全 文 ：·生物技术· 北方园艺 2010(24):154～ 156
第一作者简介:周丽(1978-),女,硕士,讲师,现主要从事观赏和药
用兰科植物的快繁保育和杂交育种研究工作。 E-mail:zhoulizx x
@yahoo.com.cn。
基金项目:贵州省教育厅自然科学基金资助项目(黔教科
2008095)。
收稿日期:2010-10-11
胼 胝 兜 兰 的 组 培 快 繁 技 术 研 究
周 　丽1 , 邓 克云2 , 魏春 杰2
(1.兴义民族师范学院 ,贵州兴义 562400;2.黔西南州绿缘动植物科技开发有限公司,贵州 兴义 562400)
　　摘　要:胼胝兜兰种子在自然条件下萌发困难 ,自然更新能力差。现采用人工授粉的种子 ,
进行了非共生萌发研究。结果表明:270 d胚龄的种子萌发率高(>95%);种子萌发最佳培养基为
1/2RE+CM 100 mL/L+椰粉12 g/L+香蕉泥70 g/L+蔗糖20 g/L+琼脂粉5 g/L;壮苗培养基
以MS+NAA 1.0 mg/L +BA 0.4 mg/L+椰粉 12 g/L+香蕉 70 g/L +蔗糖 30 g/ L+琼脂粉
5 g/L 为好 ,小苗用松树皮移栽效果好 ,移栽成活率95%以上。
关键词:种子;非共生萌发;培养基;原球茎
中图分类号:S 682.31　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)24-0154-03
　　兜兰是兰科兜兰属(Paphiopedilum)植物 ,又称拖
鞋兰。主要分布于东南亚至喜马拉雅山至中国西南部 ,
少数种类到达新几内亚和所罗门群岛。兜兰属所有种
属于“野生动植物濒危物种国际贸易公约”(CITES)附录
Ⅰ的保护对象 ,目前共有79个野生种记录在案[ 1] ,中国野
生兜兰也达到 18种。兜兰叶形秀美 ,开花期长 ,花朵艳
丽 ,花形奇特 ,具有硕大的兜形唇瓣 ,观赏价值极高。由
于过度采集 、走私猖獗及生长环境受破坏等原因 ,近年
来数量急剧减少 ,濒临灭绝。大力开展兜兰的专业性调
查与考察 ,利用现代生物学技术对兜兰进行繁育 、保育 、
杂交等将有利于野生资源的有效保护 ,为兜兰的回归自
然做准备。
胼胝兜兰(Paphiopedi lum callosum (Rchb.f.)
Stein)分布于柬埔寨 、老挝 、越南及中国南部。胼胝兜兰
花型美丽端庄 ,是“魔帝”类兜兰品种的亲本之一 ,种子
为分化不完全的胚性细胞团 ,无胚乳提供萌发所需营
养 ,在自然环境中要与真菌共生才能萌发 ,自然繁殖系
数极低 ,人工无菌播种难度较大 ,该试验经过对培养基
和种子胚龄筛选 ,使其播种萌发率在 95%以上 ,并且得
到的原球茎能顺利增殖 、分化成健壮小苗 ,对资源的保
护和合理开发利用提供参考 ,为兜兰快速繁殖和商业化
生产奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
胼胝兜兰大棚内盆栽植株 ,人工授粉后剪取种子。
1.2　试验方法
1.2.1　外植体消毒　剪刀剪取授粉后生长时间不同的
果实 ,洗洁精清洗表面后自来水冲洗 , 75%酒精表面消
毒30 s ,浸入95%酒精中1 s ,取出后于酒精灯上点燃 ,待
表面酒精烧尽即可(注意不要在酒精灯上烤)。在灭菌
滤纸上剖开果实 ,取出种子接种于萌发培养基上。
1.2.2　胚龄对种子萌发的影响　兰花种子中的胚未完
全分化 ,没有子叶或胚乳等营养物质供种子萌发 ,在胚
发育的不同时期进行胚抢救 ,萌发率的高低会有所不
同。定期取授粉后 6、7 、8 、9、10个月的种子显微镜下观
察种子情况并播种 ,寻找种子萌发的最佳胚龄。
1.2.3　萌发培养基　以 Robert Ernst(简称 RE)为基本
培养基 ,1/2RE加入 20 g/L 蔗糖 、5 g/L 琼脂粉 ,椰粉
12 g/ L ,CM(椰子乳)100 mL/L ,去皮香蕉 70 g/ L , pH
5.8 ,采用BA与 NAA不同剂量组合配制成萌发培养基
(表2)。在不同培养基配比中 ,用胚龄为270 d的种子为
材料 ,为减少误差将所有果实内的种子取出混匀后播
种。启动萌发时间以肉眼可见培养基上种子有明显膨
大的原球体为准 ,播种 70 d后统计萌发率。
1.2.4　增殖培养基　以 MS为基本培养基 ,1/3MS+
NAA 0.1 mg/L+BA 0.1 mg/L+TDZ 0.2 mg/L ,加入
CM 100 mL/L ,香蕉泥 70 g/L ,蔗糖 15 g/ L、琼脂粉
5 g/L 、活性碳 0.6 mg/L ,pH 5.8。
1.2.5　生根壮苗培养基　MS +椰粉 12 g/ L+香蕉
70 g/ L+蔗糖 30 g/L+琼脂粉 5 g/L ,在不同的激素配
比中寻找最佳组合。
1.2.6　培养条件　萌发光照强度为 500 lx ,增殖 、生根
壮苗时光照强度为2 000 lx ,光照时间 16 h/d ,培养温度
(25±2)℃。
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图 1　授粉后不同时间种子的形态
注:1.授粉后 180 d;2.授粉后 210 d;3.授粉后 240 d;4.授粉后 270 d;5.授粉后 300 d。
　　 图 2　种子的非共生萌发和试管苗形成
　　注:A.播种 58 d萌发情况;B.播种 93 d形成的原球茎;C.播种 110 d原球茎开始分化;D.播种在M5中 110 d形成的 PLB;E.播种 206 d形成的小
苗;F.PLB增殖;G.增殖后的 PLB形成小苗;H.健壮的试管苗;I.试管苗移栽。
2　结果与分析
2.1　胚龄对杂种萌发的影响
兰科植物的胚 ,是一卵形的未分化的细胞团 ,不具
子叶和胚乳 ,缺乏营养物质 ,在自然条件下极难萌发[ 2] 。
自然条件下需要适宜的真菌的感染 ,种子从感染的真菌
得到了萌发所需的养分才能萌发 ,且萌发率很低。采用
组培的方法由蔗糖提供能量物质 ,在适宜的条件下兰花
的种子不需要共生菌也可以萌发。但这个过程中对种
子发育程度有一定要求。
授粉后不同时期的种子形态(图1)大不相同 ,授粉
180 d的果实内无种子形成;授粉210 d显微镜下观察到
无色透明的空种皮 ,极少数种皮内有极小的胚 ,播种无
萌发迹象;授粉230 d的种子聚生在胎座上 ,取下时呈块
状 ,显微镜下观察可见约 60%的白色种皮内有不饱满的
胚 ,播种经萌发试验表明后 46 d开始有萌发 ,90 d后萌
发率为 42%;授粉 270 d的种子已成熟 ,易于从胎座上散
落下来 ,种皮浅黄褐色 ,胚白色 ,充满种皮 ,种子有较短
的翅 ,98%为饱满种子 ,播种后30 d便开始萌发 ,90 d后
萌发率大于95%;授粉300 d的种子充分成熟 ,种皮呈深
褐色 ,播种后76 d才开始萌发 ,90 d后萌发率仅有20%。
另外 ,对于授粉后 230 d的种子用0.15 mol/L KOH 处
理种皮 10 min对种子萌发没有促进作用。
　　表 1　　不同胚龄对胼胝兜兰种子萌发的影响
胚龄/ d 启始萌发时间/d 萌发率/ %
180 - -
210 - -
230 46 42
270 30 >95
300 76 20
2.2　激素组合对种子萌发的影响
由表 2可知 ,在不加任何激素的 M1 中具有启动萌
发早 ,萌发率高 ,原球茎呈浅黄色 ,早期表面光滑 ,后期
表面有细绒毛状物产生。随着 NAA和BA浓度添加种
子启动萌发时间推迟 ,萌发率大大下降。在 M5 中萌发
时间较晚 ,形成的原球茎较大并且易于转绿(图 2-D);在
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M2 、M3 、M4中萌发时间推迟数量减少 ,且萌发后形成的
原球茎在培养后期易于死亡。
　　表 2　　　萌发培养基激素组合及效果
处理 激素组合/ mg·L-1
6-BA NAA
接种瓶数
/瓶
启动萌发时间
/d
萌发率
/ %
M1 - - 5 30 95
M2 0.4 0.4 5 54 10
M3 0.4 1.0 5 56 8
M4 1 0.2 5 70 5
M5 0.2 0.2 5 52 13
2.3　原球茎的增殖
播种后 110 d的原球茎已经分化出 2片子叶 ,播种
后93 d的原球茎已有转绿分化的趋向 ,所以选择播种后
50 d的原球茎进行增殖试验 ,因为此时原球茎个体小切
割后易于死亡 ,可采用直接转移的方法转入增殖培养基
中进行增殖培养。增殖培养 5周后即可得到更多的原
球茎 ,此时增殖系数高(图 2-F)。增殖后的原球茎可转
入新的培养基中再增殖也可转到壮苗培养基中生根得
到健壮试管苗(图2-G)。
　　表 3　　壮苗培养基对小植株的影响
处理 激素组合/mg·L-1 植株
NAA BA 叶片数/片 叶长/cm 根数/条 根长/cm
R1 1.0 0.1 2 0.83 9.30 1.65
R2 1.0 0.2 2 1.47 8.57 2.37
R3 1.0 0.3 2 2.25 6.28 5.63
R4 1.0 0.4 3 2.87 4.29 4.39
R5 0.6 0.1 2 1.02 9.21 1.78
R6 0.6 0.2 2 2.36 8.59 2.45
R7 0.6 0.3 2.5 2.57 7.66 3.75
R8 0.6 0.4 3 3.03 5.63 4.62
2.4　激素组合对壮苗生根的影响
将原球茎转入壮苗生根培养基 ,其表现随着激素组
合的不同而有差异 ,试验表明 NAA 与 BA 的比率对再
生小植株的叶片数量 、叶长度 、根数量 、根长度影响很
大。随着培养基中NAA/BA的浓度比值增加小苗叶片
数和叶片长度减少 、根条数增加 、根变短。可见较高浓
度的 NAA ,让原球茎长出过多的较短粗的根 ,而叶的生
长较少 ,增加 BA的浓度可使根和叶的生长量相互协调。
R4 中生长的小苗各方面表现均良好 ,具有叶片数多 ,叶
片长 ,根系长 ,栽培方便 ,成活率高的特点。
2.5　试管苗移栽
试管苗出瓶前在室温下练苗 1周 ,出瓶时要小心不
伤根 ,洗净根表面附着的培养基 ,用 0.01%高锰酸钾浸
泡 3 min ,阴凉处晾干表面水分。栽培基质用经消毒处
理的颗粒状松树皮 ,每 14 cm 的小盆中移栽 6 ～ 8株小
苗 ,基质只填充到根茎处 ,第 1次浇足水后 ,1周内不浇
水 ,经常向小盆周围的地上洒水 ,保持空气湿度 80%～
90%,通风 ,成活率可达 95%以上。
3　小结
胼胝兜兰种子在授粉后 270 d直接播种在无激素的
1/2RE培养基上 ,萌发率大于 95%,形成的原球茎健壮 ,
有利于增殖成苗。增殖培养基为 1/3MS+NAA 0.1
mg/L+BA 0.1 mg/L+TDZ 0.2 mg/L ,壮苗生根培养
基中 R4 长的小苗壮易于移栽。移栽基质以处理过的颗
粒状松树皮为好 ,透气性好 ,根系生长良好 ,成活率高 ,
植株生长量大。该研究实现了胼胝兜兰的快速繁殖 ,提
高了其繁殖系数。
参考文献
[ 1] 　刘仲健,陈心启 ,陈利君,等.中国兜兰属植物[M] .北京:科学出版
社 ,2009:1-3.
[ 2] 　胡适宜.被子植物生殖生物学[M] .北京:高等教育出版社 , 2005:
218-229.
Study on Tissue Culture and Propagation Techniques of Paphiopedilumcallosum
ZHOU Li1 , DENG Ke-yun2 ,WEI Chun-jie2
(1.Xingyi Normal University for Nationalities , Xingyi , Guizhou 562400;2.Southwest Guizhou Luyuan Animal and Plant Technologies Company
Limited , Xingyi , Guizhou 562400)
Abstract:The seeds of Paphiopedi lum callosum were difficult to germinate under field conditions , which with poor
natural regeneration.Investigation of asymbiotic germination were carried out on the seeds of artificial pollination.The
results showed that 270-day-embryo-aged-seeds had the highest germination rate;The best medium for germination was
1/2RE+coconut milk 100 mL/L+coconut meat 12 g/L+mashed banana 70 g/ L , The strong seeding medium was MS+
NAA 1.0 mg/ L+BA 0.4 mg/ L.Pine bark was best for seeding cultivation.The study achieved rapid propagation of
Paphiopedilum cal losum and it could advance the propagation coefficient , which provide the basis for commercially
produce.
Keywords:seed;asymbiotic germination;medium;protocorm-like body
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