全 文 ：楮实子生物碱的细胞毒作用研究
庞素秋1 ,王国权 1 ,黄宝康 2 ,秦路平2＊
(1.解放军第 180医院药械科 ,福建泉州 362000;2.第二军医大学药学院 ,上海 200433)
摘要 目的:对楮实子总生物碱抗肿瘤细胞的活性进行探讨。方法:分别用 MTT及集落形成法考察楮实子中
提得的总生物碱对 Hela、BEL-7402、A375、SMM1990、Saos-2细胞株的细胞毒作用。结果:当药物浓度在 10 μg/L以
下 , 抑制作用不明显。随着药物浓度的升至 50 μg/L时 ,药物对肿瘤细胞生长的抑制作用较明显 , MTT法测得抑制
率在 20%以上 , 集落形成法测得抑制率在 30%以上。而当药物浓度达到 100 μg/L时 ,楮实子总生物碱显示出较为
显著的肿瘤细胞抑制作用 ,两种方法的细胞生长抑制率分别在 50%和 60%以上。结论:楮实子中总生物碱有较强
的细胞毒作用。
关键词 楮实子;生物碱;MTT法;集落形成法;细胞毒作用
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)07-0826-03
CytoxicActivitiesofTotalAlkaloidsIsolatedfromFructusBroussonetiaeinVitro
PANGSu-qiu1 , WANGGuo-quan1 , HUANGBao-kang2 , QINLu-ping2
(1.DepartmentofPharmacy, 180thHospitalofPLA, Quanzhou362000, China;2.ColegeofPharmacy, SecondMilitaryMedicalU-
niversity, Shanghai200433, China)
Abstract Objective:ToobservethecytoxicactivitiesoftotalalkaloidsisolatedfromFructusBroussonetiaeonthegrowthinhibi-
tioninfivecarcinomacellines.Methods:ThegrowthinhibitionwasanalyzedbyMTT, CelcolonyintheHela, BEL-7402, A375,
SMM1990, Saos-2 celllines.Results:ThegrowthofaltumorcelswereinhibitedbytotalalkaloidsisolatedfromFructusBroussoneti-
ae.Conclusion:TheresultsshowthattotalalkaloidsisolatedfromFructusBroussonetiaepossesstheroleofantitumorsincelculture.
Keywords FructusBroussonetiae;Alkaloids;MTTmethod;Cellcolony;Cytoxicactivities
基金项目:国家自然科学基金(No.30400595)＊通讯作者:秦路平。
楮实子具有免疫增加作用和抗肿瘤作用 ,曾有
报道伍用楮实拟方 “扶肺煎”(生晒参 、黄芪 、楮实子
等)治疗中 、晚期肺癌 63例 ,结果对患者低下的 B
淋转 、T淋转 、C3均有明显的提高作用(P<0.01、P
<0.05),存活率高于化疗组〔1〕。楮实子抗肿瘤活
性成分一方面可能与楮实油中 PUFA、水提物 、色素
的抗氧化 、抗疲劳 、耐缺氧及免疫增强作用有关 ,即
中医所谓扶正。另一方面 ,可能含有对肿瘤细胞具
有抑制或杀灭作用的物质 ,可谓祛邪 。
本课题组在对楮实子化学成分的系统研究中 ,
首次得到了 5个生物碱 ,部分化合物已有研究证实
有确切的抗肿瘤作用 。为进一步探讨楮实子中抗肿
瘤活性成分 ,为开发新药提供依据 ,我们在文献调研
的基础上 ,设计该实验 ,考察楮实子中提得的总生物
碱对 Hela、BEL-7402、A375、SMM1990、Saos-2细胞
株进行了细胞毒作用研究 。
1 材料与方法
1.1 细胞系 Hela(人宫颈鳞癌细胞)细胞株由第
二军医大学细胞生物学教研室提供;BEL-7402细胞
株(人肝癌细胞株)由第二军医大学中医系提供 。
人生骨肉瘤细胞系 Saos-2细胞:由上海肿瘤研究所
提供 。A375(人黑色素瘤细胞株)、SMM-1990(人胰
腺癌细胞株):由第二军医大学药学院生化药学教
研室提供 。
1.2 试剂 MTT(四甲基噻唑蓝)为德国 Sigma公
司产品 ,批号:050608;FCS(小牛血清 ,杭州四季青
生物工程材料有限公司产品)批号:050911;RPMI
1640和 DMEM培养基为美国 Gibco公司产品 ,批号
分别为:1120708和 0511;Trypsin(胰蛋白酶)为天津
市灏洋生物制品有限责任公司产品 ,批号:200503;
DMSO(二甲基亚砜)批号:20050321。
1.3 仪器和器材 超净工作台:苏州净化设备厂 ,
SW-CJ-2FD双人单面净化工作台;MCO-15AC型
CO2孵育箱;日本三洋电子生物医学产品(SANYO
ELECTRICBIOMEDICALCO., LTD);倒置相差显微
镜:日本 OLYPUSOPTICALCO.LTD.产品;CK-
40F200型低温高速离心机:德国 Heraeus产品;微量
可调加样器:瑞士 SocoRex产品;24孔培养板:丹麦
Nunclon公司;96孔培养板:美国 Corning公司;BIO-
TEX-Elx800酶联免疫检测仪:华东电子管厂 DG-
3022型。华鑫酶联免疫检验分析系统 。
1.4 药物 楮实子总生物碱提取:楮实子干燥至
·826· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 7期 2007年 7月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2007.07.030
恒重 ,粉碎 ,各称取 2.0 g,放入 200ml圆底烧瓶中 ,
加入 pH值为 2 ～ 3的 50ml80%乙醇 ,加热回流 1.5
h,抽滤 ,分离原料和提取液 ,在滤渣中加入同样酸度
的 100ml80%乙醇 ,第二次提取 1.5 h,抽滤 ,合并
二次提取液 。
将提取液进行蒸馏浓缩 (回收溶剂 )后 ,用 3
mol/L硫酸溶解 ,抽滤 ,得滤液。将滤液用浓氨水调
至 pH值为 10左右后 ,溶液变浑浊 ,加入约 10ml饱
和氯化钠溶液洗涤 ,再分别用 50、45、 40、35 ml的
CHCl3萃取四次 ,将萃取液蒸馏 ,回收溶剂 ,剩余的
浓溶液转移至小烧杯中 ,放在水浴上加热 ,尽量除去
溶剂后置于 75℃的烘箱中烘干 ,得黄褐色的总生物
碱 ,备用。
1.5 MTT法测抑制率 〔2〕 在 96孔板中每孔加入
细胞 100 μl(含肿瘤细胞 1 ×105 cels/ml)含 10%
FCS的 RPMI1640培养液 , Saos-2则用含 10%FCS
的 DMEM培养液 。置 37℃, 10%CO2培养箱中培养
24 h后 ,实验组分别加入终浓度分别为 10 μg/ml,
50 μg/ml, 100 μg/ml三个不同浓度的药物培养液 ,
对照组则加入等体积溶剂的培养液 ,每种细胞 、每种
浓度平行处理 3孔 ,重复 3次。置 37℃, 10%CO2培
养箱中培养 48h,在培养结束前 4h,每孔加入 20μl
MTT(5 mg/ml),培养结束后 ,弃上清液 ,每孔加入
150μlDMSO,轻微振荡 10min后 ,使形成的甲臜颗
粒完全溶解 ,于 540 nm处酶联免疫法比色 ,经调零
孔调零 ,测 OD值 ,计算结果。按下列计算药物对肿
瘤细胞的生长抑制率 。
抑制率(%)=(1-实验组平均 OD值 /对照组平均 OD
值)×100%
1.6 集落形成法〔2〕 取直径为 35mm的培养皿 , 3
个为一组 ,重复 3次 ,将 Hela、BEL-7402、SMM-1990、
A375细胞用含 10%FCS的 RMPI1640培养液及
Saos-2细胞用含 10%FCS的 DMEM培养液配成含
500个 /ml细胞悬液 ,每皿加 2 ml。实验组分别加入
最终浓度为 10 μg/L, 50 μg/L, 100 μg/L三个不同
浓度的药物培养液 ,对照组加入等体积溶剂 ,置
37℃, 10%CO2培养箱中培养 7天 ,弃去培养液 ,用
瑞氏-姬姆萨染色后计数含 50个细胞以上的细胞集
落数。按下式计算药物抑制率 。
肿瘤细胞集落形成抑制百分率(%)=(1-实验组细胞
集落数 /对照组细胞集落数)×100%
1.7 统计学处理 用 t检验进行统计学分析 ,数
据以 x±s表示。
2 结果与讨论
2.1 MTT法 不同浓度楮实子总生物碱对 5种不
同肿瘤细胞株的抑制作用结果见表 1。
表 1 MTT法测定楮实子总生物碱对不同种类肿瘤
细胞株生长抑制率的影响(%, x±s, n=9)
肿瘤细胞株类型 总生物碱浓度(μg/L)
10 50 100
Hela 9.25±0.98 36.33±2.12 79.17±3.26
BEL-7402 15.24±1.03 29.29±2.01 50.68±4.31
A375 2.28±0.62 20.26±1.98 59.13±3.09
SMM1990 3.55±1.09 25.32±2.61 50.21±3.66
Saos-2 6.74±1.23 30.12±4.02 60.29±3.33
结果显示 ,楮实子总生物碱对 5类肿瘤细胞有
直接抑制作用 ,抑制率与药物浓度呈现量效关系。
当浓度为 10μg/L,抑制率较低;当浓度为 50 μg/L
时 ,对 5种细胞株的生长抑制率均达 20%以上;当
浓度为 100 μg/L时 ,抑制率均高于 50%,说明总生
物碱对上述肿瘤细胞的抑制作用较显著 。
2.2 集落形成法 不同浓度的楮实子总生物碱对
肿瘤细胞株的抑制作用 ,结果见表 2。
表 2 集落形成法测定楮实子总生物碱对五种
细胞株的生长抑制率(%, x±s, n=9)
肿瘤细胞株类型
总生物碱浓度(μg/L)
10 50 100
Hela 7.34±1.02 32.14±1.92 88.01±10.26
BEL-7402 10.22±1.63 39.29±4.21 65.61±7.00
A375 9.24±0.82 40.26±2.08 65.44±4.20
SMM1990 5.21±1.01 29.31±4.01 61.02±8.66
Saos-2 6.23±1.06 29.35±4.12 80.45±6.53
集落形成法的结果显示 ,楮实子总生物碱对 5
种肿瘤细胞株集落形成均有不同程度的抑制作用 ,
所得结果与 MTT法相吻合 。
3 结论
本研究结果表明 ,楮实子总生物碱对 5种肿瘤
细胞有生长抑制作用 。当药物浓度在 10 μg/L以
下 ,抑制作用不明显 。随着药物浓度的升至 50μg/
L时 ,药物对肿瘤细胞生长的抑制作用较明显 , MTT
法抑制率在 20%以上 ,集落形成法抑制率在 30%以
上。而当药物浓度达到 100μg/L时 ,楮实子总生物
碱显示出较为显著的肿瘤细胞杀伤作用 ,两种方法
的细胞生长抑制率分别在 50%和 60%以上。通过
本实验进一步验证了楮实子总生物碱为其抗肿瘤活
性部位。
癌症是严重威胁人类健康的一类疾病 ,寻找有
效的抗癌药物是当前的研究热点 。我国天然药物资
源丰富 ,利用现代化技术从天然产物中筛选抗肿瘤
成分是实现中药现代化的必然要求。
·827·中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 7期 2007年 7月
参 考 文 献
[ 1] 许继平 ,黄建瑾 , 杨峰 ,等.扶肺煎治疗中晚期肺癌的报
道.中国医药学报 , 1990, 5(2):37-39.
[ 2] 张均田 .现代药理实验方法(上册).北京:北京医科大
学中国协和医科大学联合出版社 , 1998:819-822.
(2006-10-31收稿)
环维黄杨星 D对结扎大鼠冠状动脉致心肌缺血的影响
周玖瑶 ,孙毅东 ,谭永恒 ,邓素坚 ,黄桂英
(广州中医药大学药理学教研室 ,广东广州 510405)
摘要 目的:研究环维黄杨星 D对大鼠心肌缺血的保护作用。方法:采用结扎冠状动脉左前降支造成心肌梗
死模型 , 分别测定手术后各组大鼠的心电图 S-T段 ,心肌损伤范围(坏死及缺血范围), 心肌组织中丙二醛(MDA)含
量 、超氧化物歧化酶(SOD)、磷酸肌酸激酶(CPK)活性。结果:环维黄杨星 D(1.1, 2.2 mg/kg)能明显减轻结扎冠状
动脉致心肌损伤 , 减小模型大鼠心肌梗死面积 , 显著抑制心肌缺血大鼠心电图 S-T段升高 ,显著抑制模型大鼠心肌
中 SOD活性降低 、MDA含量升高 ,显著抑制模型大鼠心肌中 CPK活性降低。结论:环维黄杨星 D对结扎大鼠冠状
动脉所致心肌缺血损伤具有明显的保护作用。
关键词 环维黄杨星 D;心肌缺血模型;MDA;SOD;CPK
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2007)07-0828-03
TheEffectofCyclovirobuxinumDonMyocardial
IschemiaInducedbyCoronaryArteryLigationinRats
ZHOUJiu-yao, SUNYi-dong, TANYong-heng, DENGSu-jian, HUANGGui-ying
(DepartmentofPharmacology, GuangzhouUniversityofChineseMedicine, Guangzhou510405, China)
Abstract Objectives:TostudythecardiacprotectionofCyclovirobuxinumD(Cvb-D)inratsmodel.Methods:Theratswere
subjectedtoleftmaincoronaryarteryocclusion.ThechangeaboutS-Tsegment, theareaofmyocardialinjury(necroticandischemic
areas), theamountofcardiactissuemalondialdehyde(MDA), thecardiactissuecreatinephosphokinase(CPK)andthecardiactissue
superoxidedismutase(SOD)activationweremeasured.Results:Comparedtothemodelgroup, Cvb-D(1.1mg/kg, 2.2mg/kgdos-
age)significantlyreducemyocardialdamage, reducemyocardialischemiamoderats∑s-tofECG, significantlyreducecardiactissue
CPKactivationandMDAcontent, raisethecardiactissueSODactivationintheratswithmyocardialischemia.Conclusion:Cvb-Dis
effectiveintreatmentofmyocardialischemiainrats.
Keywords CyclovirobuxinumD;Coronaryarteryocclusion;MDA;SOD;CPK
基金项目:广州市科技计划项目(No.2006Z3-5021)作者简介:周玖瑶(1970-),男,副教授 ,研究方向:中药作用机理研究;Tel:020-39358084。
环维黄杨星 D(CyclovirobuxinumD,简称 Cvb-
D)是从黄杨科植物小叶黄杨 (Buxusmicrophyla
Sieb.etZucc.var.sinicaRehd.etWils.)及其同属
植物中提取的一种生物碱 ,为我国近年研制成功的
一种治疗心血管疾病的新药 ,具有行气活血和通络
止痛功能 ,主要用于治疗气滞血瘀所致的胸痹心痛 、
脉结代 、冠心病 、心律失常者〔1〕。前期已经采用异
丙肾上腺素 、垂体后叶素致心肌缺血模型证实 Cvb-
D的抗心肌缺血药理作用 〔2、3〕。本文应用结扎冠状
动脉造成大鼠心肌缺血模型 ,以心电图 S-T段 、心肌
梗死面积 、心肌中 MDA、SOD、CPK活性进一步评价
Cvb-D对缺血心肌的保护作用 。
1 材料
1.1 药品 Cvb-D-购自江苏省东台市济民生物制
品厂 ,批号:20040706。复方丹参片(薄膜片),广州
白云山制药股份有限公司 ,批准文号:Z44023372,生
产批号:04051013。
1.2 试剂 超氧化物歧化酶 (SOD)活性试剂盒
(邻苯三酚自氧化法)、丙二醛(MDA)试剂盒 [ TBA
(ThibabituicAcidTBA)法 ] 、磷酸肌酸激酶(CPK)试
剂盒 ,均由南京生物工程研究所提供。
1.3 动物 SD大鼠 ,体重(250±50)g,雌雄兼用 ,
广州中医药大学实验动物中心提供。动物合格证
号:SCXK(粤)2003-01。
·828· 中药材 JournalofChineseMedicinalMaterials 第 30卷第 7期 2007年 7月