全 文 ：中国生物工程杂志 Ch ina Biotechnology, 2011, 31( 2): 124O129
刺糖多孢菌生产多杀菌素的研究进展
蔡 恒 王 燕 万红贵* 蒋导航 王汉领 赵宗松
(南京工业大学生物与制药工程学院 南京 210009)
摘要 多杀菌素 ( sp inosad)是由放线菌刺糖多孢菌 (Saccharopolyspora spinosa )发酵产生的新型生
物杀虫剂。多杀菌素由于具有生物农药的安全性,化学合成农药的速效性,以及对哺乳动物、昆
虫天敌和环境安全等特点,已在多个国家获准使用。目前我国多杀菌素的研究尚处于实验室阶
段,产量相对较低, 尚不具备工业化生产的条件。对多杀菌素的结构、生物合成途径、发酵培养基
优化、高产菌株的选育及其衍生物等进行了综述。
关键词 多杀菌素 发酵优化 选育 衍生物
中图分类号 Q819
收稿日期: 2010-10-13
通讯作者,电子信箱: hg_wan@ sina. com
多杀菌素 ( sp inosad)是一种具有触杀及摄食毒性
的新型微生物源杀虫剂。因其具有对害虫广谱高效,
对人、非靶标动物和环境极为安全, 可生物降解等优
点,于 1999 年获得美国 /总统绿色化学品挑战奖
( Presidential G reen Chem istry Challenge Award) 0 [1]。
多杀菌素能有效防治多种害虫, 用药量极少, 持效期
长,当浓度为 1mg /L时就能保护谷物至少 4个月 [2] ,被
认为是一种极具前景的 /绿色 0杀虫防护剂。 2005年,
美国 环保局 ( United States Environmental P rotection
Agency)批准将多杀菌素作为储粮防护剂 [3 ]。 2008年,
欧盟批准多杀菌素可在有机作物上使用 [ 4], 多杀菌素
已成为目前国际上最具有发展前景的生物杀虫剂。我
国对多杀菌素的研究还处于实验室阶段,尚无工业化
生产的相关报道。本文对产多杀菌素的发酵培养基优
化,高产菌株选育,多杀菌素的衍生物等方面进行了
阐述。
1 多杀菌素的结构
多杀菌素,又名刺糖菌素, 是由土壤放线菌刺糖多
孢菌 (Saccharopo lyspora sp inosa )发酵产生的次级代谢产
物 [5 ]。 1990年, Boeck等 [6 ]首次从刺糖多孢菌 NRRL-
18395的天然发酵产物中分离得到了多杀菌素组份
sp inosyn A, B, C, D, E, F, H, J和多杀菌素 A拟糖苷
配基,其中多杀菌素 A ( spinosyn A)组份约占 85% ~
90% ,多杀菌素 D( sp inosyn D)组份约占 10 % ~ 15% ,
其余均为次要组分。此后,科研人员又发现了 15种多
杀菌素类化合物 [7-9],分别命名为 sp inosynK, L, M, N,
O, P, Q, R, S, T, U, V, W, Y。
多杀菌素的结构如图 1所示,从结构上看,这些化
合物属于大环内酯类,是由 21碳所组成的一个独特的
四环体系,并分别在 C9位、C17位的羟基上连接着一
个中性糖 A-L鼠李糖 ( L-rhamnose)和一个氨基糖 B-D-
福乐糖胺 ( D- forosam ine) [ 10 ]。多杀菌素主要组分 A与
D的差异在于 C6上的基团,多杀菌素 D上连接的是甲
基,多杀菌素 A上连接的是氢 [11]。
多杀菌素结构中的鼠李糖和福乐糖胺是它具有杀
虫活性所必须的 [12 ]。研究表明,许多次级代谢产物的
生物活性主要取决于它们的糖取代基, 这些取代基通
过糖基转移酶特异性地从活化的核苷酸糖上转移到次
级代谢产物的糖苷配基上。当改变这些酶的结构, 扩
大其底物谱时,往往由于转移的糖发生改变,从而对次
级代谢产物的生物活性产生重要的影响 [ 13 ]。此外,多
杀菌素中的四元环结构也对它的杀虫活性有影响。
Sparks等 [ 14 ]研究发现, 去除福乐糖胺和鼠李糖 2, 4位
上的甲基,或者在环的 C6位添加一个甲基都会轻微降
低其对鳞翅目昆虫的活性;同样,当 C16和 21位上烷
基被更小的烷基所取代或被去除也将使多杀菌素对鳞
翅目昆虫的活性大大降低; 而去除鼠李糖 3位的甲基
DOI：10.13523/j.cb.20110220
2011, 31( 2) 蔡 恒 等: 刺糖多孢菌生产多杀菌素的研究进展
图 1 多杀菌素的结构
F ig. 1 Th e structur e of sp inosad
可以使多杀菌素失去全部的杀虫活性。但是, 并不是
对这些位点所有的改造都会减少其活性,例如环的 5, 6
位的双键被还原时, 不但没有降低多杀菌素对鳞翅目
昆虫的活性,反而扩大了其杀虫谱范围, 使其对棉蚜、
棉红蜘蛛和白粉虱等产生了活性, 而适当延长鼠李糖
3-氧甲基基团的长度也能较大地提高其活性 [15]。因
此,我们可以尝试对多杀菌素环的 6位、16位、21位及
L-鼠李糖和 D-福乐糖胺结构的改造来获得新的衍生
物,以期提高其杀虫活性。
2 多杀菌素的生物合成
多杀菌素与其他大环内酯类抗生素如红霉素、阿
维菌素等相似,结构上都属聚酮类物质, 这类聚酮类物
质的生物合成过程也呈相似的规律。多杀菌素的聚酮
链是由 2~ 3个碳单位的羧酸类前体物质 (如:丙酰辅
酶 A)逐步缩合修饰而成, 聚酮链延伸完成后,在硫酯
酶的催化下环化,再经一系列酶的催化, 在大环内酯核
分子内的 C3-C14、C4-C12及 C7-C11之间形成交联桥,
糖苷配基形成。接着鼠李糖连接到糖苷配基上,连接
完成后对其 2, 3, 4-的羟基进行甲基化形成拟糖苷配
基,这是糖苷配基转换为多杀菌素必须的第一步。而
鼠李糖则是由葡萄糖 -1-磷酸经 NDP-4-酮 -6-脱氧 -D -葡
萄糖合成的。最后由与鼠李糖共同的中间产物 ) ) )
NDP-4-酮 -6-脱氧 -D -葡萄糖经由一系列酶催化生成
NDP-福乐糖胺, NDP-福乐糖胺在福乐糖胺转移酶催化
下连接到拟糖苷配基上,形成了完整的多杀菌素 [ 16 ]。
多杀菌素生物合成的基因大部分成簇存在,排列
在长约 80kb的基因簇中,共涉及到 23个基因。其中 5
个聚酮合成酶基因 ( PKS) 合成大环内酯结构, 4个基
因将大环内酯修饰为糖苷配基, 5个基因合成和添加鼠
李糖, 3个基因使鼠李糖甲基化, 6个基因合成和添加
福乐糖胺 [17]。
3 培养基及发酵工艺优化
目前,我国除了上海医药工业研究院李继安等 [18 ]
通过培养基优化实验, 使多杀菌素的产量达到
1150mg /L,是原有发酵水平的 19倍外, 其他用刺糖多
孢菌发酵生产多杀菌素的研究还处于起步阶段, 发酵
水平不高, 距工业化生产还有很大距离。因此我们要
进一步研究其发酵工艺,通过工艺优化,改进发酵培养
基成份和发酵条件,创造适合菌体生长和生物代谢的
最佳条件, 充分发挥菌种的生产潜力, 显著提高发酵
产量。
优化发酵培养基组成是提高发酵产品产量的首要
步骤。李能威等 [19]利用单因素、多因素和正交实验对
培养基进行优化, 使多杀菌素产量达到 395. 54Lg /m ,l
比对照提高了 62. 5%。此外,葡萄糖和磷酸盐在菌体
生长和次级代谢产物合成中起到重要的限制作用, 并
且在许多抗生素的发酵生产中占据控制地位。 Jin
等 [20 ]研究发现当葡萄糖浓度高于 58. 8g /L和磷酸盐浓
度大于 29. 41mmol /L时会对 S. spinosa菌丝体的生长
和多杀菌素的合成起到抑制作用,由此确定最佳葡萄
糖和磷酸盐浓度分别为 58. 8g /L和 29. 41mmol /L。并
在 5L罐发酵中按此比例添加葡萄糖与磷酸盐的量,使
得多杀菌素的产量提高到 507mg /L,比摇瓶发酵提高了
28%。油作为表面活性剂、营养物质和代谢前体,在大
环内酯类抗生素的发酵生长中起着重要作用 [21]。在多
杀菌素发酵培养基中添加植物油、脂肪酸脂类化合物
或其他前体物质也能提高其产量。胡旭晔等 [ 22 ]研究发
现在发酵 30h后添加浓度为 10mmol /L的正丁醇作为
前体物质在某些酶或酶系作用下参与内酯环的合成,
可以提高发酵单位,使得摇瓶发酵达到 394. 1Lg /m ,l比
优化前提高了 56%。
4 多杀菌素高产菌株的选育
4. 1 菌种特性
刺糖多孢菌 S. spinosa属糖多孢菌属,是一种好氧
型革兰氏阳性的非抗酸性放线菌。它在复合培养基和
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合成培养基上都能生长良好, 形成气生菌丝体。气生
菌丝分隔成以镰刀状和块状排列的孢子链, 孢子链外
观为珠状,有孢子壳,表面为针状。气生菌丝为粉黄
色,营养菌丝为黄色到黄褐色,产浅粉黄色孢子,在某
些培养基上则生成白色孢子。菌体生长温度为 15e ~
37e , 对溶菌酶敏感,在高渗条件下 ( 11 % NaC l)可以
生长 [23]。
4. 2 菌株选育
与其它抗生素产生菌一样, 多杀菌素产生菌的产
素水平主要决定于环境条件和自身的遗传因子两个方
面。改良发酵条件只能在较低水平上提高目的菌株的
产素水平,通过高产菌株育种技术改变菌株的部分遗
传信息,能有效地提高目的菌株的产素水平。
传统的随机诱变是获得多杀菌素高产菌株的一种
有效方法。吴红宇等 [24 ]采用离子束辐照和亚硝基胍
(NTG )诱变相交替的办法,选育得到一突变株, 其发酵
水平较原始菌株提高了 140%。代鹏等 [25 ]研究发现,
采用紫外线、氮离子注入、60Co-C射线等 3种物理诱变
方式对相应的出发菌株都具有不同程度的诱变效果。
其中,氮离子注入表现的正突变株比例最高, 且产素水
平提高幅度大,最适注入剂量为 60 @1013 ions /cm2。经
UV, N+及 C-射线先后复合处理使多杀菌株产素水平发
生显著性改变,得到突变株发酵效价高达 460Lg /m ,l比
出发菌株高 171%。陈继红等 [26 ]利用太空环境的微重
力等诱变条件能使菌株的遗传物质发生改变的原理,
通过 /实践八号0育种卫星对多杀菌素产生菌株进行航
天搭载诱变,经过对诱变后单菌落分离得到的菌株进
行大量的筛选,最终得到发酵效价有较大提高的菌株
HY463和 HY466, 产量分别达到 147. 51Lg /m l和
95. 33Lg /m,l比出发菌株提高了 288%和 151%。
目前随着对多杀菌素生物合成路径及代谢路径研
究的展开,可以通过对生物合成路径中的基因进行基
因工程改造或者对代谢路径中的代谢限制因素进行改
变,以获得多杀菌素高产菌株。Baltz等 [27 ]在美国专利
中提到将刺糖多孢菌中编码多杀菌素合成限制步骤的
有关基因重组到其基因组中,增加限速步骤基因的拷
贝数,有可能增加多杀菌素的产量。Madduri等 [28-29]的
研究证明了这一观点, 多杀菌素上的鼠李糖与细胞壁
的鼠李糖合用一套基因,而 S. sp inosa中每个基因只有
一套,增加鼠李糖路径中基因的拷贝数能使更多的糖
苷配基转化为拟糖苷配基;同样, NDP-4-酮 -6-脱氧 -D -
葡萄糖是鼠李糖和福乐糖胺共同的中间体, 增加福乐
糖胺路径中基因的拷贝数, 可使 90%以上的拟糖苷配
基转化为多杀菌素 A和 D,从而提高多杀菌素的产量。
Jin等 [ 11, 30 ]研究发现多杀菌素这种次级代谢产物如果
在发酵过程中大量积累,将产生反馈抑制作用,不仅对
菌体生长不利,也会抑制多杀菌素的生物合成;鼠李糖
是多杀菌素生物合成中的一个重要前体, 在多杀菌素
的合成中起着限制性的作用; 并且微生物次级代谢产
物的合成受到葡萄糖等速效碳源代谢物的抑制作用。
因此,合理筛选具有多杀菌素抗性、鼠李糖抗性和 2-脱
氧 -D-葡萄糖抗性的突变株,能消除多杀菌素自身的反
馈抑制、为多杀菌素的生物合成提供更多的鼠李糖及
解除由速效碳源代谢物引起的抑制作用, 从而提高产
量。通过筛选得到突变株的产量达到 268mg /L,比母本
菌株增加了 121%。并且他们通过 4轮基因重组成功
获得一个高产菌株 S. sp inosa 4-7,其产量达到 547mg /L,
比最好的母本菌株和原始菌株分别提高 200. 55%和
436. 27%。 Liang等 [ 31 ]研究发现鼠李糖和丙酸盐是多
杀菌素生物合成中的重要前体物质,并在多杀菌素的
生物合成中起着关键作用。据此通过紫外线诱变筛选
到一个具有鼠李糖和丙酸钠抗性的多杀菌素突变株,
其产量达到 125. 3mg /L, 比野生菌株提高了 285. 5%。
Wang等 [32]研究发现,在发酵过程中 S. sp inosa利用的
碳源是葡萄糖而不是淀粉, 而阿维菌素产生菌阿维链
霉菌 (S. averm itilis)能利用淀粉这些廉价的物质作为
碳源。因此将 S. spinosa与 S. averm itilisUA-G在紫外
线照射下进行属间的原生质体融合,获得了能利用淀
粉作为碳源的高产菌株 F17和 F70。它们的产量比原
始菌株分别提高了 447. 22%和 409. 21%。
5 衍生物
5. 1 第二代产品 ( sp inetoram )
Sparks等 [14]用模型证明了扩大多杀菌素结构中所
有位点的烷基的大小将能提高其活性, 而减小烷基的
大小,使之只有一个质子时会降低它的活性。鼠李糖
上的氧去甲基作用及内酯环 5, 6位的双键都会对杀虫
活性产生影响。他们通过人工神经网络预测到增加多
杀菌素鼠李糖结构中 3位烷基的大小, 能较好地提高
多杀菌素的杀虫活性,这为多杀菌素衍生物的合成提
供了一个新方向。当对自然存在的多杀菌素 J和 L的
鼠李糖的 3位甲基进行乙基化和 5, 6位双键的还原时,
就得到了一种新的半合成的多杀菌素衍生物 ) ) )
sp inetoram [33]。
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sp inetoram作为多杀菌素的第二代产品在 2007年
上市。它在多杀菌素 J和 L天然发酵中, 在催化剂、反
应物及溶剂存在下, 经过化学修饰得到, 并且弥补了
sp inosad对水果和坚果等作物的虫害控制不显著这一
缺点。生物测定结果表明, sp inetoram对环境中的大范
围的敏感害虫具有较好效能,并对母体化合物具有毒
学性质。其活性在控制苹果卷叶蛾幼虫方面是
sp inosad的 4. 3倍,而在控制烟蚜夜蛾幼虫方面是它的
6倍 [ 34 ]。
5. 2 丁烯基 -多杀菌素 ( bu teny l-sp inosyns)
丁烯基 -多杀菌素是 1990年通过 96孔板从印第安
纳州收集到的土壤中筛选出来的, 它的产生菌被命名
为 S. pogone,其与 S. spinosa的显著差异包括:多毛的而
不是多刺的芽孢外膜,对噬菌体敏感和不同的 16sRNA
二级结构。丁烯基 -多杀菌素与多杀菌素在结构上的显
著区别是大环内酯 21位上的 2-丁烯基团取代了原有
典型的乙基基团。而它的杀虫活性与 Spinetoram相
似 [21 ]。
H ahn等 [35 ]研究发现, 丁烯基 -多杀菌素生物合成
的编码序与多杀菌素生物合成的编码序具有高度的保
守性,尤其是 S. pogone和 S. spinosa的聚酮合酶的编
码序列在核酸分子上具有 91% ~ 94%的相似性,只有
一处显著不同。丁烯基 -多杀菌素中这个额外的聚酮合
酶模块的基因编码序列负责了 21碳尾巴上额外两个
碳原子的合成。这个区域中的多杀菌素基因的 DNA
序列表明了 S. spinosa中的 spnA基因是由 S. pogone中
busA基因删减所得到的。
5. 3 21-环丁基 -多杀菌素 ( 21-cyclobu ty l-sp inosyns)
21-环丁基 -多杀菌素 A 和 D由基因工程菌 S.
spinosa BIOT-1066产生。这个菌株的聚酮合酶装载模
块由 S. averm itilis中的阿维菌素聚酮合酶装载模块替
换而来。S. spinosa BIOT-1066在一般的发酵培养基上
生长时,主要产物为多杀菌素 A和 E。当在接种 24h后
在培养基中添加终浓度为 5mg /L的环丁基羧酸时, 会
产生 21-环丁基 -多杀菌素 A和 D[36 ]。21-环丁基 -多杀
菌素 A和 D比多杀菌素 A和 D对棉花蚜虫和烟草夜
蛾具有更好的杀虫活性,并且扩大了从鳞翅目昆虫到
吸啜式昆虫的杀虫谱范围 [ 21 ]。
6 展 望
农药残留已成为一个全球性问题, 以绿色环保的
新型生物农药取代目前大量使用的毒性较高的化学农
药,已越来越受到重视,成为研究开发的热点。多杀菌
素这种新型的微生物源抗生素杀虫剂, 其独特的化学
结构和作用方式, 对影响经济的重要害虫具有极高的
活性,半衰期短,易降解,对哺乳动物、鱼类、鸟类和大
多数益虫具有极高的安全界限,使其成为新一代杀虫
剂的主要品种,并具有广阔的市场前景。
多杀菌素在国外已经投入使用,主要由美国陶氏
益农公司生产。商业化的品种有用于棉花上的 Tracer,
Laser, 用于蔬菜 类的菜喜 ( Success )、Conserve和
Spiotor。通过遗传和生化研究,多杀菌素的生物合成途
径及相关的基因组都已经被揭示,然而,有关的基因调
控信息仍然有限。近年来, 随着 S. eryth reae、S.
averm itillis和 S. co lelicolor基因组测序的完成,与其相
关的基因组表达和代谢流程数据,为 S. spinosa代谢网
络的建立提供了依据。S. spinosa的全基因组测序也将
为分子生物学提供更重要的信息,并利用这种分子手
段结合传统的诱变筛选策略以提高多杀菌素的产量。
为此,后期的工作主要围绕高产菌株的选育,生产工艺
的优化等展开,尽可能提高多杀菌素的产量。
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R esearch Progress of Sp inosad P roduced by Saccha ropolyspora spinosa
CAIHeng WANG Yan WAN Hong-gui JIANG Dao-hang WANG H an- ling ZHAO Zong- song
(College of Biotechnology and Pharmaceu tical Engineering, Nan jing Univers ity of Technology, Nanjing 210009, China)
Ab stract The sp inosad, produced by Saccharopolyspora spinosa, is an new- style m icrob iological
insecticide. Sp inosad with the properties of both safety of biologica l pestic ide and fast effect of agrochem ica,l has
a weak toxicity towa rds mamm alian, na tu ra l enem ie s of insects and environmen.t Thus, it has ob tained
perm ission and used in m any countries. A t present the research of spinosad in ou r country is still in the
labora tory, and the lower yields of spinosad lim ited its industria l production. The structure of spinosad and its
biosynthesis were summarized. The fe rmentation medium optim ization, b reeding of high spinosad producing
strains, and its de rivative swere reviewed.
K ey word s Spinosad Fe rmenta tion op timiza tion Breeding Derivatives
姜老师信箱
蛋白质研讨班学员问:
姜老师, 您好! 我在蛋白质分离纯化方面有两个问题想向您请教:
1、工厂规模化生产蛋白 (分子量约为 15kDa), 除了采用各种层析方式外, 一般还可以用什么方法来对蛋白质进行浓缩?
与实验室规模的蛋白纯化相比是否有不同之处?
2、我从资料上得知, 超滤法可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。您曾在课上建议 /超滤的方法不合适用
来分离分子量差别在一个数量级以内的两个蛋白分子0, 那么我能否采用 D ia flo超滤膜 UM - 2(分子量截留值为 1000Da)对
提取的 15. 9kDa蛋白进行除盐?
非常感谢!
姜老师答:
学员, 你好! 大规模进行蛋白质浓缩要看蛋白质处于纯化的哪个阶段。早期蛋白浓度高时, 采用沉淀、吸附 (便宜的吸
附剂:硅藻土、磷酸钙胶、浮石等 )、双水相、层析;蛋白质浓度低时,采用吸附性柱层析、超滤、双水相等。
你们的目的蛋白分子量大于 15kDa,那就可以使用 10kDa的膜来进行脱盐, 同时去除小分子蛋白等可溶物质。尽管此
时对于例如 5kDa的蛋白的去除率约为 40% ,但依然很有价值, 因为这比使用很小分子量 cutoff的超滤膜合算得多。
祝实验顺利!
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