全 文 ：吉林农业大学学报　2000 ,22(4):1 ～ 4
Journal of J ilin Agricultural Universi ty
用 RAPD方法研究粘菌粉瘤菌属内
3个种的分子系统学关系
刘淑艳　李　玉
(吉林农业大学菌物研究所　长春 130118)
摘　要:RAPD 技术已广泛用于菌物系统学研究中。本研究用 30 个随机引物对来自不同地区的粉瘤菌属
(Lycogala)内 3 种 22 份样品进行 RAPD扩增。扩增图谱用聚类分析法分析 ,结果表明:所研究的粉瘤菌属的
3 个种种间差异明显 , 且小粉瘤菌(L.exiguum)在亲缘关系上与大粉瘤菌(L.flavofuscum)稍近 , 而与粉瘤
菌(L.epidendrum)稍远。
关键词:粉瘤菌属;RAPD;分子系统学
中图分类号:Q949.31　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2000)04-0001-04
Studies on the Molecular Systematics of the 3 Species
of Lycogala by RAPD
LIU Shu-yan , LI Yu
(Inst itute of Mycology , J il in Agricultural Universi ty , Changchun 130118 , China)
Abstract:RAPD has been widely used in the studies on the molecular sy stematics of Fungi.
Twenty-tw o samples representing three species of Lycogala f rom different geographic orig ins
w ere amplified using 30 random primers.Banding pat terns f rom RAPD markers w ere analysed
w ith N TSYS to obtain the information on variation and evolution of the three species of Lyco-
gala.The results show ed that the three species are significant ly dif ferent and L.exiguum is more
closely related to L.f lavof uscum than to L.epidendrum.
Key words:Lycogala;RAPD;molecular systematics
　　随机扩增 DNA 多态性(Random Amplified
Polymo rphic DNA , RAPD)是 90年代发展起来的
以聚合酶链反应(PCR)为基础的一种新方法 。它
使用一系列短的随机引物(约 10 bp),无需知道
DNA的任何信息 ,对整个基因组 DNA进行扩增 ,
是一种非常简便 、快速 、成本低的多态性分析方
法。目前 ,在真菌系统学研究中某些方面已完全
取代了 PCR—RFLP 、RFLP 的应用[ 4 ,5] 。粘菌作
为真核生物的一个特殊类群 ,在生物学研究中占
有重要地位[ 2 , 10] 。但是有关粘菌分子系统学的
研究却进行得很少。本文正是为了从分子水平探
讨粘菌的系统学关系 ,而采用 RAPD技术对来自
粉瘤菌属内 3个种的 22份材料进行扩增 ,通过扩
增图谱的分析获得这 3 个种间的分子系统学关
系。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39810440637)
作者简介:刘淑艳 ,女 , 1970年出生 ,博士 ,讲师 ,主要从事分子生物学研究
收稿日期:2000-06-17
DOI :10.13327/j.j jlau.2000.04.001
1　材料和方法
1.1　标本来源
本试验所用标本均由中国科学院微生物研究
所李惠中先生提供 , 共计 22 份 , 其中粉瘤菌
14份 ,大粉瘤菌 6份 ,小粉瘤菌 2份。
1.2　研究方法
1.2.1　DNA 的提取　DNA 的提取采用玻片压
碎法[ 1] 。
1.2.2　RAPD扩增
1.2.2.1　随机引物　RAPD 扩增所用随机引物
购自中国科学院遗传研究所 , 共计 30 个 , 为
OPI-01 ～ OPI-20和 OPK-11 ～ OPK-20。
1.2.2.2　RAPD反应中的扩增参数　试验中采
用如下扩 增参数进 行 RAPD 扩 增[ 3] :KCl
50 mmol/L 、Tris -HCl (pH 8.4)10 mmol/L 、
MgCl2 1.5 mmol/L 、引 物 0.8 μmol/L 、 dN TP
0.1 mmol/L 、模板 1 ～ 100 ng 、Taq聚合酶 1 U 、
50μL的反应体积;循环参数为:94℃40 s※94℃
20 s※35℃1 min※72℃1 min ,循环 45次 ,最后
72℃延伸10 min。
1.2.3　RAPD扩增谱带数据处理　如果某一片
段在某些样品中出现则赋值“1” ,如果不出现则赋
值为“0” 。以样品间相同带的有无和多少来计算
样品间的遗传距离系数 D[ 7] :
D =1-2n xy/(nx+ny)
其中 n xy:两样品间共有的片段数 , nx:x 样
品的片段数 , ny:y 样品的片段数 。试验结果的数
据处理用软件 NTSYS -PC Version 1.70 中的
Qualitative进行矩阵分析和 SAHN Clustering 进
行聚类分析。
2　结果与分析
2.1　RAPD引物的筛选
本研究从所用的 30 个 RAPD 随机引物中 ,
筛选出 4 个引物(OPI -14 , OPI -9 , OPI -6 ,
OPK-19),在粉瘤菌属(Lycogala)内的 3 个种:
粉瘤菌(L.epidendrum)、大粉瘤菌(L. f lavo-
fuscum)、小粉瘤菌(L.ex iguum)共 22份样品上
都产生清晰的扩增谱带。
2.2　RAPD扩增图谱及统计分析
RAPD扩增图谱见图 1 ,经统计分析获得的
聚类分析树系图见图 2。
(1)引物OPI-14的扩增图谱:由图 1-A可
知:小粉瘤菌的 21号样品与大粉瘤菌各样品间具
有 2条相同的带 ,而与粉瘤菌之间无共同带 ,且粉
瘤菌内除 2号 、3号 、5号 、9号样品外其余样品有
1条相同的带 。
(2)引物 OPI-9 的扩增图谱:由图 1-B可
以看出粉瘤菌属内的 3个种间无相同的带。在粉
瘤菌内各样品间有 1条共同带 ,且除 6号和 14号
样品外其余样品间还有 2条相同的带。同样在大
粉瘤菌内各样品间有 1 条共同带 ,除 15 号样品
外 ,其余样品间还有 1条相同带 。而小粉瘤菌的
2个样品与大粉瘤菌间具有 1条相同的带 。这表
明 3个种的种内差异远小于种间差异。
(3)引物 OPI-6 的扩增图谱:由图 1-C 可
知 ,3个种间没有相同的带 ,且种内各样品间也无
共同带。
(4)引物 OPK -19 的扩增图谱:由图 1-D
可以看出 , 3 个种间仍无共同的扩增带。粉瘤菌
内各样品间有 1条相同的带 ,且除 4号和 14号样
品外 ,其余样品还有 1条共同带 。大粉瘤菌内各
样品间有 1条共同带 ,小粉瘤菌的 2个样品 21号
和22号与大粉瘤菌的 18号样品有 1 条相同的
带 ,另外小粉瘤菌的 22 号样品与大粉瘤菌的
16号 、19号和 20 号样品间有 1条共同带。这表
明小粉瘤菌与大粉瘤菌间的亲缘关系要近些 。
由以上结果可以看出 ,粉瘤菌属内 3个种的
种间差异明显大于种内差异 ,而且小粉瘤菌与粉
瘤菌之间的差异又大于其与大粉瘤菌之间的差
异。此外 ,各种内样品间也存在一定差异。
2.3　聚类分析树系图
聚类分析结果表明:整个树系图(见图 2)将
所研究的粉瘤菌属的 3 个种 22 份样品分为 2条
并列的主分枝 ,即粉瘤菌构成一个主分枝 ,大粉瘤
菌和小粉瘤菌构成另一主分枝 ,而在大粉瘤菌与
小粉瘤菌共同构成的分枝内又可分为 2 个亚分
枝 ,即大粉瘤菌为一亚分枝 ,小粉瘤菌为另一亚分
枝。这说明 RAPD扩增图谱能够显示出所研究
的粉瘤菌属 3个已知种之间的遗传差异 。同时从
该聚类分析结果也可以看出粉瘤菌属内这 3个种
之间的亲缘关系如下:小粉瘤菌与大粉瘤菌之间
的亲缘关系较近 ,而与粉瘤菌之间的亲缘关系较
远。
2 　吉　林　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　2000年
图 1　RAPD扩增图谱
Fig.1.Agarose gel electrophoresis of DNA
粉瘤菌为 1～ 14 ,大粉瘤菌为 15～ 20 ,小粉瘤菌为 21～ 22 , A为引物 OPI -14 , B为 OPI -9 , C为 OPI -6 , D 为 OPK-19 , M 为 Marker
(1543 bp , 994 bp , 695 bp , 515 bp , 377 bp , 237 bp)
14 collect ions of Lycogala epidend rum (1～ 14), 6 collect ions of L.f lavofuscum (15～ 20), and 2 collections of L.exiguum (21～ 22)using
the 10 m er p rimers OPI-14=A , OPI-9=B , OPI-6=C , and OPK-19=D.The markers used are PCR Marker (1543 bp , 994 bp, 695
bp , 515 bp , 377 bp , 237 bp)
3第 22卷　第 4期　　　　　　　　刘淑艳等:用 RAPD方法研究粘菌粉瘤菌属内 3个种的分子系统学关系
图 2　随机扩增 DNA多态性(RAPD)聚类分析树系图
Fig.2.Dendrogram based on RAPD bands of Lycogala
epidendrum (1～ 14), L.flavofuscum (15～ 20),
and L.exiguum (21 ～ 22) analyzed by UPGMA
method
3　结论与讨论
对粉瘤菌属内 3个种 22份样品的 RAPD扩
增图谱的聚类分析显示:3个种在系统进化中存
在明显的变异 ,且小粉瘤菌在亲缘关系上与大粉
瘤菌稍近 ,而与粉瘤菌稍远。此结果在另一方面
也从分子水平证明了形态学上的分类的正确性 ,
即试验所用的粉瘤菌属的 3 个种为 3 个独立的
种。同时 3个种内各样品之间即有相同带又有不
同带 ,这充分显示了这些个体在系统进化上的连
续性和间断性。
目前分子生物学技术在粘菌分类学及系统学
中的应用实例还很少 ,而且多集中在多头绒泡菌
(Physarum polycephalum )和 黄 柄 钙 皮 菌
(Didym ium iridis)这 2个较易人工培养的种上。
例如 , Hasegaw a 等[ 6] 曾应用大亚基和小亚基
rRNA序列对真菌(酵母)、粘菌(多头绒泡菌)、植
物(水稻)等进行分析 ,结果表明粘菌不属于真菌。
Otsuka 等[ 9]和 Johansen 等[ 8] 分别用化学方法测
定了多 头绒 泡菌 (Physarum polycephalum )
5.8S 、26S rRNA基因(rDNA)及其转录间区的序
列和 19S rRNA 的序列 ,这为以后的粘菌分子生
物学研究奠定了基础 。本研究首次采用了 RAPD
方法对粘菌的分子系统学进行探讨 ,它开辟了粘
菌分子系统学研究的新途径 ,为深入开展粘菌系
统学研究奠定了基础 。
参 考 文 献
1　刘淑艳 ,李玉.粘菌 DNA提取方法的研究[ J] .吉林农业
大学学报 , 1996 , 18(增刊):61～ 63
2　Alexopoulos C J , Mims C W and Blackw ell M.Introductory
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3　Crow hurst R N , King F Y , Haw thorne B T et al.RAPD
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4 　吉　林　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　2000年