全 文 ：·基础研究 ·
氮离子注入对仿栗种子某些生理特性的影响＊
陆　佳 1 , 李志辉 1 , 张　斌 1 , 李昌珠 2 , 欧日明 1
(1.中南林业科技大学资源与环境学院 , 湖南 长沙 410004;2.湖南省林业科学院 , 湖南 长沙 410004)
摘　要:采用不同剂量的氮离子注入仿栗种子内 ,研究氮离子束注入仿栗种子后对其丙二醛(MDA)、超氧化物歧
化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和硝酸还原酶(NR)的影响。结果表明:氮离子注入仿栗种子后 , MDA含量明显降
低;SOD和 CAT活性随着离子束剂量的增加 ,均呈现先下降再上升后又下降的趋势 , 且均在 8.6×1015 N+/cm2
剂量下达到峰值;低剂量 N+注入能提高硝酸还原酶的活性 , 高剂量下 NR活性受到一定的抑制。
关键词:仿栗;氮离子注入;生理特性
中图分类号:S330.2;S473
文献标识码:A
文章编号:1007-7146(2008)03-0323-04
EfectsofNitrogenIonInjectiononSomePhysiological
CharactersofSloaneahemsleyanaSeed
LUJia1 , LIZhi-hui1 , ZHANGBin1 , LIChang-zhu2 , OURi-ming1
(1.CentralSouthUniversityofForestryandTechnology, Changsha410004, Hunan, China;
2.HunanAcademyofForestry, Changsha410004, Hunan, China)
Abstract:DifferentdosesofnitrogenionwereinjectedintotheSloaneahemsleyanaseed.Theefectsonmalondiade-
hyde(MDA)content, superoxidedismutaseactivity(SOD), catalaseactivity(CAT)andnitratereductaseactivity(NR)
werestudied.Theresultsindicate:malondiadehydecontentoftheseedwithtreatmentsaremuchlowerthanthoseofthe
control;alongwithdosesofnitrogenionincreasing, activityofSODandCATdeclineatthebeginning, butthenbecome
toascend, anddeclinefinally, itreachthepeakvalueatdosesof8.6×1015 N+/cm2.ThetreatmentoflowdosageN+
ioncouldincreasetheNRactivityofSloaneahemsleyanaseed, thetreatmentofhighdosageN+ ioninhibitthetheNR
activityofSloaneahemsleyanaseed.
Keywords:Sloaneahemsleyana;nitrogenioninjection;physiologicalcharacters
　　仿栗 (Sloaneahemsleyana)属于杜英科猴欢喜
属 ,为常绿乔木 ,分布于我国四川 、云南 、湖北西部及
湖南等地 ,生长于山谷溪边土壤潮湿的地方。其树
型高大 、枝叶繁茂 ,观赏价值高;同时其木材呈白色 ,
纹理直而细嫩 ,可供建筑 、家具等用材。种子可榨
油 ,可作为一种新的油脂资源加以利用。目前 ,研究
也主要集中在种子含油率方面 ,而对种子生理活性
方面的研究还未见报道。
离子束在生物技术上的应用是一个全新的研究
领域 ,是育种方法学的重要创新 ,离子注入植物不仅
损伤轻 、突变率高 、突变图谱广 ,而且可遗传突变体
稳定快 ,容易产生新基因材料 ,丰富种质资源 ,同时
第 17卷第 3期
2008年 6月 　　　　　　　　　　
激　光　生　物　学　报
ACTA　LASER　BIOLOGY　SINICA　　　　　　　　　　　Vol.17No.3Jun.2008
＊ 收稿日期:2007-08-02;修回日期:2007-12-12
基金项目:“十一五”科技部国际合作重点项目(2006DFA63230)
作者简介:陆佳(1984— ),女 ,湖南南县人 , 硕士研究生。研究方向为森林培育学。 (电话)13574100930;(电子邮
箱)lujia19842002@126.com
为林木育种研究提供实例。水稻 、小麦 、棉花和番茄
等作物和微生物育种上得到应用 [ 1-5] 。但在木本植
物方面的研究还未见报道 ,为此 ,本研究以仿栗种子
为研究对象 ,进行了氮离子注入对仿栗种子某些生
理特性的影响实验 ,旨在为离子注入技术在仿栗育
种上的应用提供理论依据。
1　材料和方法
1.1　供试材料
选用张家界国家森林公园武陵源风景区的仿栗
种子。
1.2　离子注入处理
氮离子注入种子的处理在中南林业科技大学森
林培育实验室进行 。采用 LCD-1000型离子注入机 ,
种子分两批进行处理。
第一批种子注入氮离子能量为 35 keV/10 ma,注
入剂量分别为 4.6 ×1015 N+ /cm2 、8.6 ×1015 N+ /cm2 、
1.74×1016 N+ /cm2 ,脉冲次数分别为 40次 ,未处理的
种子作为对照 CK。
第二批种子注入的氮离子能量为 35 keV/10 ma,
注入剂量分别为 3 ×1016 N+ /cm2 、6 ×1016 N+ /cm2 、
9 ×1016 N+/cm2 ,脉冲次数分别为 40次 ,未处理的种
子作为对照(CK)。
1.3　生理指标测定
测定指标包括 SOD活性 、CAT活性 、MDA含量
和 NR活性 ,每个指标重复测 3次 ,取均值。
1.3.1　酶液的制备　每个处理分别称取仿栗种子
0.2 g,放入置有冰浴的研钵中 ,加入少量 0.05 mol/L
pH7.8磷酸缓冲液及石英砂 ,研磨成匀浆 ,将匀浆转
入 10 mL的离心管中 ,用磷酸缓冲液定容到 7 mL,在
8 500 r/min条件下离心 20 min,取上清液定容到 10
mL,即为酶粗提液 ,用于测定 SOD、CAT、MDA、NR活
性。
1.3.2　SOD活性测定 　参照 Stewert和 Bewley[ 6]
抑制 NBT光化还原的方法。反应液总体积 3 mL,其
中含有 0.05 mol/L磷酸缓冲液 1.5 mL, 130 mmol/L
甲硫氨酸 0.3 mL, 75 μmol/L氮兰 四唑 0.3 mL,
100 μmol/LEDTA-Na2液 0.3 mL, 20 μmol/L核黄素
0.3 mL,蒸馏水 0.25 mL和酶液 0.05 mL,在 4 000
Lx日光下反应 20 min,以缓冲液代替酶液作为对照 ,
在 560 nm波长下比色。以 SOD抑制氮兰四唑光还
原 50 %时所需酶液量为一个酶活力单位。
1.3.3　CAT活性测定　参照李柏林和梅慧生 [ 7]的
方法测定 ,以每克鲜样每分钟内分解 H2O2的毫克数
为 1个酶活力单位 。统一提取酶液 2.5 mL,对照加
煮死酶液 2.5 mL,再加入 2.5 mL0.1 mol/LH2O2 ,
同时计时 ,于 30 ℃恒温水浴中保温 10 min,立即加
入 10 % H2SO4 , 2.5 mL。用 0.1 mol/LKMnO4标准
溶液滴定 ,至出现粉红色 (在 30 min内不消失 )为终
点 。酶活性以每克鲜重样品 1 min内分解 H2O2 的毫
克数表示 。
1.3.4　MDA含量的测定　参照 Heath等 [ 8]的硫代
巴比妥酸 (TBA)比色法。取统一提取酶液 2 mL,加
0.67 %TBA2 mL, 混合后在 100 ℃水浴上煮沸
30 min,冷却后再离心 1 次。分别测定上清液在
450 nm、532 nm和 600 nm处的吸光度值 ,按公式 C/
umol/L=6.45(A532 -A600)-0.56 A450算出 MDA浓
度 ,再算出单位鲜量组织中的 MDA含量(μmol/g)。
1.3.5　硝酸还原酶的测定 　取粗酶液 0.4 mL于
10 mL试管中 ,加入 1.2 mL0.1 mol/LKNO3 ,磷酸缓
冲液和 0.4 mLNADH溶液 ,混匀 ,在 25 ℃水浴中保
温 30 min, 对 照不 加 NADH溶 液 , 而以 0.4 mL
0.1 mol/LpH7.5磷酸缓冲液代替。保温结束后立
即加入 1 mL磺胺溶液终止酶反应 ,再加 1 mL萘基
乙烯胺溶液 ,显色 15 min后于 4 000r/min下离心
5 min,取上清液在 540 nm下比色测定吸光度 [ 9] 。
图 1　离子注入对仿栗种子 SOD活性的影响
Fig.1　EfectsofN+ionimplantationontheactivityof
SODofS.hemsleyanaseeds
2　结果与分析
2.1　不同离子束剂量处理对仿栗种子 SOD活性
的影响
实验结果表明 ,随着离子束剂量的增加 ,仿栗种
子内 SOD酶活性呈现先降低后上升而后又降低的趋
势 (图 1),当离子束剂量达到 4.6 ×1015 N+/cm2 ,
SOD酶活性比对照下降了 86 %,当剂量达到 8.6 ×
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10
15 N+/cm2时 ,仿栗种子内 SOD酶活性比对照上升
了 59.7 %;当剂量超过 8.6 ×1015 N+ /cm2 时 ,酶活
性又逐渐下降 ,说明低剂量和高剂量注入对仿栗种
子 SOD酶活性具有抑制作用 , 而中等剂量注入对
SOD酶活性具有刺激作用 。
图 2　离子注入对仿栗种子 CAT活性的影响
Fig.2　EfectsofN+ ionimplantationontheactivityof
CATofS.hemsleyanaseeds
2.2　不同离子束剂量处理对仿栗种子 CAT活性
的影响
实验结果表明 ,随着离子束剂量的增加 ,仿栗种
子内 CAT酶活性与 SOD酶呈现相似的变化趋势 ,即
先降低后增加再降低 (图 2),当离子束剂量达到 4.6
×1015 N+ /cm2 , CAT酶活性出现低谷;当剂量达到
8.6×1015 N+ /cm2 时 ,仿栗种子内 CAT酶活性出现
一个峰值;当剂量超过 8.6×1015 N+/cm2时 ,酶活性
又逐渐下降 ,但变幅不大。
图 3　离子注入对仿栗种子 MDA含量的影响
Fig.3　EfectsofN+ionimplantationontheMDAcon-
tentofS.hemsleyanaseeds
2.3　不同离子束剂量处理对仿栗种子 MDA含量
的影响
MDA是脂质过氧化作用的终产物 , MDA含量表
示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度 ,是逆境生理
主要指标。从图 3可以看出 , N+注入仿栗种子后丙
二醛的含量较无离子处理的种子 (即空白对照 CK)
明显减少 ,说明氮离子注入削弱了脂质过氧化作用。
但随着离子束剂量的增加 ,种子中丙二醛的含量又
呈上升的趋势。说明高剂量的氮离子注入破坏了细
胞的调节功能 ,导致 MDA积累增加 ,这与 SOD和
CAT在高剂量下酶活性下降相一致。
图 4　离子注入对仿栗种子 NR活性的影响
Fig.4　EffectsofN+ionimplantationontheactivityof
NRofS.hemsleyanaseeds
2.4　不同离子束剂量处理对仿栗种子 NR活性的
影响
硝酸还原酶是植物体内硝酸盐同化过程中的一
种关键酶 ,它将 NO3-还原为 NH4 + ,而 NH4 +既是非
蛋白氮 ,又与合成蛋白质有关 ,从而提高了植物体内
含氮化合物的含量 ,以抵御逆境伤害。实验结果表
明 ,不同剂量 N+注入后仿栗种子中硝酸还原酶活性
较 对 照 均 有 不 同 程 度 的 提 高 , 在 离 子 束
3 ×1016 N+ /cm2剂量下其活性出现一个峰值 ,随着离
子束剂量的增加 ,硝酸还原酶活性呈下降趋势。
3　讨论
离子束注入生物体在其经过的径迹周围产生大
量的活性氧自由基 ,其中包括 O2-、OH、H2O2 等。在
逆境下 ,生物自由基产生与清除的平衡被打破 ,生物
自由基的浓度上升 [ 10] ,而细胞膜内含有大量的不饱
和脂肪酸 ,在生物自由基或活性氧的作用下易诱发
脂质过氧化作用 ,膜的通透性增加 ,离子大量外渗 ,
严重时会导致植物死亡 [ 11] 。 SOD和 CAT是生物体
中清除自由基的主要酶系 , SOD催化 O2-分解后将产
生大量的 H2O2 ,而 CAT是清除细胞内 H2O2的酶 ,并
且在阻断自由基链式反应中起着承上启下的作
用 [ 12] 。本研究证明:在 8.6 ×1015 N+/cm2 剂量下
SOD活性提高 ,而在大于 8.6 ×1015 N+ /cm2剂量下
SOD活性逐渐下降。说明离子辐射可诱导植物体内
活性氧自由基的增加 ,植物通过提高其体内清除活
性氧自由基系统的酶活力来抵抗活性氧自由基对植
325第 3期　　　　　　　　　　　陆　佳等:氮离子注入对仿栗种子某些生理特性的影响 　　　　　　　　　　
物的伤害 。在 8.6×1015 N+ /cm2剂量下 SOD和 CAT
活力都达到峰值 ,而当离子剂量过大时 ,细胞损伤严
重 ,保护酶活性受到抑制。但在 4.6 ×1015 N+ /cm2 相
对低剂量注入下仿栗种子中 SOD和 CAT活性均比
对照低 ,这与前人的报道不大相吻合 ,分析其原因之
一可能是因为植物材料的差异 ,二可能是离子注入
剂量的选择偏小还未达到刺激效应 。
MDA已被确认为脂质过氧化物 ,其含量多少是
脂质过氧化作用强弱的一个重要指标。脂质过氧化
作用是指细胞膜系统组分脂质分子中不饱和脂肪酸
氧化降解的链式反应 。脂质过氧化终产物为丙二
醛 。丙二醛和自由基可与蛋白结合 ,导致蛋白和酶
交联 、聚合 ,丧失活性。同时改变了膜结构 ,使细胞
膜产生变性 ,最终导致细胞损伤 ,影响膜的正常生理
功能。用一定剂量的 N+离子注入仿栗种子 ,仿栗种
子中 MDA含量降低 ,说明离子注入起始阶段生物体
自身修复系统发挥了作用 ,脂质过氧化作用被削弱 。
但随着离子剂量的增加 ,其含量呈现上升趋势 ,说明
高剂量氮离子注入仿栗种子后 ,使膜的通透性增加 ,
离子大量外渗 ,高剂量的氮离子注入破坏了细胞的调
节能力 ,膜系统的正常功能被破坏 ,因而膜质过氧化产
物积累。虽然离子束剂量达到 4.6 ×1015 N+/cm2 时
MDA含量相对较低 ,但最适合剂量的离子注入尚需
进一步研究 。
硝酸还原酶是植物体内硝酸盐同化过程中的一
种关键酶 ,它在植物氮代谢过程中起着极为重要的
作用 ,其活性大小对于植物蛋白质 、氨基酸等含氮化
合物的合成有重大影响 [ 13] 。实验结果表明 ,低剂量
N+注入能提高硝酸还原酶的活性 ,促进氮代谢 ,而
当离子剂量过大时 ,细胞损伤严重 ,硝酸还原酶活性
受到抑制。
总之 ,不同剂量的氮离子注入对仿栗种子的生
理特性有着不同程度的影响 。适量的离子注入对于
增强仿栗的抗逆能力有良好的作用 ,但氮离子注入
对仿栗种子生理特性的影响能否稳定遗传 ,尚有待
进一步研究 。
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