全 文 ：第 16 卷 第 1 期 天 津 农 学 院 学 报 Vol.16，No.1
2009 年 3 月 Journal of Tianjin Agricultural University March，2009

* 收稿日期：2008－11－05
基金项目：天津市农业科技发展计划“花卉离子注入诱变育种技术的研究”（013120711-17）
作者简介：孙永健（1983－），男，天津市人，硕士在读，主要从事植物细胞工程和分子生物学方面的研究。E-mail：syjwonderful@
yahoo.com.cn。
通讯作者：张磊（1952－），男，辽宁锦州人，教授，学士，主要从事遗传学及植物细胞工程方面的教学与研究工作。联系电话：（022）
23789376。

文章编号：1008-5394（2009）01-0021-04

低能离子注入凤仙花后 DNA 变异的 RAPD 分析*
孙永健 1，孙宁 1，张乃楠 1，曹智攀 2，张磊 1，通讯作者，陈小强 1
（1. 天津农学院 农学系，天津 300384；2. 天津大学 化工学院，天津 300072）

摘 要：将3种不同剂量的低能P＋和N＋注入来自同一纯系品种的凤仙花（Impatiens balsamina L.）
种子中后，采用RAPD技术研究凤仙花的变异。首先，建立了凤仙花的RAPD反应体系，然后，从
25个随机引物中筛选出扩增条带清晰、反应结果稳定、重复性较好的3个引物，共扩增出86条较清
晰的谱带，其中多态性谱带23条，分子量在350～2 000 bp之间。通过分析DNA的变异情况发现，
注入低能离子可以使凤仙花发生DNA水平上的变异。这一研究为花卉产业的发展提供了一种新的
育种手段。
关键词：离子注入；凤仙花；随机扩增多态性DNA
中图分类号：S642.2；Q554.6 文献标识码：A

RAPD Analysis of Impatiens balsamina L. DNA Variation Caused by
Injection of Low Energy Ions
SUN Yong-jian1, SUN Ning1, ZHANG Nai-nan1, CAO Zhi-pan2, ZHANG Lei1，Communication Author,
CHEN Xiao-qiang1
（1. Department of Agronomy, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. College of Chemical Engineering,
Tianjin University, Tianjin 300072, China）
Abstract：Low energy P＋ and N＋ ions were implanted to Impatiens balsamina L. seeds, and the best RAPD (random amplified
polymorphic DNA) reaction system for Impatiens balsamina L. was established. By using random primers, DNA variation was
analyzed. The results show that 3 primers were the most efficient among 25 primers, and 23 polymorphic bands were found
among 86 bands gained by RAPD. The results suggest that the variation of Impatiens balsamina could be caused by the injection
of low energy ions, and it was a useful way in flower industry.
Key words：ions implantation；Impatiens balsamina L.；random amplified polymorphic DNA

RAPD是由Williama[1]和Welsh[2]在1990年各
自独立发现的一种DNA多态性检测技术。它是在
PCR的基础上发展起来的，不需要预先知道基因
组序列，无需使用同位素或其他非放射性标记。
该技术以其快速、准确、灵敏度高等特点，在品
种鉴定、分类研究、系谱分析、遗传图谱构建、
突变体检测、基因定位等遗传、育种领域得到广
泛应用[3]。
由我国首创的低能离子（30～180 keV）注入
生物体诱变育种技术在植物、微生物育种上取得
了一系列进展[4-7]，它能够显著提高变异率，可以
在损伤轻的情况下获得较高频率的突变。将低能
离子注入运用于花卉诱变育种的研究中，可以实
现诸多优越之处。
凤仙花（Impatiens balsamina L.）又名指甲花，
为凤仙花科凤仙花属的一年生庭院观赏性草本植
物。《本草纲目》云：“其花头翅尾足、俱翘然如
凤状，故以名之”。近年来，凤仙花常用于节日花
坛的摆设，花姿秀丽，引人注目。目前，应用RAPD
技术对花卉品种进行分类和鉴定已有许多研究，
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如对桂花[8]、梅花[9]、丁香[10]、月季[11]等都有相关
的报道。本试验采用RAPD法对低能离子注入后的
凤仙花进行分析，获得了注入后植株与对照植株
的DNA差异性条带。
1 材料和方法
1.1 材料
将3种不同剂量的低能P＋和N＋注入来自同一
纯系品种的凤仙花种子中，经播种、生长，得到6
种处理植株及1种对照植株。随机引物、TaqDNA
聚合酶、dNTPs均购自上海生工生物公司，其他
药品及生化试剂均为北京赛百盛基因技术有限公
司产品。
1.2 研究方法
1.2.1 离子注入
将凤仙花种子排列在离子注入机样品架上，使
离子束作用在每粒种子的相同部位上，进行离子注
入。P＋和N＋的注入能量均为：在3.3×10－3 Pa真空
状态下，以5 s/次的脉冲方式进行注入，注入剂量分
别为1×10 16⁄cm2、3×10 16⁄cm2和5×10 16⁄cm2。
1.2.2 DNA的提取与检测
采用Doyle等[12]报道的CTAB法提取凤仙花叶
片中的基因组DNA。将提取的DNA溶解于100 µL
TE（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）溶液中，
放入－20 ℃冰箱中储藏或4 ℃下备用。取3 µL
DNA原液，加入5 µL三蒸水和2 µL溴酚蓝，用1%
的琼脂糖凝胶（含GoldView 50 µL/L），在0.5×
TBE电泳缓冲液中电泳。使用凝胶自动成像系统
（GENE GENIUS）所配备的分析软件，将所提取
DNA条带的亮度与3种不同浓度的λDNA（50
mg/L、100 mg/L、200 mg/L）进行对比、分析，
得出所提取DNA的浓度。
1.2.3 凤仙花RAPD—PCR反应
反应总体积为20 µL，包括：5 mmol/L的dNTPs
0.8 µL，10×缓冲液2 µL，2 µmol/L的引物3 µL，
5 mg/L的模板DNA 1 µL，5×106 U/L的Taq酶0.25
µL，25 mmol/L的Mg2＋ 2.4 µL，无菌水10.55 µL，
反应混合物用20 µL石蜡油覆盖，在BIO—RAD公
司的PCR仪上进行扩增。RAPD扩增程序为：94 ℃
预变性5 min后进入扩增循环，94 ℃变性30 s，36
℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环后在72 ℃
延伸5 min，最后在4 ℃下保温。RAPD扩增产物用
1.5%的琼脂糖凝胶（含GoldView 50 µL/L）电泳
分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为75 V。
2 结果与分析
2.1 基因组 DNA 纯度的检测
所提取得基因组DNA用1%琼脂糖凝胶进行
电泳检测，结果如图1。从图中可看出，DNA呈一
条较整齐的亮带，无弥散现象，表明提取量较多，
DNA完整、无降解；点样孔无残留发亮的现象，
表明DNA纯度较高，糖类、酚类、单宁等杂质含
量较少。尽管所提取的基因组DNA中含RNA，但
对扩增结果无太大影响，可直接用于试验。

注：A 代表注入低能 P＋的植株，B 代表注入低能 N＋的植株，1、
2、3 分别代表 3 种注入剂量：1×1016⁄cm2、3×1016⁄cm2、5×1016⁄cm2
图 1 基因组 DNA 电泳检测结果
2.2 随机引物的筛选及 PCR 扩增
本试验选用上海生工公司的25个随机引物，
从中筛选出3个扩增条带清晰、反应结果稳定、重
复性较好的引物，分别为S27、S83、和S120。对7
个材料进行扩增的结果表明，7种供试材料都获得
了较好的谱带（见图2、图3、图4）。所筛选出的
引物共扩增出86条较清晰的谱带，分子量在350～
2 000 bp之间（见表1），其中23条为多态性谱带，
占总谱带数的26.7%。
表 1 3 种 RAPD 有效引物的序列及扩增结果
引物 碱基序列 扩增 带数
多态性条
带数
谱带分子量
范围/bp
S27 GAAACGGGTG 20 11 350～1 800
S83 GAGCCCTCCA 42 2 500～2 000
S120 GGGAGACATC 24 10 750～1 500
2.3 RAPD 扩增结果分析
由于同一引物在不同的材料上具有不同的带
型，因此，可以利用扩增出的多态性谱带来分析
不同种类、不同剂量低能离子的注入对凤仙花基
因组DNA的诱变效应。表2为本试验中3个引物对7
种凤仙花材料（其中包含一个对照品种）的扩增
情况。其中，“＋－”表示量差，“－”表示质差。

第 1 期 孙永健，等：低能离子注入凤仙花后 DNA 变异的 RAPD 分析 ·23·

注：A 代表注入低能 P＋的植株，B 代表注入低能 N＋的植株，1、
2、3 分别代表 3 种注入剂量：1×1016⁄cm2、3×1016⁄cm2、5×1016⁄cm2
图 2 引物 S27 的扩增结果

注：A 代表注入低能 P＋的植株，B 代表注入低能 N＋的植株，1、
2、3 分别代表 3 种注入剂量：1×1016⁄cm2、3×1016⁄cm2、5×1016⁄cm2
图 3 引物 S83 的扩增结果

注：A 代表注入低能 P＋的植株，B 代表注入低能 N＋的植株，1、
2、3 分别代表 3 种注入剂量：1×1016⁄cm2、3×1016⁄cm2、5×1016⁄cm2
图 4 引物 S120 在样品间的扩增结果
引物S83的扩增结果表明，N＋的诱变效应强
于P＋，因为在c位置上只有注入N＋的材料中才扩
增出了多态性谱带；引物S120在e位置的扩增结果
也可以说明N＋的诱变效应强于P+，因为注入N＋的
植株的多态性谱带全部出现了质差的现象；引物
S27在b位置和引物S120在d位置的扩增结果说明，
注入的剂量越大，产生的诱变效应越明显；引物
S27在a位置的扩增结果则说明，注入离子的剂量
要保持在一定范围内才会产生较大的诱变效应，
因为随着注入剂量的增大，多态性谱带由质差变
为量差。通过比较各处理与对照间的多态性谱带，
可以发现：注入低能离子可以使凤仙花在DNA水
平上发生变异。
表 2 不同处理间 RAPD 谱带的比较
RAPD 标记 CK A1 A2 A3 B1 B2 B3
S27-a ＋ ＋－ － ＋－ ＋ － ＋－
S27-b ＋ ＋ ＋－ － ＋ ＋ ＋－
S83-c － － － － － ＋ ＋
S120-d ＋ ＋ ＋ ＋－ ＋ ＋ －
S120-e ＋ ＋ ＋ ＋－ － － －
注：A 代表注入低能 P＋的植株，B 代表注入低能 N＋的植株，1、
2、3 分别代表 3 种注入剂量：1×1016⁄cm2、3×1016⁄cm2、5×1016⁄cm2
3 讨论
关于 RAPD 的稳定性，学者们曾提出质疑，
主要是认为标记稳定性差和非特异性扩增试验的
重复性不好。但同时也有研究表明，在 RAPD 标
记程序，如扩增条件、反应体系等标准化后，RAPD
标记的稳定性便能充分体现了[13]。本研究经过了
2 次重演性试验，也发现只要严格控制反应条件，
RAPD 标记技术就可以得到较好的重复结果，是
一种相对有效、方便、成本较低的品种鉴定方法。
RAPD技术是在DNA水平上直接对基因组的
多态性进行检测，检测区域几乎覆盖了整个基因
组，加之随机引物的无限性，因此，可以检测出
不同品种或处理间的微小差异。当然，DNA 水平
上的信息本身是不能满足对种质鉴定的所有要求
的，分子水平的信息必须同形态学、生理学等性
状相结合才能对种质资源做出客观的认识。对于
这一点，笔者已对上述不同处理的植株在形态学
上做了观察与研究，结果发现，离子注入后，植
株在高度、节间长度、茎的相对粗度、叶片性状
及成花特性上与对照产生了明显的差异。
在对 RAPD 多态性谱带进行统计时发现 2 种
现象，第一种是出现了差异谱带，第二种是虽然
出现相同迁移率的谱带，但荧光强度有强弱之分，
即产生了所谓的质差与量差。质差的出现可能是
由于与引物互补结合的模板 DNA 的位点序列发
生了改变，导致互补位点增加或减少，从而使扩
增片段数增加或减少；也有可能是由于互补位点
间的 DNA 发生了插入或缺失，使扩增产物的大小
发生了变化；或者可能是插入片段过大，无法扩
增。量差的出现可能是由于在多拷贝引物结合位
点上，某些位置的碱基发生了突变，导致引物结
合量减少，扩增出的 DNA 量也随之减少，从而在
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电泳后表现为谱带变浅。总之，低能离子注入诱
变的分子基础在于：基因组 DNA 发生了插入、缺
失或点突变，并由此影响了基因组的结构与功能、
基因表达等，进而影响了细胞的功能，并最终导
致生理生化及生长发育的变化[14]。本试验检测出
的 DNA 的变异，可能是前期对于这几种处理植株
在形态学研究所得出的与对照植株差异以外的其
它性状的变异，也有可能是基因组上的重复序列、
非编码序列发生了变异，或是发生了一些无义突
变。这还需要后续的一系列研究，才能得出最终
结论。
本试验结果表明，低能离子注入凤仙花种子
可以引起基因组DNA的变异，RAPD分子标记技
术也可用于分析凤仙花基因组的变异。两种方法
的有效结合将为花卉产业的发展开辟一条新的育
种思路，提供一种新的育种手段。

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“抗旱抗盐高产油树工程育种”项目通过结题验收
日前，受天津市科学技术委员会委托，由天津市高新技术成果转化中心组织专家对我院机电工程系
张伟玉教授主持的天津市自然科学基金项目“抗旱抗盐高产油树工程育种”进行了结题验收。专家组在
听取了课题组的工作报告和技术报告、审阅了相关材料后做出结论如下。
项目组通过引种、资源调查和收集、选种、育种和扦插、组培快繁等方法和手段，研究了大量野生
的、耐瘠薄的能源植物，培育出了 2 种适合天津地区发展的，可以在盐碱地和荒地上种植的，抗旱、抗
盐、产油量高的油树品种；建立了高产、高抗逆能源植物的筛选体系、优良能源植物的评价体系、能源
植物生物技术多倍体育种体系和高效的能源植物苗木繁殖技术体系；通过多倍体育种技术，首次培育出
了多倍体麻风树和多倍体银合欢，建立了文冠果能源植物转基因体系和银合欢再生及快繁体系；申请了
“离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法”和“一种麻风树的高效离体再生方法”2 项发明专利。
验收委员会认为：成果中多倍体麻风树、银合欢育种技术、文冠果耐盐基因转化技术达到国际领先
水平，银合欢再生和快繁技术达到国内领先水平，故建议将该项目的成果尽快产业化。
（科技处）