全 文 ：食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2015年 第40卷 第05期生物工程
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收稿日期：2015-01-19 *通讯作者
基金项目：国家自然科学基金项目(31160312)。
作者简介：王敏(1989—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏。
王 敏，冯作山，黄 伟，刘峰娟，白羽嘉*
(新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)
摘要：以阿魏侧耳(Pleurotus ferulae lanzi)CGMCC 5.774为实验材料，采用同源基因克隆方法克隆
漆酶(Laccase，Lacc)基因。根据刺芹侧耳漆酶基因序列(AM774000.1、DQ234990.1)设计阿魏侧耳
漆酶基因扩增引物，以阿魏侧耳cDNA为模板克隆漆酶基因CDS区序列，获得2条阿魏侧耳漆酶
基因序列分别命名为PFLaccA(Genbank登录号KP246838)和PFLaccB(Genbank登录号KP246839)。
PFLaccA(KP246838)和PFLaccB CDS(KP246839)序列长度均为1602 bp，与刺芹侧耳漆酶全CDS
区相似性为97%，阿魏侧耳漆酶基因与刺芹侧耳漆酶基因具有高度的同源性。PFLaccA CDS
和PFLaccB CDS序列均为全长的开放阅读框ORF，编码蛋白质长度为533 aa。PFLaccA蛋白和
PFLaccB蛋白均包含长度为20 aa的信号肽和Cu-oxidase_3、Cu-oxidase、Cu-oxidase_2 3个结构
域；PredictProtein对PFLaccA和PFLaccB二级结构进行分析，并通过SWISS-MODEL预测了该酶的
三维结构。
关键词：阿魏侧耳；漆酶；基因克隆
中图分类号：TS 201.2+5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)05-0014-06
Cloning of laccase gene from the Pleurotus ferulae lanzi
WANG Min, FENG Zuo-shan, HUANG Wei, LIU Feng-juan, BAI Yu-jia*
(College of Food Science and Pharmaceutical Science, Xingjiang Agricultural University,
Urumqi 830052)
Abstract: Laccase gene was cloned from experiment materials of Pleurotus ferulae lanzi (CGMCC
5.0774). Pleurotus ferulae laccase gene amplifi cation primers was designed according to the sequence
of Pleurotus eryngii laccase gene (AM774000.1, DQ234990.1). The region of laccase CDS was cloned
according to the template of Pleurotus ferulae cDNA. Both of the sequence length of PFLaccA CDS
(KP246838) and PFLaccB CDS (KP246839) were 1602 bp, PFLaccA CDS and PFLaccB CDS were both
full-length sequences of the open reading frame ORF, encoding a protein length of 533 aa. Both proteins
were contain an amino-terminal signal peptide with the size of 20 amino acid residues and the domain
of Cu-oxidase_3, Cu-oxidase, Cu-oxidase_2 for PFLaccA and PFLaccB. Laccase Gene from Pleurotus
ferulae has high homology with laccase of Pleurotus eryngii. Furthermore analysised secondary structures
of PFLaccA and PFLaccB, and predicted the three-dimensional structure of the enzymes by SWISS-
MODEL.
Key words: Pleurotus ferulae lanzi; laccase; gene cloning
阿魏侧耳漆酶基因的克隆
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.05.003
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食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY2015年 第40卷 第05期 生物工程
阿魏侧耳(Pleurotus ferulae lanzi)，是一种珍贵
的食药用大型真菌[1]，作为腐生异养型真菌，为满
足自身生长发育需要，需将大分子碳水化合物、
蛋白质等分解为小分子的营养物质，进行吸收和
转化。各种大分子物质的分解利用和转化过程与
菌丝分泌漆酶密切相关[2]。
真菌漆酶是多铜酚氧化酶，与真菌的营养代
谢、原基形成和子实体发育密切相关[3]，它参与呼
吸过程中电子的传递，促进呼吸过程正常进行，
为真菌的生命活动提供能量[4]。研究发现，在香菇
和平菇袋装栽培过程中添加漆酶制剂，有利于菌
丝扭结形成子实体[5]。Zhao等[6]克隆了香菇中漆酶
基因lac1，通过与其他真菌漆酶编码蛋白比较后
发现，该漆酶的铜接合域是保守的，研究表明漆
酶对香菇子实体的形态发育有一定促进的作用。
Chen等[7]从草菇中克隆了新的漆酶基因lac4，该漆
酶基因在子实体形成时强烈表达，推测该漆酶基
因可能与原基形成及子实体发育相关。国内外学
者对刺芹侧耳漆酶活性[8]、漆酶基因的克隆及表
达[9-10]做了深入的研究，获得了刺芹侧耳漆酶的
lac3、lac4、pel4、ery3、ery4等基因。阿魏侧耳是
刺芹侧耳托里阿魏变种，以刺芹侧耳漆酶基因序
列同源克隆阿魏侧耳基因，补充了阿魏侧耳漆酶
的相关研究，为进一步研究阿魏侧耳漆酶基因的
生物学功能研究奠定基础。该研究丰富了真菌漆
酶基因方面的研究，具有一定的科学意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
阿魏侧耳(Pleurotus ferulae lanzi)CGMCC
5.774：中国普通微生物菌种保藏管理中心。
真菌总RNA快速抽提试剂盒(SK8629 )、
UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(SK1131)、DNA
Marker、4S Red Plus Nucleic Acid Stain(NB6695)、
T-载体pcr产物克隆试剂盒(SK2211)、感受态细胞
DH5α、一步法制备感受态细胞溶液(SK2301)、
6×DNA Loading Dye：生工生物工程(上海)有限
公司；Thermo Scientific Rvertaid first Strand cDNA
Synthesis Kit：美国赛默飞世尔科技公司；LA Taq
DNA聚合酶：宝生物工程(大连)有限公司；琼脂
糖：西班牙BIOWEST公司；三羟甲基氨基甲烷、
冰乙酸、盐酸、EDTA-Na2：分析纯，国药集团。
1.2 仪器与设备
LDZX-50KBS高温灭菌锅：上海申安医疗器
械公司；JH-DS净化工作台、MHP-250智能霉菌
培养箱：上海鸿都电子科技有限公司；Heraeus
Biofuge Primo R冷冻离心机：美国赛默飞世尔科
技公司；T-100梯度PCR仪、PowerPac Universal电
泳仪、Sub Cell GT水平电泳槽：美国伯乐公司；
WD-9403C紫外仪：北京市六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 阿魏侧耳漆酶基因扩增引物设计 参考刺芹
侧耳漆酶基因序列(AM774000.1、DQ234990.1)设
计阿魏侧耳漆酶基因扩增引物(表1)。
表1 阿魏侧耳漆酶基因 PCR 扩增引物
引物 引物方向 引物序列(5’-3’)
退火
温度/℃ 参考序列
PFLacc
A
F ATGGCGGTTGCATTCATTG 57 AM774000.1R TCATGCCTTCAGTGGCGCAT
PFLacc
B
F ATGGCGGTTGCATTCATTG 59 DQ234990.1R TCATGCCTTCAGTGGCGCAGG
1.3.2 阿魏侧耳总RNA提取 取阿魏侧耳原基组织
液氮研磨，按柱式真菌总RNA抽提纯化试剂盒方
法提取总RNA。
1.3.3 cDNA序列合成 cDNA第一链合成按试剂盒
说明书进行。
1.3.4 阿魏侧耳漆酶基因cDNA序列PCR扩增 PCR
反应体系总体积25 μL，包括：阿魏侧耳cDNA
模板1 μL，上下游引物(10 μmo l / L )各0 . 5
μL，dNTP(10 mmol/L)0.2 μL，2×GC Buffer
I 12.5 μL，ddH2O 10.1 μL，LA TaqDNA聚合
酶(5 U/μL)0.2 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 3
min；94 ℃ 30 s；Tm(℃ )30 s，72 ℃ 1 min(33
个循环)；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂
糖凝胶电泳检测。PCR产物电泳后采用试剂盒
回收纯化DNA。
连接到pMD18-T载体，连接反应体系10.0
μL，包括Solution I 4 μL，PCR产物5 μL，
pMD18-T 0.2 μL，H2O 0.8 μL，16 ℃连接过夜。
转化感受态细胞，倒置培养过夜。挑取阳性菌
落，委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。
1.3.5 生物信息分析 核酸生物信息分析：引物
设计使用软件Primer Premier5.0，序列拼接及比对
分析使用DNAMAN v7.0软件，序列检索通过在线
NCBI进行，进化树构建使用MEAG 6.05软件。
蛋白生物信息分析：ORF分析使用ORF
Finder在线分析，信号肽的预测分析使用SignalP
4 . 1 S e r v e r在线进行，蛋白质结构预测使用
SMART(Simple Modular Architecture Research Tool，
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SMART，http://smart.embl-heidelberg.de/)在线分
析，蛋白质结构域使用Pfam 27.0(March 2013，
14831 families，http://pfam.xfam.org/)进行在线
分析，三维结构预测使用SWISS-MODEL(http://
swissmodel.expasy.org/interactive)。
2 结果与分析
2.1 RNA提取结果
为模板，克隆全CDS区序列。阿魏侧耳2对引物
PFLaccA、PFLaccB分别扩增出1600 bp的DNA片
段，克隆测序后拼接获得阿魏侧耳漆酶PFLaccA
CDS序列和阿魏侧耳漆酶PFLaccB CDS序列长度
均为1602 bp的DNA序列(图2)。BLASTn检索鉴
定与刺芹侧耳漆酶完整CDS序列(AM774000.1、
DQ234990.1)相似性为97%。
图1 阿魏侧耳RNA提取结果
注：M为DNA标准分子质量(bp)；A为PFLaccA；B为PFLaccB。
图2 阿魏侧耳漆酶cDNA PCR扩增结果
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表2 PFLaccA和PFLaccB在NCBI中的检索结果
蛋白名称 登录号 基因名称 Max score 覆盖度 相似度
PFLaccA
DQ234990.1 Pleurotus eryngii laccase precursor (pel4) mRNA，complete cds 2693 100% 97%
AM774000.1 Pleurotus eryngii mRNA for laccase (ery4 gene) 2676 100% 97%
FJ231091.1 Pleurotus eryngii laccase mRNA，complete cds 2660 100% 97%
AJ005018.1 Pleurotus ostreatus mRNA for laccase (poxa1b gene) 2455 100% 94%
AB551114.1 Pleurotus ostreatus laccaseA mRNA for laccase，complete cds，strain：KCTC 26133 2427 96% 95%
PFLaccB
DQ234990.1 Pleurotus eryngii laccase precursor (pel4) mRNA，complete cds 2693 100% 97%
AM774000.1 Pleurotus eryngii mRNA for laccase (ery4 gene) 2665 100% 97%
FJ231091.1 Pleurotus eryngii laccase mRNA，complete cds 2660 100% 97%
AJ005018.1 Pleurotus ostreatus mRNA for laccase (poxa1b gene) 2455 100% 94%
AB551114.1 Pleurotus ostreatus laccaseA mRNA for laccase，complete cds，strain：KCTC 26133 2422 96% 95%
注：只列出Max score＞1000的检索结果，依据Max score由高到低进行排序。
BLASTn鉴定阿魏侧耳漆酶核酸序列(表 2)。
阿魏侧耳漆酶基因PFLaccA与刺芹侧耳漆酶基
因(DQ234990.1、AM774000.1、FJ231091.1)相似
性为97%，与糙皮侧耳漆酶基因(AJ005018.1、
AB551114.1)相似性分别为94%和95%；阿魏
侧耳漆酶基因PFLa c cB与刺芹侧耳漆酶基因
(DQ234990.1、AM774000.1、FJ231091.1)相似
性为97%，与糙皮侧耳漆酶基因(AJ005018.1、
AB551114.1)相似性分别为94%和95%。
2.2 阿魏侧耳漆酶PFLaccA和PFLaccB CDS序列
的克隆
根据刺芹侧耳漆酶基因序列的保守型设计
阿魏侧耳漆酶引物(表1)，以阿魏侧耳原基cDNA
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根据PFLaccA CDS和PFLaccB CDS序列
BLASTn搜索同源性较高的核酸序列，包括：
刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、糙皮侧耳(Pleurotus
ostreatus)。构建上述物种的核苷酸序系统进化树
(图3)，阿魏侧耳漆酶和刺芹侧耳漆酶聚为一类，
糙皮侧耳漆酶基因Pleurotus ostreatus laccase gene
pox3(pox3)和Pleurotus ostreatus poxA1b laccase聚
为一类，Pleurotus ostreatus laccaseA与Pleurotus
ostreatus laccase(poxa1b gene)聚为一类。对比阿魏
侧耳、刺芹侧耳与糙皮侧耳漆酶，阿魏侧耳与刺
芹侧耳漆酶同源性高于阿魏侧耳与糙皮侧耳漆酶
的同源性。
注：进化树构建方法Neghbor-Joining Tree，p-distance。
图3 阿魏侧耳漆酶 CDS 区核苷酸序列的系统进化树
图4 阿魏侧耳漆酶 CDS 与刺芹侧耳CDS序列比对
1MFVSPUVT@FSZOHJJ@MBDDBTF@ FSZ@HFOF
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PFLaccA CDS和PFLaccB CDS存在碱基差异(图
4)，主要表现为转换(G-C/A-G)和颠换(T-C/T-G)，
未出现碱基缺失和插入。参考刺芹侧耳序列进一
步比对，发现阿魏侧耳漆酶基因CDS与刺芹侧耳
漆酶基因CDS(DQ234990.1、AM774000.1)核苷酸的
差异表现为转换和颠换。
2.3 阿魏侧耳漆酶蛋白预测及分析
使用NCBI中ORF Finder软件对阿魏侧耳漆
酶基因序列分析，阿魏侧耳PFLaccA CDS序列和
PFLaccB CDS序列包含起始密码子ATG和终止密
码子TGA，为全长的开放阅读框ORF(Open reading
frame，ORF)，编码蛋白质长度为533 aa，阿魏侧
耳PFLaccA和PFLaccB两者相似性为99%。
2.4 PFLaccA和PFLaccB蛋白序列信号肽预测
分析
在线SignalP 4.1 Server对蛋白序列信号肽
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 2015年 第40卷 第05期生物工程
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进行预测分析(图5、图6)，PFLaccA和PFLaccB
在1~20 aa序列S值较高(S-sco re )，该氨基酸
序列预测为信号肽。PFLac cA信号肽序列为
MAVAFIALVSVALALVRVEA，PFLaccB信号肽序
列为MAVAFIALVSLALALVRVEA，比较发现第11
个氨基酸残基(由Val变成Leu)。参考比对刺芹侧耳
蛋白(ABB30169.1、CAO79915.1)信号肽发现，4个
蛋白的信号肽在第10个和第11个氨基酸残基存在
差异。对比CDS序列分析，发现这种差异是由于
核苷酸碱基30、33发生改变引起的。
信号肽假说认为蛋白质在核糖体上进行合
成，N-末端带有疏水氨基酸残基的信号肽引导
核糖体定位于内质网通道上，并牵引新合成的多
肽通过内质网通道，随后被信号肽酶水解，蛋白
质被释放到内质网腔内，最终由转运小泡转运
至胞外。翻译结束后，核糖体亚基解聚、孔道消
失，内质网膜又恢复原先的脂双层结构[11-12]。阿
魏侧耳和刺芹侧耳漆酶都含有信号肽，相似性为
96.15%，漆酶最终分泌到胞外，参与木质素的降
解代谢。
2.5 PFLaccA和PFLaccB编码蛋白序列分析
使用SMART在线对编码蛋白序列进行分析，
PFLaccA和PFLaccB均包含一个长度为20 aa(氨基
酸残基1～20 aa)的信号肽及蓝色多铜氧化酶家族
(Pfam：Cu-oxidase_3、Cu-oxidase、Cu-oxidase_2)
结构域。
漆酶(EC1.10.3.2)属蓝色多铜氧化酶家族(Multi
copper oxidase，MCO)。利用Pfam 27.0对阿魏侧耳
PFLaccA和PFLaccB的结构域Cu-oxidase_3、Cu-
oxidase和Cu-oxidase_2进行分析(表3)，PFLaccA、
PFLaccB与ABB30169.1、CAO79915.1同属于蓝多
铜氧化酶蛋白家族，利用铜离子特有的氧化还原
能力，对还原性底物进行单电子氧化，将氧气还
原成水。阿魏侧耳与刺芹侧耳漆酶蛋白具有高度
4D
PS
F
1PTJUJPO
.7 * - 7 4 - - - 737& 4 * ( 1 3(5 - / * /,7 * 2 1 %( 4 3 4 7- (( 4 : 1 ( 1 - * ,(,5 (%3 2 * /77/
$TDPSF
4TDPSF
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图6 PFLaccB信号肽预测分析
图5 PFLaccA信号肽预测分析
表3 阿魏侧耳漆酶结构域分析
蛋白名称 家族 描述
Envelope Alignment HMM HMM长度 E-值
起始 终止 起始 终止 起始 终止
PFLaccA
Cu-oxidase_3
多铜氧化酶家
族
29 151 30 150 2 117 118 6.9e-38
Cu-oxidase 162 303 162 303 1 159 159 4e-45
Cu-oxidase_2 365 491 366 489 2 136 138 2.8e-36
PFLaccB
Cu-oxidase_3
多铜氧化酶家
族
29 151 30 150 2 117 118 1.8e-37
Cu-oxidase 162 303 162 303 1 159 159 4e-45
Cu-oxidase_2 365 491 366 489 2 136 138 2.8e-36
相似的结构域。
2.6 PFLaccA和PFLaccB结构分析
通过PredictProtein[13-15]对PFLaccA和PFLaccB
的蛋白质序列进行二级结构在线分析：PFLaccA
二级结构主要是无规则卷曲，含量高达69.98%；
其次是β-折叠含25.14%；α-螺旋含4.88%。
PFLaccB二级结构主要是无规则卷曲，含量高达
71.29%；其次为β-折叠含24.77%；α-螺旋含
表4 PFLaccA和PFLaccB二级结构组成
名称
组成
α-螺旋 β-折叠 无规则卷曲
PFLaccA 4.88% 25.14% 69.98%
PFLaccB 3.94% 24.77% 71.29%
3.94%。通过蛋白质氨基酸序列及二级结构预测分
析，与已知蛋白的三维结构进行同源建模，预测
其蛋白的三维结构有助于了解其生物学功能[16]，
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通过SWISS-MODEL预测了PFLaccA和PFLaccB的
三维结构(图7)。
3 结论与讨论
利用刺芹侧耳漆酶基因序列(AM774000.1、
DQ234990.1)设计引物，以阿魏侧耳原基cDNA为
模板，克隆CDS区序列。获得阿魏侧耳PFLaccA
CDS和PFLaccB CDS序列长度均为1602 bp，与刺
芹侧耳漆酶基因序列(AM774000.1、DQ234990.1)
相似性为97%。阿魏侧耳PFLaccA CDS和PFLaccB
CDS序列均包含起始密码子和终止密码子，为全
长的开放阅读框ORF，编码蛋白质长度为533 aa。
PFLaccA蛋白和PFLaccB蛋白均包含长度为20 aa
的信号肽和蓝多铜氧化酶蛋白家族(Pfam：Cu-
oxidase_3、Cu-oxidase和Cu-oxidase_2)结构域，
利用铜离子的氧化还原能力，对还原性底物进行
单电子氧化，同时进行电子传递，将氧气还原成
水。通过PredictProtein预测PFLaccA和PFLaccB的
二级结构发现主要是由许多无规则卷曲、β-折
叠、少量α-螺旋构成，并通过SWISS-MODEL预
测了PFLaccA和PFLaccB的三维结构模型。
阿魏侧耳和刺芹侧耳同属侧耳科侧耳属
真菌，其生长发育过程中分解利用木质素均
需要漆酶催化降解。研究利用刺芹侧耳漆酶基
因，进行同源克隆，获得了阿魏侧耳漆酶基因
(PFLaccA和PFLaccB)，其基因序列与刺芹侧耳基
因(AM774000.1、DQ234990.1)相似性更高，蛋白
预测分析显示其相似性为98.36%，同属于蓝多铜
氧化酶蛋白家族。漆酶作为真菌分解利用木质素
的关键基因，已从刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)[17]、
糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)[18-19]及凤尾菇(Pleurotus
sajor-caju)[20]等真菌中克隆到相关的基因。从阿
魏侧耳中克隆出漆酶基因，丰富了其基因的多样
性，阿魏侧耳在生长发育过程中漆酶基因的表达
情况、细胞化学定位还有待于进一步研究。
图7 PFLaccA和PFLaccB三维结构预测
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收稿日期：2015-03-12 *通讯作者
基金项目：黑龙江省青年学术骨干计划项目(1251G050)。
作者简介：张筠(1976—)，女，博士研究生，研究方向为食品微生物与生物技术。
张 筠1,2，孟祥晨1*，石 丹2
(1.东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；
2.黑龙江东方学院食品学院，哈尔滨 150066)
摘要：保加利亚乳杆菌作为发酵剂在食品工业方面被广泛应用，但是在其生产和使用过程中，
会面临各种环境胁迫的影响，菌体细胞为了应对这些不利条件，形成了自己的适应机制，表现
出了适应性。对德氏乳杆菌保加利亚亚种FL6(Lactobacillus delbruecckll ssp. bulgaricus FL6)进行不
同条件的冷适应，研究其在不同冷适应温度及冷适应时间下菌体冻干存活率及细胞膜脂肪酸的
变化。结果表明：德氏乳杆菌保加利亚亚种FL6经过冷适应后，与对照组相比，冻干存活率有所
增加，其中4 ℃、8 h冷适应后，菌体冻干存活率增加显著(p<0.05)，达62.1%，此时菌体细胞膜
中不饱和脂肪酸含量较对照组有显著增加，U/S比值最高，菌种对冻干的抵抗力增强。
关键词：保加利亚乳杆菌；冷适应；冻干存活率；细胞膜脂肪酸
中图分类号：TS 201.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2015)05-0020-06
Cold adapt on the survival and the cell membrane fatty acid content of
freeze-dried Lactobacillus delbrueckll ssp. bulgaricus FL6
ZHANG Yun1,2, MENG Xiang-chen1*, SHI Dan2
(1.Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Food College, Northeast
冷适应对德氏乳杆菌保加利亚亚种
FL6冻干存活率及其细胞膜脂肪酸的
影响
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DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2015.05.004