全 文 ：2001-11-12收稿 , 2001-12-11修回。
* 上海市教委资助重点课题 ( 98zd33)。
* * 　上海市医药工业研究院毒理研究室 , 200437 ( Sector o f Toxicology ,
Shanghai Instit ute of M edical Indust ry , Shanghai, 200437) .
* * * 　上海第二医科大学化学教研室 , 200025 ( Dept. of Chemist ry ,
Univ ersi tatis Medicinalis Secondae Shanghai, Shanghai, 200025) .
广西科学 Guangxi Sciences 2002, 9 ( 1): 53～ 56
木芙蓉叶有效组分致突变与急性毒性实验研究*
Experimental Assessment on Mutagenicity and Acute
Toxicity of the Effective Fraction
of Leaves of Hibiscus mutabilis L.
　　 　符诗聪　 　张慧娟* * 　　马　景* * 　姚莉韵* * * 　张凤华　　　杜　宁　　　
Fu Shicong　 Zhang Huijuan　 Ma Jing　 Yao Liyun　 Zhang Fenghua　 Du Ning
(上海第二医科大学附属瑞金医院伤科　上海市瑞金二路 197号　 200025)
( Depatment of Traumatology , Ruijin Hospital, Univ ersi tatis Medicinalis Secondae
Shanghai, 197 Ruijin Erlu, Shanghai, 200025, China)
摘要　为评价木芙蓉 ( Hibiscus mutabilis L. ) ( M FR) 叶有效组分 (提取物 )的致基因突变和急性毒性作用 , 根
据 《新药 (中药 ) 临床前研究指导原则汇编》 的设计要求对 M FR叶有效组分进行致突变试验 ( Ames试验 ) 与
急性毒性试验。 Ames试验在有和无代谢活化系统两平行条件下进行。 对 20只小鼠以生药 0. 5 g /ml浓度的
MFR叶有效组分给小鼠灌胃 , 灌胃量为 0. 8 ml /20 g , 服药后 , 以 LD50判断急性毒性。 Am es试验最高剂量为
5 000微克 /皿 , 最低剂量为 0. 5微克 /皿 ; 无论 S9存在与否 , 均无致突变作用。小鼠灌胃 M FR叶有效组分 , 剂
量相当于生药 312. 4 g /kg, 为动物有效剂量的 150倍 , 未见毒性反应。表明 , M FR叶有效组分是低毒、 安全的
中药制剂 , 可以进一步开发用于临床。
关键词　木芙蓉 ( Hibiscus mutabilis L. ) 　叶　有效组分　基因突变性　急性毒性
中图法分类号　 Q949. 757. 3; R965. 3
Abstract　 To investigate the potential mutagenicity of the effectiv e f raction ( ex t ract) of leaves of
Hibiscus mutabil is L. ( M FR) , Ames test and acute toxicity test on M FR are conducted under the
test design instruction of Collect ion of Guidelines f or Preclinical Investigation of Novel Medicine.
Ames test is carried out under two parallel conditions with and wi thout metabolism activ ating
system. Tw enty mice are o rally administrated with 0. 5 g /ml of the ef fectiv e fraction of M FR
leaves, and the dosage for mouse is 0. 8 ml /20 g w eight. The toxici ty is assessed by the mortali ty of
mice in LD50 . In Ames test, the highest dosage is 5 000μg /dish , whi le the lowest 0. 5μg /dish. No
mutagenicity is observ ed wi th or wi thout S9. The amount of ef fective f raction of M FR leaves giv en
to mice is equal to 312. 4 g /kg , which is the 150-fold the ef fectiv e dosage. It is suggested that the
ef fectiv e f raction of M FR leaves is a safe Chinese herb preparation, and w orth further developing for
clinical application.
Key words　 Hibiscus mutabil is L. , leav e, ef fectiv e fraction , g ene mutagenicity , acute toxicity
　　木芙蓉 ( Hibisus mutabilis L. ) ( M FR) , 又称拒 霜花 , 为锦葵科木槿属植物 , 以花、 叶和根入药。文
献记载该药外用和口服有很好的抗炎和消炎作用 ,可
以治疗阑尾炎、腮腺炎 ,也可以治疗痛风性关节炎和
丹毒 ,灼伤等疾病 [1 ]。《医宗金鉴·正骨心法要旨》中
以木芙蓉叶为主药有芙蓉膏、 定痛膏 , 治疗外伤肿
痛 [ 2]。现代药理实验证实 ,木芙蓉叶可以消除巴豆油
诱发的耳部水肿 ;对大鼠角叉菜胶性足肿胀及小鼠腹
腔毛细血管通透性均有明显的抑制作用 ,并且是无毒
53广西科学　 2002年 2月　第 9卷第 1期
DOI : 10. 13656 /j . cnki . gxkx . 2002. 01. 017
的中药 [3 ]。 上海第二医科大学瑞金医院伤科自 1997
年开始 [4, 5] , 对 MFR进行有效组分的提取和采用单
盲法 (做药效时 , 提取单位不提供有关的提取资料 )
进行药效学筛选 , 最终确定了 M FR的有效组分。本
研究旨在为开发具有我国自主知识产权中药抗炎新
药安全性提供理论依据。
1　致突变试验 ( Ames试验 )
　　参照文献 [6, 7] 的方法。
1. 1　材料与方法
1. 1. 1　药品与试剂: 木芙蓉叶有效组分: 上海第二
医科大学化学教研室提供 (批号: 000626) ; 浓度: 有
效组分 (总黄酮 ) 7. 3 mg /m l, 每 1 ml相当于 1. 07g
生 药。 菌 株: 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 (Salmonella
typhimurium ) TA97、 TA98、 TA100和 TA102四株
试 验菌 , 美 国加 利福 尼亚 大学 伯 克利 分校
Bruce. N. Ames教授赠送 , 保存于液氮中。 9-氨基吖
啶: 上海试剂总厂三分厂产品 , (批号: 1708) ; 2-氨
基芴: Aldrich公司产品 , (批号: 215473) ; 柔毛霉素:
意大利爱宝大药厂产品 , (批号: 4013DA) ; 甲基磺酸
甲酯: M erck公司产品 , (批号: 8250895) ; 1, 8-二
羟蒽醌: 上海化学试剂公司进口分装 , (批号: 98-04-
15) ; 叠氮钠: 上海医药工业研究院药物合成研究室
提供 ; 辅酶Ⅱ : 上海丽珠东风生物技术有限公司提供
(批号: 2007) ; G-6-P: 中科院上海生化所东风生化
技术公司 , (批号: 5108) ; 注射用水: 上海信谊药厂
产品: (批号: 000708) ; 无水乙醇: 上海振兴化工一
厂 , (批号: 9811305) ; 吐温-80: 上海化学试剂公司:
(批号: F 990622)。
1. 1. 2　药液配制方法: 用注射用水将木芙蓉叶有效
组分配制成 50 mg /ml,再按 1∶ 10稀释 ,获得 5个等
比浓度溶液 ,每个溶液各取 0. 1 ml药液 , 分别置于 5
个平皿中 , 终剂量分别为 5 000、 500、 50、 5和 0. 5
微克 /皿。
1. 1. 3　阳性对照: 　 - S9　　　　　+ S9
　　　　　 T A97: 9-氨基吖啶　　 2-氨基芴
　　　　　 T A98: 柔毛霉素　　　2-氨基芴
　　　　　 T A100: 叠氮钠　　　　2-氨基芴
　　　　　 T A102: 甲基磺酸甲酯　1, 8-二羟蒽醌
1. 1. 4　阴性对照: 　 - S9　　　　　+ S9
　　　　　　　　 注射用水　　 含 S9的混合液
1. 2　菌株鉴定
1. 2. 1　组氨酸营养缺陷型: 只能在含有组氨酸的培
养基上生长。
1. 2. 2　脂多糖屏障缺失 ( rfa): 用浸湿菌液的滤纸条
印影在全营养培养基上 ,将浸湿结晶紫水溶液的纸条
交叉放置其上 , 经 37℃培养 12～ 24 h后 , 在结晶紫
滤纸条交叉处出现杀 (抑 ) 菌带。
1. 2. 3　紫外线修复缺失 (△ uv rB): 用浸湿菌液的滤
纸条印影在全营养培养基上 , 用黑纸盖住平板的一
半 , 置 15W紫外灯下距离紫外灯 33 cm处照射 (有
R因子的菌株照射 8 s,无 R因子的菌株照射 6 s) ,经
37℃培养 12～ 24 h, △ uv rB经照射后不生长。
1. 2. 4　 R因子: TA97、 T A98和 TA100带有
pKM 101质粒。 T A102带有 pKM101质粒和 pAQ1
质粒。
1. 2. 5　 pKM 101质粒的鉴定: 用浸湿菌液的滤纸条
印影在全营养培养基上 ,将浸湿氨苄青霉素溶液的滤
纸条交叉放置其上 , 经 37℃培养 12～ 24 h后 , 带
pKM 101质粒的菌株在氨苄青霉素滤纸条交叉处无
杀 (抑 ) 菌带。
1. 2. 6　 pAQ1质粒的鉴定: 用浸湿菌液的滤纸条印
影在全营养培养基上 ,将浸湿四环素溶液的滤纸条交
叉放置其上 , 经 37℃培养 12～ 24 h后 , 带 pAQ1质
粒的菌株在四环素滤纸条交叉处无杀 (抑 )菌带。对
已知诱变剂 (阳性对照 ) 呈阳性反应。
1. 3　剂量
　　剂量设置依据:按我国新药毒理学研究指导原则
要求 ,最高剂量应为 5毫克 /皿 ,根据预试验结果 ,最
高剂量可达 5毫克 /皿 , 以下再设 500、 50、 5和 0. 5
微克 /皿 , 共 5个剂量级。
1. 4　哺乳动物肝微粒体酶激活系统
　　肝微粒体酶系的诱导和制备: SD雄性大鼠 ,体重
180～ 200 g ,由腹腔注射 Aroclor1254 500 mg /kg (用
玉米油按需稀释 Aroclor1254) 诱导后第 5天断头放
血 , 在 4℃无菌条件下解剖大鼠取出肝脏制成匀浆 ,
9 000 g离心 10 min, 取其上清液。
　　 S9混合液的配制: 每 10 ml混合液含 S9 2 ml,辅
酶Ⅱ 29. 7 mg, 葡萄糖-6-磷酸钠 15. 2 mg, 加灭菌水
至 10 m l。
　　 S9活性检查: 对间接诱变剂 2-氨基芴有良好的
激活能力。
　　 S9蛋白含量测定: 经 Low ry法测得蛋白含量为
31. 6 mg /m l。
　　 S9经 37℃ , 48 h培养 , 无菌试验合格。
　　 S9分装后储存于液氮中备用。
1. 5　试验方法
　　实验分为加和不加代谢激活系统 S9两组平行试
验。采用标准平皿掺入法。将盛有 2 ml上层琼脂的试
管于 48℃水浴中保温 ,待底层琼脂冷却凝固后 ,每支
54 Guangxi Sciences, Vol. 9 No. 1, Februar y 2002
试管依次加入 0. 1 ml受试液 (自然回复即阴性对照
组加 0. 1 ml注射用水 ) , 0. 3 m l S9混合液 (+ S9
组 ) 或 0. 3 ml磷酸缓冲液 ( - S9组 )和 0. 1 ml菌液
(约 107 )。摇匀 , 倒入底层琼脂平皿上 , 并铺平 , 置
37℃培养 48 h。取出后计数菌落 ,每浓度做 3个平皿。
每株试验菌均有 1组 (± S9) 已知诱变剂 (阳性对
照 ) , 以证明该菌株的突变特性。在计数菌落前用显
微镜观察背景 ,了解有无抑菌现象。各浓度组出现的
菌落数与试验菌的自然回复菌落数比较 ,不到 2倍作
为阴性 , 2倍以上为阳性。
2　急性毒性试验
　　参照文献 [8 ]的方法。
2. 1　药品与试剂
木芙蓉叶有效组分由上海第二医科大学化学教
研室提供 (批号: 000626)。含量: 有效组分 (总黄
酮 ) 7. 3 mg /m l ( 1 mg相当于生药 1. 07 g ) ; 性状: 棕
色水溶液。赋性剂: 含 2. 12%土温 -80的水溶液。
2. 2　实验动物
　　昆明种小鼠 , 体重 20± 2g, 4～ 5周龄 ; 雌雄各
半 , 各 20只 , 由上海市医药工业研究院实验动物房
提供 , 合格证号: 沪医药 (质 ) 字第 010号。
2. 3　剂量设置
2. 3. 1　分组: ( 1)受试物组。有效组分 292. 0 mg /kg
体重 , 相当于生药 312. 4 g /kg体重。 ( 2) 对照组。
2. 12%土温 -80的水溶液 0. 8 ml。
2. 3. 2　剂量设置依据: 木芙蓉叶有效组分临床拟用
量生药 15克 /人·天 - 1 ,即 0. 21 g /kg· d- 1 (按 70 kg
计 ) ; 小鼠有效剂量生药 2. 1 g /kg , 本试验剂量设置
为动物有效剂量的 150倍。
2. 3. 3　给药容量: 每只小鼠给药容量为 0. 8 ml /20 g
体重。
2. 3. 4　给药途径: 灌胃 , 试验前禁食 6 h。
2. 3. 5　观察指标: 观察期为 7 d。主要观察: 死亡情
况 , 尸检和病理组织形态学镜检毒性反应的一般表
现。
3　结果
3. 1　致突变试验结果
　　木芙蓉叶有效组分 Ames试验结果见表 1。表 1
表明 , 各剂量组无论 S9存在与否 , 菌落数均未超过
试验菌自然回复菌落数的 2倍 , 无剂量反应关系。阳
性对照组均出现突变现象。按新药审批办法有关规定
木芙蓉叶有效组分 Ames试验结果为阴性。试验表
明 , 木芙蓉叶有效组分对 S. ty phimurium TA97、
T A98、 TA100和 T A102无致突变作用。
3. 2　急性毒性试验结果
　　受试物组、 赋性剂对照组小鼠给药后活动正常 ,
未见异常反应。试验期间给药组动物饮食正常 , 体重
正常 ,与对照组相比无显著性差异 (见表 2) ,未发现
与药物相关的异常现象。 7 d后 , 采用脱颈椎法处死
存活小鼠 , 尸检各主要脏器均未见病变。试验表明 ,
小鼠单次灌胃给予木芙蓉叶有效组分 , 相当于生药
312. 4 g /kg, 为动物有效剂量的 150倍 , 未见毒性反
应。
表 1　木芙蓉叶有效组分 Ames试验结果*
Tabl e 1　 Ames test of the eff ective f raction of leaves of Hibiscus mutabilis L.
组　别 Group
(微克 /皿 , μg /disk)
TA97 TA98 TA100 TA102
- S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9
M FR 5000 144. 7±12. 2 92. 7± 11. 9 34. 3± 2. 1 36. 7±8. 1 131. 7± 12. 6 140. 3± 17. 2 208. 0± 2. 6 225. 3± 5. 0
M FR 500 145. 3±6. 4 138. 3± 14. 4 24. 0± 1. 7 21. 3±1. 51 145. 3± 8. 3 184. 7± 13. 6 236. 7± 30. 5 242. 3± 23. 6
M FR 50 117. 0±2. 0 121. 7± 2. 9 22. 7± 3. 8 28. 0±1. 0 149. 3± 13. 6 154. 3± 15. 0 237. 7± 6. 0 253. 0± 3. 0
M FR5 120. 0±8. 2 123. 3± 5. 5 22. 3± 3. 5 30. 7±1. 5 135. 0± 13. 2 157. 7± 20. 3 222. 0± 8. 5 222. 0± 18. 4
M FR 0. 5 126. 3±14. 4 124. 3± 11. 9 21. 7± 3. 1 29. 3±2. 1 150. 3± 12. 7 140. 3± 2. 5 217. 7± 8. 6 233. 3± 20. 8
自然回复 Physio-reversion 107. 3±7. 2 137. 3± 12. 9 23. 0± 3. 0 28. 0±6. 1 131. 3± 11. 1 161. 3± 11. 4 221. 0± 16. 5 253. 0± 3. 0
叠氮钠 Sodium azide 2 900
2-氨基芴 2-Amino fluo rene 20 1 312 1 600 1 410
甲基磺酸甲酯
Methyl mesy la te 2
4 640
1, 8-二羟蒽醌 1, 8-altan 760
9-氨基吖啶 9-Acramidi ne 50 1 472
柔毛霉素 Rubida zone 1 503
* 以每浓度组 3个平皿菌落数的平均值 ( x-± s)表示。 * Average ( x-± s) of colonies in three disks of each concentration.
55广西科学　 2002年 2月　第 9卷第 1期
表 2　小鼠口服木芙蓉急性毒性试验中小鼠的体重变化 (x-± s, n= 10)
Tabl e 2　 The weigh t change of the mice administrated orally with the eff ect ive fract ion of leaves of Hibiscus mutabilis L. in the
acute toxicity test ( x-± s , n= 10)
性别 Gender 　时间 Time 对照组 Contro l ( g ) 给药组 Treatment ( g )
雄 Male 给药前 Befor e treatment 17. 66± 0. 44 17. 88± 0. 75*
给药第 7天 The 7th day after trea tment 26. 99± 1. 16 27. 90± 1. 61*
雌 Female 给药前 Befor e treament 17. 98± 0. 95 17. 91± 0. 70*
给药第 7天 The 7th day after trea tment 25. 19± 1. 26 24. 71± 1. 37*
* 与阴性对照组相比 Compared with the control: P > 0. 05。
4　讨论
　　 Ames试验是美国环保局确定的化学物质远期
安全评价组合试验中首选的方法 ,用于检测药物是否
会引起细胞的基因突变。文献报道 , 以细菌致突变试
验方法检测化学物质的可靠性达 85% ～ 95% [ 9] ; 而
急性毒性试验则是观察动物对某一药物的耐受量 ,两
者互补说明该药物的安全性 ,这是开发新药所必不可
缺的内容之一。
　　本实验通过木芙蓉叶有效组分 5个等比浓度的
溶液与另外 6种阳性致突变剂比较 , 各剂量组无论
S9存在与否 , 对各菌株的自然回复菌落数均在正常
范围 (菌落数均未超过试验菌自然回复菌落数的 2
倍 , 无剂量反应关系 ) , 而阳性诱变剂自然回复菌落
数明显超过 2倍 ,阳性对照组均出现突变现象。按新
药审批办法有关规定 ,芙蓉叶有效组分 Ames试验结
果为阴性 ,说明该有效组分是安全的并可以用于进一
步开发的药物。
　　急性毒性试验可以用两种方法来实现 ,一种是半
数致死量 ( LD50 ) ; 另一种是最大耐受量试验 (即安全
限度试验 )。 后者在实验时较前者简便 , 因为最大耐
受量试验方法简单而且可以达到同样的目的 ,加上又
有长期临床应用经验 ,所以本实验采用后法。结果证
明木芙蓉叶有效组分的最大耐受量可以达到人体的
150倍 , 同样也说明木芙蓉叶有效组分是安全的可以
开发的一种药物。
　　致谢
　　作者在完成本文时 ,曾得到上海第二医科大学瑞
金医院伤科史炜镔博士及上海市伤骨科研究所陆葵
助理研究员的帮助 , 在此表示衷心的谢意。
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(责任编辑: 蒋汉明 ) 　　
56 Guangxi Sciences, Vol. 9 No. 1, Februar y 2002