅 2005年《中国农 业 资 源环 境 文 摘》
<中国农业资源环境文摘>(原名《中国农业文摘—— 土壤肥料》)于 1985年创刊，收录了全 国 200余种农业科技期刊中关
于土壤学、肥料学、植物营养学和生态环境科学方面的文献，是本学科专业核心期刊评价的指标刊物，也是我国本学科唯一文
献检索刊物 。2003年始《中国农业文摘—— 土壤肥料》更名为《中国农业资源环境 文摘》，原办刊宗 旨与发行范围不变 。报道
内容包含原《中国农业文摘——土壤肥料》报道范围，侧重于报道生态农业 、环境科学、资源可持续 利用 以及学科之间交叉领
域的新理论 、新技术和新方法 ，为广大土壤科学 、资源与环境科学科技工作者服务 ，促进学术交流 ，推动学科发展 。本 刊为双
月刊，16开本 ，刊号：CN 1l_4920／S，ISSN 1002—543X。邮发代号 ：18—124，每期定 价：10．00元 ／册 ，全年 60．00元 ，国内外公开
发行 ，全国各地邮局均可订阅，漏订者可直接向编辑部补订。地址 ：(100081)北京市中关村南大街 12号 中国农业科学院科技
文献信息中心《中国农业资源环境文摘》编辑部，电话：(010)68919886转 2313。