全 文 ：ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.22No.42006April
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蒌蒿（ ArtemisiaselengensisTurez.），别名藜蒿、蒌
蒿苔、水蒿等，为菊科蒿属多年生草本植物。多野生于
山坡、草地、路边和荒滩。蒌蒿营养非常丰富，可作蔬
菜、中药、配酒原料及香料等，是一种很受欢迎的野生
保健蔬菜[1]。
蒌蒿属资源在中国极其丰富，蒌蒿类型也较多。但
第一作者简介:李双梅，女，1974年出生，本科学历，农艺师，从事植物种质资源分类及遗传多样性研究。E-mail：lishm16@163.com。
通讯作者:柯卫东，研究员，E-mail:wdke63@163.com，Tel:027-88116313。通信地址：430065湖北省武汉市武昌张家湾特一号，武汉市蔬菜科学研究
所。
收稿日期:2005-11-29，修回日期：2005-12-18。
蒌蒿DNA提取、RAPD优化及引物筛选初报
李双梅,郭宏波,黄新芳,柯卫东
（ 湖北省武汉市蔬菜科学研究所，武汉430065）
摘 要:为了能从分子水平探讨蒌蒿资源的遗传多样性、蒿属的系统分类和种质资源的鉴定,在此,报道
采用小量法(SDS法)和大量法(CTAB法)提取蒌蒿DNA,建立优化的RAPD-PCR体系,并进行引物初
步筛选。结果显示,两种抽提方法都可有效抽提出高质量的DNA,大量法得率要明显高于小量法,但小
量法抽提的DNA也足够RAPD-PCR反应几十至上百次,不同的实验室可根据实验的需要进行选择。对
两种方法抽提的DNA,都进行PCR扩增体系梯度摸索,最优的RAPD-PCR反应条件为:25μl反应体系
中,含DNA模板约20ng,10×TaqDNA聚合酶缓冲液2.5μl,2μldNTPs(2.5mM),Mg2+2μl(25mM),
TaqDNA聚合酶0.15μl(5U/μl),引物0.5μl(25μM),其余以双蒸水补充。在剔除了重复性差,条带模
糊和单态的引物后,有九个引物表现稳定,扩增出来的条带清晰、多态性高。
关键词:蒌蒿;DNA提取;RAPD-PCR体系优化;引物筛选;ArtemisiaselengensisTurez.
中图分类号:S647 文献标识码:A
DNAIsolation,OptimizationforRAPD-PCRandPrimersScreeningof
ArtemisiaselengensisTurez.
LiShuangmei,GuoHongbo,HuangXinfang,KeWeidong
(WuhanInstituteofVegetableScience,wuhan,Hubei,430065)
Abstract:ToinvestigatethegeneticdiversityandauthenticationofthisspeciesinChinaandtoprobeinto
thephylogenetictaxonomyofthegenususingmolecularmarkersinthenextstep,twoisolationmethodsof
DNA (litleextractionbySDSmethodandlargeamountofextractionbyCTABmethod),optimizationof
RAPD-PCRconditionandprimersscreeningwerefirstlystudied.Theresultsshowedthatbothisolation
methodscouldefectivelyobtainhighqualityDNA,andtheDNAamountharvestedfromlitleextraction
methodcouldbeusedinRAPD-PCRactionforonehundredtimesatleastinspiteofmuchlessthanthe
productionfromlargeextraction.Diferentlabsmayselectanyofthemaccordingtothedemandoftheirex-
periments.ThesubsequentRAPD-PCRconditionwasexplored,usingtheDNAharvestedfrombothmethods,
andthemostsuitablemixturewasasfolows:total25μlreactionvolumecontainingtemplateDNA20ng,10×
Taqbufer2.5μl,2μldNTPs(2.5mM),Mg2+2μl(25mM),TaqDNApolymerase0.15μl(5U/μl),0.5μlpimer
(25μM)andddH2Ointherest.Totalninestableandclearprimerswithhighpolymorphismwereselectedex-
ceptforthosewithmonomorphicandfaintbands,usingtheDNAsamplesandtheRAPD-PCRconditionin
ourstudy.
Keywords:ArtemisiaselengensisTurez,DNAisolation,OptimizationforRAPD-PCR,Primerscreening
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中国农学通报 第22卷 第 4期 2006年 4月
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目前对其研究仅停留在营养保健[1]、生物学特性及栽
培技术[2,3]和化合物的提取[4]上，而在DNA水平上研究
蒌蒿，国内外尚未见报道。为了能深入探讨中国蒌蒿资
源的遗传多样性、蒿属以下的系统分类和种质资源的
鉴定，笔者对蒌蒿DNA的提取、RAPD-PCR体系和引
物筛选做了一些摸索。
1材料与方法
1.1材料
所有蒌蒿种质材料均采自国家种质武汉水生蔬菜
资源圃。其中青梗、白梗、红梗、和微红梗的资源各3
份。实验于2005年5—12月在武汉市蔬菜科学研究所
进行。
1.2方法
1.2.1DNA的提取与检测
(1)小量法 (SDS法)提取DNA称取幼嫩叶片
100mg，放人 1.5mlEppendorf管中，再加入少许石英
沙，用自制的玻棒充分迅速将其捣碎使其呈匀浆状，随
即加入 65℃预热的抽提缓冲液（ 100mmol/LNaAc，
50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，2% PVP，1.4%
SDS，PH5.5）700μl。再加7μl巯基乙醇，轻轻混匀后
65℃水浴 60min，其间摇动 2~3次。然后室温下
10000r/min离心10min，取上清。加入2/3体积2.5M
KAc400μl。混匀后冰浴30min，再4℃下10000r/min
离心10min。取上清，加等体积的氯仿∶异戊醇（ 24∶
1），轻轻颠倒混匀10min，在室温下10000r/min离心
10min，取上相重复用氯仿∶异戊醇抽提一次，上相中
加2/3体积-20℃预冷的异丙醇，充分混匀，-20℃静置
30min以上，最后4℃下12000r/min离心10min，弃上
清，控干离心管，加入75%乙醇200μl洗涤沉淀2次，
吹干或50℃烘干DNA，加入200μlddH2O溶解沉淀。
DNA溶解后加入1μlRNase（ 10mg/ml）37℃保温1h
去除RNA。
(2)大量法（ CTAB法）提取DNA称取幼嫩叶片
2.5g，放入-20℃预冷的研钵（ 直径6cm）中，倒入适量
液氮，待液氮初步挥发后，迅速研磨成粉状。将粉末装
入15ml离心管中，迅速加入6ml65℃预热的抽提液
（ 100mmol/LTrisHClPH8.0，20mmol/LEDTA pH8.
0，1.4mol/LNaCl，2%(W/V)CTAB）， 再 加 入 0.2%
（ V/V）的巯基乙醇和1/10体积20%的PVP，充分混匀
后65℃水浴1h，期间不时摇动4~5次。冷却至室温后
加入等体积的氯仿∶异戊醇（ 24∶1），轻轻颠倒混匀
30min，8000r/min离心10min，取上清加入1/10体积
65℃预热的10%CTAB液（ 10%CTAB，0.7MNaCl），再
加等体积的氯仿∶异戊醇，倒转混匀10min，8000r/min
离心10min，取上清，重复上一步一次，在上清中加入
1~1.5倍体积的沉淀缓冲液和0.1%巯基乙醇，慢慢颠
倒混匀后可见到有白色絮状沉淀，4℃静置1h以上可
得到更多沉淀。10000r/min离心20min，弃上清，控干
后加入0.8mlNaCl-TE（ 1MNaCl，10mMTrisHClpH8.
0，1mMEDTApH8.0），待沉淀完全溶解后，加入2/3
体积 -20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后静置过夜。
12000r/min离心15min，弃上清后沉淀用1ml70%乙
醇泡洗两次，每次30min。吹干或50℃烘干使呈透明
状，加入1mlTE（ 10mMTrisHCl，1mMEDTA）溶解，待
完全溶解后加入3μlRNaseA（ 10mg/ml）37℃保温1h
去除RNA，-20℃保存备用。
(3)DNA的检测 在分光光度计上测定光吸收，
根据 260nm的光吸收值计算 DNA产率，根据
OD260/OD280比值判断DNA样品的大致纯度。用0.8%
琼脂糖凝胶电泳，以λDNAHindⅢ为标准，检查所得
DNA大致分子量。
1.2.2PCR体系优化及扩增 试验对dNTPs、TaqDNA
聚合酶、Mg2+，引物浓度都设置了不同的梯度。dNTPs
只设置了100μM和200μM两个梯度；TaqDNA聚
合酶因厂家不同酶活性有很大差异，设置0.5、0.75、1、
1.25、1.5、1.75、2U六个梯度；Mg2+因与dNTPs、Taq酶
等都有结合作用，所以设置1.5、1.75、2.0、2.25mM四
个梯度；引物浓度设置0.3、0.4、0.5、0.6μM四个梯度。
PCR扩增是在 PTC100扩增仪（ M.J.Research，
USA）上完成的，反应体系总体积为25μl，含DNA模
板 2μl约 20ng，2μldNTPs（ 2.5mM），10μbufer
2.5μl，Mg2+2μl（ 25mM），Taq酶 0.15μl（ 5U/μl）（ 购
自TaKaRa公司），引物0.5μl（ 25μM），其它以ddH2O
补充。扩增程序如下：94℃，3min；92℃，30s，35℃，
40s，72℃ ，1min，2个 循 环 ； 再 92℃ ，30s，38℃ ，
40s，72℃，1min，38个循环；72℃延伸10min。扩增产物
在含0.5μg/mlEB的2.0%凝胶上电泳 (5V/cm)4h，自
动成像系统观察拍照。
1.2.3RAPD随机引物的初步筛选 选用不同茎秆颜色
的蒌蒿材料4份，从8组（ A、C、G、K、P、R、U、Y）引物
中进行引物筛选。试验选取了稳定性高、重复性好的引
物9个。
2结果
2.1DNA提取
两种方法提取的DNA外观上绝大多数都为乳白
色，极少数略带有褐色。大量法提取的DNA浓度（ 平
均2820ng/μl）要显著高于小量法（ 平均100ng/μl），
但是在得率上差异不太明显（ 大量法得率平均 560
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ng/g，小量法为485ng/g）。OD260/OD280的比值一般都在
1.8~2.0之间，说明DNA纯度较高。图1为两种提取方
法DNA的电泳检测结果。
2.2PCR体系的优化
在测算出DNA的大致浓度后，用于PCR扩增前
模板均被稀释到比较一致的浓度，所以没有设置模板
图1蒌蒿基因组DNA电泳结果,M为 λDNAHindⅢ,1~6泳道大量法提取,7~12为小量法提取
梯度。根据对dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物不
同浓度的梯度设置，选出最优PCR反应体系（ 见图
2）。
2.3引物筛选
筛选出来的引物编号及序列见表1。
3讨论
3.1DNA的提取
在蒌蒿叶片中含有大量鞣质和酚类物质，在提取
DNA时最好加入2%PVP（ 聚乙烯吡咯烷酮）。对极个
别提取不理想的材料特别是在成叶和老叶中，除了加
入巯基乙醇抗氧化外，可在抽提液里加1%的Ficol和
抗坏血酸钠，控制酚化合物褐变。小量法（ SDS法）和
大量法（ CTAB法）两种方法采用的不同抽提液，但都
可有效抽提高质量的DNA。因小量法中蛋白不易去除
彻底，所以利用高盐低pH法，低pH的醋酸钾能够有
效沉淀蛋白[5]，而大量法去除蛋白相对较容易。不同实
验室可根据试验需要采用相应的抽提法。
3.2PCR体系的优化
对影响PCR反应体系的每一个因素都与其它因
素进行组合试验，不但操作十分繁琐而且浪费人力物
力。试验中先选各因素梯度的中间值进行扩增，然后根
据结果再设定一至两个因素不变，其它因素按梯度排
列，选择好的结果再对原先设定不变的因素进行微调，
这样就能比较快捷的摸索出优良的PCR反应条件。
3.3引物的筛选
引物筛选时，采用相同材料相同引物和同一扩增
程序在不同时间重复两次试验，对于在两次试验中表
现不一的，予以剔除。同时条带清晰但条带较少或者条
带不清晰的也不予考虑。
参考文献
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提取与鉴定.植物学报,1994,36(7):528~533
（ 责任编辑：回文广）
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图2利用优化的PCR体系扩增的RAPD带型,引物为OPR02,M是100bpLadder
表1的引物编号及序列
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