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唇香草提取物抑制变异链球菌实验的初步研究



全 文 :基金项目:国家自然科学基金项目(81060365)
作者简介:季志红(1962-),女,副主任药师,研究方向:维药新药开发与质量评价。
通信作者:哈木拉提·吾甫尔,男(维吾尔族),教授,主任医师,博士生导师,研究方向:新疆重大疾病的中维西医结合研究,E-mail:tsgyz@sina.com。
·基础医学研究·
唇香草提取物抑制变异链球菌实验的初步研究
季志红1,于 谦2,周晓英3,哈木拉提·吾甫尔4
(1新疆奇康哈博维药有限公司,乌鲁木齐 830026;2新疆昌吉州中医医院药剂科,昌吉 831100;
3新疆医科大学药学院化学教研室,乌鲁木齐 830011;4新疆医科大学,乌鲁木齐 830011)
摘要:目的 研究维药唇香草提取物对变异链球菌(streptococcus mutans,Sm)生长的影响,为开展植物药防
龋提供实验依据。方法 采用水蒸气蒸馏法提取唇香草挥发油,采用系统溶剂萃取法从唇香草醇提物中得到石
油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取层,采用测定OD值和结晶紫显色的方法,测定唇香草提取物对变异链球菌的生
长及其生物膜形成的影响。结果 挥发油和胡薄荷酮能有效抑制变异链球菌的生长;正丁醇萃取层、蒙花苷和地
奥司明对变异链球菌生长有一定影响。结论 唇香草提取物的抑菌活性是多种成分的共同作用。
关键词:唇香草;提取物;变异链球菌
中图分类号:R29;R914  文献标识码:A  文章编号:1009-5551(2012)08-1031-04
Effects of aqueous extract of Ziziphora clinopodioides Lam on the
growth of Streptococcus mutans
JI Zhi-hong1,YU Qian2,ZHOU Xiao-ying3,Halmurat Upur2
(1 Xinjiang Qikang Habo Weiyao Company Limited,Urumqi 830026,China;2 Department of
Pharmacy,Chinese Medicine Hospitals Changji Hui Autonomous Prefecture,Changji 831100,China;
3 Department of Chemical,College of Pharmacy,Xinjiang Medical University,
Urumqi 830011,China;4 Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)
Abstract:Objective To investigate the effects of aqueous extract of Ziziphora clinopodioides Lam.on the
growth of Streptococcus mutans.Methods Steam distilation was used to extract essential oil.Petroleum
ether,chloroform,ethylacetate,N-butanol were extracted from the Ziziphora clinopodioides Lam.using
the system solvent extraction.The formation and growth of Streptococcus mutans on biofilmZiziphora
clinopodioides Lam.were tested by determination of the OD value and crystal violet colouration.Results 
The Essential oil and pulegone could effectively inhibit the growth of Streptococcus mutans;N-butanol,
Linarin and diosmin had influence on the growth of Streptococcus mutans.Conclusion The antibacterial
activity of the Ziziphora clinopodioides Lam.is the common effect of a variety of ingredients.
Key words:Ziziphora clinopodioides Lam.;extract;Streptococcus mutans
 第35卷 第8期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol.35 No.8
 2012年8月 Journal of Xinjiang Medical University Aug.2012
    维 药 唇 香 草 (Ziziphora clinopodioides,
Lam.)为唇形科新塔花属植物唇香草的干燥地上部
分,维吾尔名称为苏则、续则。唇香草为多年生半灌
木状草本,喜生于低山坡、草地及干旱坡地上,是新
疆的特有药材。唇香草作为一种传统的维吾尔药用
植物有多种药理作用,可用于治疗心脏病、高血压、
哮喘多汗、心悸失眠、水肿、咳嗽、支气管炎、肺脓疡
和其他疾病[1]。有关研究已经表明,唇香草具有广
泛的抗菌[2-3]和抗氧化[4]效果。唇香草有效成分的
研究主要集中在挥发油类成分,其中胡薄荷酮为主
要成分[5-7]。本课题组在前期实验中,研究了唇香
草挥发油的稳定性[8]、挥发油抑制细菌的活性筛选
及化学成分分析[9],采用液相色谱法测定唇香草药
材中齐墩果酸、熊果酸[10-11]、咖啡酸、迷迭香酸[12]
的含量。考查了总多酚和黄酮含量;对不同极性提
取物的抗氧化活性进行了比较[13];利用微波消解-
火焰原子吸收光谱法测定10种金属元素[14],并对
唇香草质量标准进行了初步研究,作为控制唇香草
药材质量的参考[15]。
变异链球菌 (Streptococcusmutans,Sm)是被
公认为人类龋病的主要病源菌[16-17]。致龋毒力因
子主要包括对牙面的黏附、利用糖类产生多糖以及
较强的产酸和耐酸能力[18]。中药具有来源丰富、毒
副作用相对较小等优点,寻找安全有效的防龋药物
一直是国内外学者研究的热点[19-20]。本实验采用
96孔板法对唇香草主要化学成分和提取部位抑制
变异链球菌活性进行了筛选,旨在发现唇香草抑制
变异链球菌的活性成分,为唇香草的临床应用提供
一定的科学依据。
1 仪器、试剂和试药
1.1 仪器 酶标仪(Molecular Devices spetra-
MAX190USA ),超净工作台(Nuarine Biological
Safty Cabinets,USA),培养箱(Forma Scientific
CO2 Water Jacketed Incubator,USA),冷冻干燥仪
(北京德天佑科技发展有限公司FD-1型),常规玻
璃仪器,试管,EP管,96孔板,接种环,八通道移液
枪,单道移液枪,所用试剂均为分析纯。
1.2 试剂 BHI培养液,结晶紫,去氧胆酸钠,胡
薄荷酮(批号:111706-200903,中国药品生物制品检
定所),地奥司明(批号:D3525,美国Sigma),蒙花苷
(批号:A0111,成都曼斯特生物科技有限公司),氨
苄青霉素(批号:C 10243080德国);菌株:变异链球
菌(ATCC700610,中国药品生物制品检定所)。
1.3 样品 唇香草样品采于新疆乌鲁木齐南山水
西沟(2008年7月)和乌鲁木齐板房沟(2010年7
月),经新疆医科大学中医学院李永和主任药师鉴定
为唇形科植物唇香草 (Ziziphora clinopodioides,
Lam.),样品标本存于新疆医科大学中药民族药标
本馆。
2 方法与结果
2.1 唇香草提取物的制备
2.1.1 唇香草90%乙醇提取液不同萃取部分的制
备 将新疆乌鲁木齐南山水西沟的唇香草阴干后切
成小段,称取5kg,采用浸渍提取法,用90%的乙醇
浸渍提取至提取液无色,合并提取液,将提取液减压
浓缩成稠浸膏,依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁
醇梯度萃取,分别将萃取液减压浓缩成稠浸膏,冷冻
干燥,称重,备用。
2.1.2 唇香草挥发油的制备 取乌鲁木齐板房沟
唇香草100g切成小段后,装入挥发油提取器,加8
倍水,用水蒸气蒸馏法提取6h,收集挥发油并加入
无水硫酸钠脱水备用。
2.2 对变异链球菌的生长及生物膜的影响
2.2.1 样品 唇香草挥发油,石油醚、氯仿、乙酸乙
酯、正丁醇萃取层,胡薄荷酮标准品,地奥司明标准
品,蒙花苷标准品,氨苄青霉素标准品。其中4个萃
取层和地奥司明、蒙花苷标准品以25%二甲基亚
砜-甲醇溶液作溶剂;胡薄荷酮、挥发油和氨苄青霉
素标准品以甲醇作溶剂。
2.2.2 细菌培养 将保存-80℃的变异链球菌复
苏,接种于琼脂固体平板培养基,置入恒温37℃、
5%CO2 培养箱内培养24h。
2.2.3 菌悬液制备 用无菌接种环挑取纯化培养的
变异链球菌,在BHI中充分乳化,置入恒温37℃、5%
2301 新 疆 医 科 大 学 学 报 第35卷 
CO2 培养箱内培养18h,测定OD值,备用。
2.2.4 唇香草对变异链球菌生长的影响 取该菌
悬液用BHI培养液50倍稀释,加入葡萄糖使其浓
度含量为0.8%,混匀。将此稀释液加于2列96
孔板中作为阳性对照,将不含细菌的BHI培养液
加入2列96孔板中作为阴性对照,用微量多点接
种仪将10μL试验样品加于第1排(同一板重复4
次),并加纯溶剂对照,10倍稀释法将药物稀释4
次,将各96孔板放入5%CO2、恒温37℃培养箱培
养18h后,同时测定光密度值 (600nm),计算抑制
率,抑制率计算公式:抑制率%=[(溶剂空白值-样
品值)/(溶剂空白值-阴性对照值)]×100%。结
果见图1、2。
2.2.5 唇香草对细菌生物膜的影响 将96孔板用
蒸馏水清洗数遍,肉眼观察为透明为止,加入0.1%
结晶紫水溶液染色15min,再用蒸馏水清洗数遍,
用2%的SD洗脱细菌生物膜,600nm测定吸收度,
结果见图3。
图1 唇香草对细菌生长的影响
图2 唇香草对细菌生长的抑制率
图3 唇香草对细菌生物膜的影响
3 讨论
唇香草中挥发油、胡薄荷酮、地奥司明、蒙花苷
和正丁醇萃取层均有一定程度的抑制变异链球菌生
长的作用。胡薄荷酮为唇香草挥发油的主要成
分[21],胡薄荷酮有抗炎作用[22];地奥司明和蒙花苷为
黄酮类化合物,地奥司明已运用于临床治疗痔疮、慢
性静脉功能不全等[23];蒙花苷有抗菌消炎活性[24];这
3种成分均为唇香草具有明确药理作用的化学成分。
正丁醇层是极性较大的混合物,对变异链球菌生长有
抑制作用的化学成分有待进一步研究。
3301 第8期 季志红,等:唇香草提取物抑制变异链球菌实验的初步研究
唇香草样品的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇
4个萃取部位以及地奥司明、蒙花苷标准品在甲醇
中溶解度小,加入助溶剂二甲基亚砜后可以提高溶
解度,有利于实验的进行。
唇香草提取物和已知化学成分对变异链球菌生
物膜的影响较弱,但天然药物具有综合作用的特点,
且具有相对安全、毒副作用小的优点,在龋病防治中
的作用日益受到重视。多年来人们一直试图采用药
物来预防龋病的发生,早期曾使用抗生素类药物,虽
可达到一定的防治效果,但因长期使用会引起体内菌
群失调和诱发细菌耐药性而不能广泛应用,所以开发
和利用具有防龋作用的天然药物是非常有前景的。
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[收稿日期2012-02-29]
(本文编辑 周芳)
4301 新 疆 医 科 大 学 学 报 第35卷