全 文 ：第 28卷　第 1期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vol. 28　 No. 1
　 2008年 02月 Journal o f Central South Univ er sity o f Fo rest ry& Techno log y Feb. 2008　
文章编号: 1673- 923X ( 2008) 01- 0130- 04
药用植物单面针离体胚培养的研究
王　平 1 ,马英姿 1 ,王晓明 1 ,左之文 2 ,颜利玲 2
( 1.中南林业科技大学 ,湖南 长沙 410004; 2.株洲千金药业 ,湖南株洲 412003; 3.湖南林业科学院 ,湖南 长沙 410004)
摘　要: 　为了满足市场对单面针 Zanthoxylum d issitum Hem sl资源的需求 ,解决单面针自然繁殖率低的问题 ,采用 L9 ( 34 )正交设
计 ,以单面针种子胚为外植体进行胚培养 .结果表明: 6-BA、 NAA、消毒时间 3因素的最佳水平组合为 M S+ 6-BA 1 mg /L+ NAA 0. 4
mg /L+ 消毒时间 8 min,发芽率可达 86. 7% .
关键词: 　生物技术 ;单面针 ;胚 ;正交设计 ;组织培养 ;发芽率
中图分类号: 　 Q943. 1; S759. 82　　　　文献标志码:　 A
In Vitro Embryonic Culture of Zanthoxylum dissitum Hemsl
W ANG Ping
1 , M A Ying-zi
1 , W ANG Xiao-ming
3 , ZUO Zhi-w en
2 , YAN Li-ling
2
( 1. Cent ral South University of Fo res try and Technolog y, Changsh a 410004, Hunan, China; 2. Zhu zh ou Qian jin Pharmaceutical Co. , Ltd,
Zhu zh ou 412003, Hunan, China; 3. Hunan Acad emy of Fores t ry, Ch ang sha 410004, Hunan, China)
Abstract: In order to satis fy th e mark et s demands for the resources of Zanthox ylum d issitum Hems l, this paper conducted s ome
res earch on th e problem of i t s natu ral propag ation, cooperating wi th Zhuzh ou Qianjin Pharmaceu tical Co. Ltd. Using i t s emb ryos as
in vi t ro cul ture material, orth ogonal d esig n L9( 34) as th e tes t method , and sett ing up 6-BA, N AA and disinfected time as th e th ree
main factors ( ev ery factor having 3 lev els ) . The resul ts indicate that th e bes t lev el combinat ion is: M S+ 6-BA 1 mg /L+ N AA
0. 4 mg /L+ 8 min of disinfected tim e, th e germination rate being 86. 7% .
Key words: bio-technolog y; Zan thoxylum d issi tum Hemsl; emb ryo; orth ogonal d esig n; tis sue culture; germination percen tage
单面针 Zanthoxylum dissitum Hemsl又名蚬壳花椒、大叶花椒、大叶枇杷等 ,为芸香科花椒属木本植物 ,生
于山地林中或路旁 ,主要分布在陕西、湖北、湖南、广西、广东及西南等省 .单面针含有多种生物碱成分 ,其根、
茎、叶均可入药 ,具有治牙痛、腰痛、咳嗽、活血化痰、妇女月经过多和产后月经不调等功效 [ 1, 2] .由于它具有良好
的药用价值 ,因此在药物生产中被广泛应用 ,随着需求量的加大 ,野生资源已不能满足市场的需求 ,利用生物技
术方法对单面针的快速繁殖进行研究 ,找出离体胚培养的最佳条件并实现规模化生产将是解决这一矛盾的有
效途径 .为此 ,笔者查阅相关资料 [3～ 8 ] ,对单面针离体胚进行培养 ,并利用正交实验得出了离体胚的最佳培养条
件 ,为今后单面针进行规模化生产奠定了理论基础 .
1　材料与方法
1. 1　实验材料及其处理
实验材料来自湘西 ,单面针种子由千金药业有限公司提供 .用解剖刀切破种壳 ,从胚囊中取出胚 ,然后用 70%
收稿日期: 2007-03-13
基金项目: 湖南省自然科学基金项目“药用植物单面针的生物学特性研究 ( 07 JJ5041)” ;株洲市重点科技项目“药用植物单面针组培技术
中试研究及组培苗栽培技术示范” ;株洲千金药业股份公司合作项目“单面针人工快繁技术中试研究” .
作者简介: 王　平 ( 1964- ) ,男 ,湖南澧县人 .教授 ,博导 ,主要从事生物技术、环境科学方面的教学与科研工作 .
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 2008. 01. 011
酒精进行消毒 ,再用 0. 1%氯化汞进行表面消毒 ,用无菌水漂洗 3～ 4次 ,再用无菌滤纸或纱布吸干 ,备用 [9 ] .
1. 2　培养基制作
根据培养基的配方制备 MS培养基 ,调 pH值为 5. 8～ 6. 0,用 50 mL三角瓶分装 ,置于 LDZX-40Ⅱ型自动电
热压力蒸汽灭菌锅 ,于 1. 06 kg /cm2的压力下 121℃消毒 25 min.
2　结果与分析
2. 1　不同种类及质量浓度的激素对离体胚培养的影响
表 1　 6-BA与 N AA的组合
Table 1　 The combinat ion of 6-BA and NAA
培养基 6-BA质量浓度
/( mg· L- 1 ) N AA质量浓度/ ( mg· L- 1 ) 接种数 发芽率/% 污染率/%
MS 0 0 30 10. 0 10. 0
MS 1 0. 1 30 23. 0 26. 7
MS 1 0. 2 30 65. 0 22. 5
MS 2 0. 1 30 50. 0 23. 3
MS 2 0. 2 30 54. 0 20. 0
表 2　 KT与 N AA组合
Table 2　 The combination of KT and NAA
培养基 KT质量浓度
/( mg· L- 1 ) N AA
质量浓度
/ ( mg· L- 1 ) 接种数
发芽率
/%
污染率
/%
MS 1 0. 1 30 20. 0 16. 7
MS 1 0. 2 30 60. 0 20. 0
MS 2 0. 1 30 40. 0 33. 3
MS 2 0. 2 30 36. 7 23. 3
表 3　 6-BA与 IBA组合
Table 3　 The combination of 6-BA and IBA
培养基 6-BA质量浓度
/( mg· L- 1 )
IBA质量浓度
/ ( mg· L- 1 ) 接种数
发芽率
/%
污染率
/%
MS 1 0. 1 30 16. 7 33. 7
MS 1 0. 2 30 46. 7 26. 7
MS 2 0. 1 30 50. 0 30. 0
MS 2 0. 2 30 23. 3 36. 7
　　实验以单面针离体胚为外植
体 ,用 M S固体培养基进行培养 ,在
培养基中添加不同种类及质量浓度
的细胞分裂素和生长素 ,观察离体
胚的发芽率和污染率 ,实验结果见
表 1～ 3.从表 1、表 2的对比中可以
看出 ,当保持 NAA质量浓度一致 ,
改变6-BA的质量浓度时 ,平均发芽
率为 48% ,最高发芽率为 65% ;用
KT作为胚培养激素时 ,平均发芽率
只有 39. 2% ,最高发芽率为 60% ,并
且各质量浓度的 6-BA对芽的诱导
率都要比相应质量浓度的 KT的高 ,
说明各质量浓度的 6-BA对发芽率
的影响要比 K T的更为明显 .当每组
6-BA的质量浓度保持一致时 ,取相
同质量浓度的生长素 NAA、 IBA作
对比实验 ,从表 1和表 3的比较分析
同样可以得出 , N AA对发芽率的诱
导要比 IBA的效果好 ,因此在单面
针离体胚培养过程中选用 6-BA和
NAA作为单面针离体胚培养激素
是比较合适的 .
2. 2　最佳培养方案的确定
实验选择 6-BA( A )、NAA(B )、
消毒时间 (C ) 3因素 ,每个因素 3水平 ,选用 L9 ( 34 )正交表做正交实验 ,并对实验数据用 SPSS统计软件进行方差
分析 ,同时用 LSD法对每因素各水平之间进行多重比较 [10 ] .采用 MS琼脂培养基 ( 7. 5 g /L琼脂 , 20 g /L蔗糖 ,
pH5. 8) ,于 ( 25± 1)℃、 2 000 lx光照培养 , 15 d后统计发芽率 ,实验结果见表 4和表 5.
通过对表 4数据的直观分析可以得出各因素内各水平之间的极差 ( R ) .极差的大小反映了该因素的影响程
度 ,极差大的因素对实验结果的影响也大 .从 R的大小可知 ,对发芽率影响因素的主次依次是: 6-BA> N AA>
消毒时间 .从表 4还可得出各因素的最优水平组合为 A1B2C2 ,即 6-BA为 1 mg /L , N AA为 0. 4 mg /L,消毒时间
为 8 min,该组合对离体胚培养的发芽率可达 86. 7% .
131第 1期 王　平等:药用植物单面针离体胚培养的研究
表 4　正交实验结果和直观分析
Table 4　 The result of orthogonal test and ocular analysis
实验序号
因素 A
水平号 6-BA质量浓度
/( mg· L- 1 )
因素 B
水平号 N AA质量浓度
/ ( mg· L- 1)
因素 C
水平号 消毒时间
/min
因素 D
空白列水平号
实验结果
接种数 发芽数 发芽率
/%
1 1 1 1 0. 2 1 6 1 30 20 66. 67
2 1 1 2 0. 4 2 8 2 30 26 86. 67
3 1 1 3 0. 6 3 10 3 30 16 53. 33
4 2 3 1 0. 2 2 8 3 30 17 56. 67
5 2 3 2 0. 4 3 10 1 30 18 60. 00
6 2 3 3 0. 6 1 6 2 30 7 23. 33
7 3 5 1 0. 2 3 10 2 30 13 43. 33
8 3 5 2 0. 4 1 6 3 30 15 30. 00
9 3 5 3 0. 6 2 8 1 30 5 16. 67
K 1 2. 066 7 1. 670 1 1. 200 0 1. 433 4
K 2 1. 403 4 1. 766 7 1. 603 5 1. 533 3 T= 4. 370 1
K 3 0. 900 0 0. 933 3 1. 566 6 1. 403 4
K 1 0. 688 9 0. 556 7 0. 400 0 0. 477 8
K 2 0. 467 8 0. 588 9 0. 534 5 0. 511 1
K 3 0. 300 0 0. 311 1 0. 522 2 0. 467 8
R 1. 166 7 0. 833 4 0. 403 5 0. 129 9
表 5　 L9 ( 34 )实验结果方差分析
Table 5　Variance analysis to the results L9 ( 34 )
变异来源 离差平方和 自由度 均方差 均方比 概值
因素 A 0. 228 2 0. 114 73. 901 0. 013
因素 B 0. 139 2 0. 069 44. 838 0. 022
因素 C 0. 033 2 0. 017 10. 736 0. 085
误差 0. 003 2 0. 002
　　表 5方差分析的结果说明 ,因素
A( 6-BA)和因素 B( N AA)对胚的发
芽率影响显著 ( p≤ 0. 05) .经 LSD多
重比较得出 ,因素 A的各水平之间存
在显著差异 ( p = 0. 02, 0. 035, 0. 007
< 0. 05) ;因素 B的水平 1, 2之间无显
著差异 , 2, 3之间和 1, 3之间均存在
显著差异 ;因素 C各水平之间无显著差异 [ 11, 12] .由此可知 ,在单面针的离体胚培养过程中 ,要得到较高的发芽
率 , 6-BA应当选用 1 mg /L,生长素 NAA质量浓度选用 0. 2或 0. 4 mg /L对实验影响不大 ,消毒时间 ( 6、 8、 10
min)对结果的影响不明显 .从正交实验的方差分析可知 ,生长素 NAA质量浓度在 0. 2～ 0. 4 mg /L范围都较
适合胚的生长 ,但从苗的生长速度来看 , N AA为 0. 4 mg /L时生长较好 (见图 1、图 2) ,因而激素 NAA选
0. 4 mg /L较为合适 .
图 1　 NAA为 0. 4 mg /L时 , 20 d后的生长情况
Fig. 1　 The growth after 20 days when NAA being
at 0. 4 mg /L
图 2　 NAA为 0. 2 mg / L时 , 20 d后的生长情况
Fig. 2　 The growth af ter 20 days when NAA being
at 0. 2 mg /L
132 中　南　林　业　科　技　大　学　学　报 第 28卷
3　小　结
通过实验对适合单面针生长的各种激素进行了筛选 ,并通过正交实验得出了最佳培养条件 .综合正交实验
的 直观分析和方差分析结果 , 6-BA、 NAA、消毒时间 3因素的最佳水平组合为 MS+ 6-BA 1 mg /L+ N AA
0. 4 mg /L+ 消毒时间 8 min,该组合对单面针离体胚培养的发芽率可达 86. 7% .这个实验结果为单面针这一紧
缺资源的快速繁殖、无性系的建立以及基因转化遗传育种都奠定了良好的基础 .
参考文献:
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[本文编校:谢荣秀 ]
(上接第 129页 )
5　结论与讨论
( 1)本文中首先建立了全面的森林火险区划评判因子体系 ,利用 15个指标来对森林火险进行区划 ,并通过
GIS来对数据进行收集、分析和处理 ,较前人研究时用 5～ 7个指标更具全面性和科学性 .
( 2)聚类分析法通过研究样本数据间的联系 ,对所调查的数据进行火险区划分析 ,使火险相同的地区归为
一类 ,通过分析 ,共得到 3大类 ,即: 样地 1、 2、 3、 9为一类 ,火险最高 ;样地 4、 7、 10、 11、 15为一类 ,火险次之 ;其余
的样地 5、 6、 8、 12、 13、 14为一类 ,火险最低 .此种分类的优点是速度快 ,精度高 ,方法科学 .
( 3)利用聚类分析法对森林火险进行区划具有较强的理论基础 ,但其分类效果还有待于在实践中检验 .今
后的研究应就同一样本中各因子间的联系进行分析 ,在保证信息全面的情况下精简分类因子 .
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[本文编校:胡曼辉 ]
133第 1期 王　平等:药用植物单面针离体胚培养的研究