全 文 ：Vol.29 高 等 学 校 化 学 学 报 No.1
2008年 1月 　 　　　　　CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES　　　　　 　 117 ～ 123
白色念珠菌 N-肉豆蔻酰基转移酶中
药物结合位点的 MCSS分析
盛春泉1 , 朱　杰 2 , 张万年1 , 徐　辉 1 , 宋云龙1 , 张　珉 1 , 姚建忠 1 , 缪震元1
(1.第二军医大学药学院 , 全军药物化学重点实验室 , 2.科研部 , 上海 200433)
摘要　采用多拷贝同时搜寻方法(MCSS)分析得到了 CaNMT活性位点的疏水区域 、 氢键结合位点和负电性
区域.MCSS计算结果显示 , CaNMT活性位点有两个疏水性比较强的区域:一个由 Tyr107, Tyr109, Val108,
Phe117, Phe123, Ala127, Phe176和 Leu337等残基组成;另一个由 Phe115, Phe240和 Phe339组成.CaNMT
活性位点发现有两个氢键作用区域 , 其中 Tyr119, His227, Asn392和 Leu451是与已有抑制剂的氢键结合位
点 , Tyr107, Asn175, Thr211和 Asp412是新发现的氢键结合位点 , 而且在 NMT家族中高度稳定 , 它们对设
计新结构类型的 CaNMT抑制剂具有重要作用.Leu451是负电性兼氢键作用位点 , 是抑制剂设计时所必需考
虑的位点.
关键词　N-肉豆蔻酰基转移酶;抗真菌;多拷贝同时搜寻;药物结合位点;药物设计
中图分类号　O641　　　　文献标识码　A　　　　文章编号　0251-0790(2008)01-0117-07
收稿日期:2006-08-16.
基金项目:国家自然科学基金(批准号:30400567)资助.
联系人简介:张万年, 男 , 教授 , 博士生导师 , 从事药物设计与合成.E-mail:zhangwnk@hotmail.com
N-肉豆蔻酰基转移酶(N-Myristoyltransferase, NMT)是一种细胞溶质单体酶 , 它催化并将肉豆蔻酰
基从肉豆蔻酰 CoA转移至某些真核细胞蛋白或病毒蛋白 N端的甘氨酸上 , 形成 N-肉豆蔻酰化蛋
白 [ 1, 2] .蛋白质的 N-肉豆蔻酰基化反应是不可逆的蛋白质修饰反应 , 经 N-肉豆蔻酰化蛋白具有广泛的
生物学效应 , 能参与信号转导级联和细胞凋亡等多种生物过程 [ 3, 4] .NMT已被证实是白色念珠菌 、新
型隐球菌等临床重要致病真菌生长和存活所必须的酶 , 目前已成为一个极具潜力的抗真菌药物作用新
靶点[ 5] .因此 , 寻找特异性作用于致病真菌 NMT的抑制剂有望发现具有全新作用机制的新型抗真菌
药物 , 从而克服现有抗真菌药物疗效有限 、耐药性严重和毒副作用大等缺陷.
目前已经报道的 NMT小分子抑制剂的结构类型非常少 , 主要集中于对苯并呋喃类抑制剂的研
究 [ 6 ～ 9] .有关白色念珠菌 NMT(CaNMT)单酶及其与苯并呋喃类抑制剂复合物晶体结构的研究结
果 [ 10, 11]为基于靶酶开展合理抑制剂设计研究打下了坚实基础.Miranker等 [ 12]发展的多拷贝同时搜寻
法(MultipleCopySimultaneousSearch, MCSS)是一种分析蛋白质活性位点简便而有效的方法 , 目前已
经成功地应用于多个药物作用靶点 [ 13 ～ 15] .我们已对苯并呋喃类 NMT抑制剂进行了三维定量构效关系
研究 , 从配体角度指导新型抑制剂的设计 [ 16] .本文从受体的角度 , 将 MCSS方法运用于 CaNMT活性位
点的分析 , 阐明 CaNMT活性位点的疏水区域 、氢键结合位点和电性作用位点 , 为进行全新药物设计和
虚拟高通量筛选提供了重要信息.
1　MCSS计算原理
MCSS方法是由 Miranker和 Karplus[ 12]在 CHARMM力场基础上发展起来的 , 其基本原理是将数千
个拷贝的探针原子或官能团片段随机分布在蛋白质的结合位点上 , 然后采用基于经验的势能函数对其
进行能量优化 , 寻找不同类型官能团在蛋白质活性位点能量合适的结合位置.计算过程中只考虑探针
分子与蛋白质的相互作用 , 取消探针分子之间的相互作用 , 这样可将探针分子在能量合适的区域叠合
在一起 , 大大提高了搜寻效率.MCSS方法同时结合了 MonteCarlo和能量优化方法 , 可以直观地显示
不同类型官能团在蛋白质活性位点的分布位置与取向 , 为合理设计药物提供重要信息 , 目前已在药物
设计领域广泛使用.
2　实验部分
用于 MCSS计算的 CaNMT三维结构 [ 11]取自 PDB库(PDB登录号:1IYL), 由于其晶体结构 1IYL
是一个四聚体 , 有 A, B, C和 D四个亚单位 , 抑制剂结合在 A和 C亚单位上 , 因此本研究取出晶体中
的亚单位 C作为研究对象.所有分子模拟 、活性位点搜寻和 MCSS计算和结果分析均在 Origin300服
务器上 , 采用 InsightⅡ 2000和 Sybyl6.9软件包完成.计算中选用的各项参数除非特别指明均采用缺
省值.
2.1　CaNMT活性位点的搜寻
采用 InsightⅡ的 Bindingsiteanalysis模块进行搜寻和分析 CaNMT上空腔的大小和分布情况 , 所用
的探针分子(Grid)大小定义为 0.1nm×0.1nm×0.1nm, 将可容纳大于 100个探针分子的空穴作为可
能的配体结合位点.
2.2　CaNMT活性位点的 MCSS计算
采用 InsightⅡ的 MCSS模块探测 CaNMT活性位点重要的配体结合区域.首先 , 定义晶体结构中苯
Scheme1　Structureofbenzofuran-5
并呋喃类抑制剂 Benzofuran-5(结构见 Scheme1)分
子周围 0.8nm范围内所有残基作为活性位点.选
用的探针基团包括:(1)疏水性基团:BENZ(Ben-
zene), CHEX(Cyclohexane), PRPN(Propane)和
ILER(Butane);(2)极性基团:PHEN(Phenol),
MEOH(Methanol), THRR(Ethanol)和 WATR
(Water);(3)正电性基团:MAMM(Methylammonium)和 LYSR(1-Aminopentane);(4)负电性基团:
ACET(Acetateion).这些探针基团用作探测药物结合位点各种力场的分布特征.然后 , 将 1000个拷贝
的探针分子随机分布在药物结合位点上 , 基于 CHARMM力场同时进行能量优化 , 不考虑分子探针间
的相互作用.如果两个探针分子间的 RMSD小于 0.02nm, 将视它们为同一分子 , 仅保留其中一个.以
上步骤对每个探针分子重复 10次 , 以确保充分搜寻每一个探针分子在药物结合位点内的定位和取向.
所有计算均采用 CHARMM22力场和 MCSS2.1程序进行.对每一个官能基团的 MCSS运算结果进行
分析 , 识别得到各官能团的最佳结合位点和取向 , 在此基础上结合晶体结构 1IYL中抑制剂与 CaNMT
的相互作用模式 , 产生官能团分布图 , 探讨结合位点内各区域的性质.
2.3　新型 CaNMT抑制剂的全新设计
基于 MCSS计算分析得到 CaNMT活性位点的各种性质 , 采用我们自编的全新药物设计软件
InterD2(软件登记号:2005SR04084), 进行 CaNMT抑制剂的全新设计.InterD2采用片段连接法生成分
子 , 构建分子所用片段来源于我们自建的虚拟组合库(包括:药效团库 、基本母核库和连接片段库),
分子生成采用 “药效团对接-基本母核定位 -连接片段连接 ”的策略.将生成的候选分子构成虚拟数据
库 , 采用 Sybyl6.9软件包中的 FlexX和 Cscore模块进行候选分子的打分评价 , 优选与 CaNMT相互作
用能低于 Benzofuran-5的分子.优选分子的作用模式经 AutoDock方法进行验证 , 通过图形学考察确定
最后的目标分子.
3　结果与讨论
3.1　CANMT上活性位点的搜寻
为探测 CaNMT是否存在多个抑制剂结合位点 , 对其进行了 Bindingsiteanalysis研究.计算结果显
示 , 在 CaNMT三维结构上共发现有 4个较大的空腔 , 其中最大的空腔可容纳 1644个探针分子 , 该空
穴以一个狭长的 “凹槽形式 ”存在于蛋白质表面上 , 横跨蛋白质内部两个相似的对称单位.凹槽的中心
为一个较深的口袋 , 正是小分子抑制剂的结合区域.凹槽中位于蛋白质的 N端区域为肉豆蔻酰 CoA结
118 高 等 学 校 化 学 学 报 　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.29　
合区域 , C端区域和中心口袋一起组成肽类抑制剂的结合区域.其它 3个空腔分别可以容纳 233, 154,
和 119个探针分子 , 也均位于蛋白表面.但分析这些空腔的大小 、空间形状 , 结合已有的 NMT生物学
研究结论 , 它们均难以作为抑制剂的结合位点.因此 , 选择上述最大的空腔作为 CaNMT的活性位点区
域进行研究.
3.2　MCSS计算结果
MCSS计算所选的 11种官能团分别代表疏水性基团 、极性基团和电性基团 , 计算结果见表 1.由
于蛋白质在结合官能团片段时具有去溶剂化效应 , 因此考虑结合自由能低于去溶剂化自由能的低能片
段才具有意义.根据 Born近似规则 , 离子的溶剂化自由能等于其溶剂化焓(ΔH)的一半 , 因此对于离
子和极性官能团仅考虑相互作用能小于 ΔH/2的片段 , 对于非极性分子则考虑相互作用能小于零的片
段.表 1中部分已经报道的官能团的 ΔH/2值取自文献 [ 14] .MCSS计算结果发现 , 有一些低能片段位
于 CaNMT活性位点的外周边缘 , 尽管它们具有较低的相互作用能 , 但它们对于分析活性位点性质和
抑制剂设计意义不大 , 在本研究中不予考虑.
Table1　SummaryofresultsforthefunctionalgroupsusedintheMCSScalculations
MCSSfunctional
group
(ΔH/2)/
(kJ· mol-1)
Initialnumber
ofcopy
Numberofcopywiththe
segmentofinteractionenergy<0
Energyrange/
(kJ· mol-1)
Numberofcopywith
interactionenergy<ΔH/2
BENZ -14.70 1000 102 -0.5460— -76.5242 56
CHEX 1000 293 -4.1580— -42.5880
PRPN -10.08 1000 270 -16.2960— -35.4900 270
ILER 1000 496 -23.7300— -40.1940
PHEN 1000 352 -53.6340— -142.7160
MEOH -21.42 1000 239 -32.3820— -129.5280 239
THRR 1000 216 -22.55470— -109.7460
WATR -21.00 1000 254 -28.7700— -149.7300 254
ACET -195.30 1000 122 -0.6720— -688.3800 24
MAMM -157.50 1000 90 -1.0500— -440.2860 58
LYSR 1000 466 -388.6680— -442.1800
3.3　CaNMT活性位点的疏水结合区域
采用疏水性基团苯环 、环己烷 、丙烷和丁烷探测 CaNMT活性位点的疏水性区域.为了清晰地显示
各种片段在活性位点的分布特征 , 根据各片段在活性位点的位置和取向将其分簇(Cluster), 重点考察
其 20个能量最低的片段在活性位点的分布(图 1).苯环在 CaNMT活性位点的分布具有明显的特征 ,
抑制剂 Benzofuran-5的苯并呋喃环 4位侧链吡啶环周围分布有多个低能片段 , 这个区域中能量最低的
片段正好与吡啶环重合 , 这与该类抑制剂的设计思想和作用模式完全吻合 [ 8, 11] .抑制剂的 4位侧链吡
啶环附近有芳香性残基 Tyr107和 Tyr109, 稍远处被 Val108, Phe117, Phe123 , Ala127, Phe176和
Leu337等疏水性较强的残基所包围 , 构成了一个疏水性较强的区域.在抑制剂 4位侧链中脂肪链附近
也分布有 2个低能片段 , 周围有 Leu315和 Leu394.苯并呋喃环处于活性位点口袋的核心区域 , 在该区
域能量最低的片段正好与抑制剂苯并呋喃环的苯环部分完全重合.活性位点其余的低能片段密集分布
于抑制剂苯并呋喃环 2位侧链的咪唑基附近 , 咪唑基被 Phe115, Phe240和 Phe339包围 , 是活性位点
的另一个强疏水性区域.环己烷在活性位点的低能片段数目与苯环相类似 , 其分布也集中在抑制剂分
子 2位侧链咪唑基 、 4位侧链吡啶环和烷基链附近.丙烷和正丁烷分子体积较小 , 它们在活性位点的
分布片段数目比苯环和环己烷的多 , 而且分布相对分散 , 但其分布特征也与苯环和环己烷相类似.丙
烷和正丁烷的低能片段除了在上述疏水性区域有着密集分布外 , 还在 Val108附近分布较多 , 它们与该
区域除了形成疏水相互作用外 , 还存在范德华相互作用.
3.4　CaNMT活性位点的氢键结合位点
甲醇 、乙醇 、水和苯酚均为极性分子 , 其极性官能团(羟基)用作探测 CaNMT活性位点的氢键结合
位点.MCSS计算结果显示 , 甲醇 、乙醇和水在活性位点的分布要比环状官能团分散 , 得到的低能片段
数目也比较多 , 这可能是由于其分子体积较小的缘故.但是 , 这些官能团的分布仍具有明显的规律 ,
将各种官能团进行分簇后 , 重点考察其低能量片段与活性位点残基形成氢键的情况(图 2).
119　No.1 　 盛春泉等:白色念珠菌 N-肉豆蔻酰基转移酶中药物结合位点的 MCSS分析
Fig.1　FunctionalmapofBENZ(A), CHEX(B), PRPN(C)andILER(D)intheactivesiteofCaNMT
Only20minimawiththelowestMCSSinteractionenergywereshown.
水分子的低能片段与活性位点形成 2个明显的氢键作用区域(A和 B):A区域位于晶体结构 1IYL
中抑制剂分子苯并呋喃环的 4位侧链氨基和吡啶环的周围 , 水分子可以和该区域的 Tyr107 , Asn175,
Thr211和 Leu451形成氢键相互作用;B区域位于抑制剂分子的苯并呋喃环和咪唑基附近 , 水分子与
His227和 Asp412形成氢键相互作用.苯酚在活性位点的低能片段数目比苯分子的多 , 这是因为除了
苯酚能与活性位点形成疏水相互作用外 , 还可以形成氢键相互作用.苯酚分子低能片段与活性位点的
氢键相互作用区域与水分子的一致 , 它也与 A区域的 Tyr107, Asn175 , Thr211和 Leu451和 B区域的
His227和 Asp412形成氢键.甲醇和乙醇分子的低能片段数目与水分子的相似 , 它们也与活性位点形
成上述的 A和 B两个氢键作用区域 , 而且 , 除了与上述残基均能形成氢键作用外 , 还可以和 A区域的
Tyr119和 B区域的 Asn392形成氢键.
苯并呋喃类 NMT抑制剂的构效关系 、晶体结构 1IYL的特征和 CaNMT的定点突变的实验事实已
经证实 [ 8, 11] :抑制剂 Benzofuran-5的苯并呋喃环氧原子与 His227形成氢键 , 2位侧链咪唑 N原子与
Asn392形成氢键 , 4位侧链氨基与 Leu451的羧基负离子形成氢键 , 吡啶环 N原子和 Tyr119形成氢键.
上述 4个已经确证的氢键结合位点通过 MCSS计算得到成功识别 , 此外 , A区域的 Tyr107, Asn175,
Thr211和 B区域的 Asp412均为 NMT家族中高度保守的残基 , 而且不与已有的苯并呋喃类抑制剂形成
直接相互作用 , 因此在设计新结构类型的 NMT抑制剂时 , 可以重点考虑这 4个新识别得到的位点.
120 高 等 学 校 化 学 学 报 　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.29　
Fig.2　Hydrogen-bondbindingsitesintheactivesiteofCaNMTandtheirinteractionwithWATR
(A), MEOH(B), THRR(C)andPHEN(D)
Hydrogenbondsaredisplayedbydashlines.
3.5　CaNMT活性位点的电性作用位点
Fig.3　ElectrostaticnegativeregionintheactivesiteofCaNMTandthedistributionoffunctional
groupsofMAMM(A)andLYSR(B)
乙酰负离子 、甲铵阳离子和戊铵阳离子分别用作探测活性位点的正电性和负电性区域.MCSS计
算结果显示 , 乙酰负离子在活性位点相互作用能低于 ΔH/2的低能片段数目比较少 , 而且分布分散 ,
主要在活性位点的外周边缘 , 因此推测活性位点不具有强正电性的区域.甲铵阳离子和戊铵阳离子在
活性位点的分布具有明显的规律(图 3), 大部分片段集中在 Leu451, Glu109, Asp110和 Asp112附近.
121　No.1 　 盛春泉等:白色念珠菌 N-肉豆蔻酰基转移酶中药物结合位点的 MCSS分析
已有的 NMT晶体结构和生物学实验结果证实[ 17] , 位于蛋白质 C端的 Leu451羧基负离子对 NMT发挥
催化功能和与抑制剂结合起着至关重要的作用 , 因此该位点在抑制剂设计中必需重点考虑.Glu109,
Asp110和 Asp112组成了一个负电性很强的区域 , 但这 3个残基位于活性位点的边缘 , 而且残基侧链
均指向外侧 , 因此难以成为抑制剂的结合位点.
3.6　CaNMT抑制剂的设计
MCSS计算结果发现 , CaNMT活性位点有 2个强疏水性区域:一个由 Tyr107, Tyr109, Val108,
Phe117, Phe123, Ala127 , Phe176和 Leu337等残基组成;另一个由 Phe115 , Phe240和 Phe339组成.从
这两个区域的空间形状看 , 适宜引入芳香性的疏水片段(例如苯环和杂环), 但体积不宜过大.通过
MCSS计算发现 , CaNMT活性位点有 2个重要的氢键作用区域 A和 B, 它们对所设计抑制剂的活性和
选择性具有重要意义.氢键作用区域中的 Tyr119, His227, Asn392和 Leu451是与已有抑制剂的氢键结
合位点 , Tyr107, Asn175, Thr211和 Asp412是新发现的氢键结合位点 , 而且在 NMT家族中高度稳定 ,
它们对设计新结构类型的 CaNMT抑制剂具有重要作用.Leu451是 CaNMT活性位点重要的负电性位
点 , 同时又是氢键结合位点 , 还是在抑制剂设计时是必需考虑的作用位点 , 通常可在抑制剂分子中引
入具有较强碱性的脂肪氨基和芳香氨基 , 与其形成相互作用.
3.7　新型 CaNMT抑制剂的全新设计
采用 InterD2软件进行 CaNMT抑制剂的全新设计研究 , 结合片段连接和虚拟筛选方法来进行分子
生成和优选.我们初步设计得到一个比较理想的分子 AG6901[图 4(A)] , 采用 FlexX和 AutoDock两种
方法进行 AG6901与 CaNMT的分子对接研究 , 都得到了相似的作用模式 , 两者的 RMSD值为 0.1123
nm, 说明 AG6901在 CaNMT活性位点的构象是比较可靠的.AG6901与 CaNMT活性位点的作用模式见
图 4(B).AG6901主要与 CaNMT活性位点产生疏水和氢键相互作用 , 其分子中呋喃环的作用与 Benzo-
Fig.4　ChemicalstructureofAG6901(A)anditsbindingmodewiththeactivesiteofCaNMT
furan-5分子中咪唑环相类似 , 它与周围相邻的疏水区域 Phe119, Phe240和 Phe339产生比较强的疏水
相互作用.AG6901分子中呋喃环另一侧苯基与附近的 Tyr225产生疏水相互作用 , 与苯基相连的酰胺
胺基与 MCSS计算分析得到的氢键位点 Asp412形成 3对氢键.AG6901分子中磺酰胺的氨基部分与
CaNMT发挥催化功能关键残基 Leu451羧基负离子产生氢键相互作用 , 与磺酰基相连的苯基与邻近的
Tyr354侧链苯基形成 π-π相互作用.AG6901分子的嘧啶环 N原子与氢键作用位点 Tyr107侧链酚羟基
产生氢键相互作用 , 嘧啶环上的甲氧基氧原子与氢键作用位点 Tyr119侧链产生相互作用.比较
AG6901和 Benzofuran-5与 CaNMT活性位点的相互作用可以发现(表 2), AG6901与 CaNMT具有更低
　　　 Table2　ComparisonoftheFlexXdockingenergy, CscoreandAutoDockdockingenergy
betweenCaNMT-1 andBenzofuran-5
Species FlexXE/(kJ· mol-1) Cscore AutoDockEbinding/(kJ· mol-1) AutoDockEdocking/(kJ· mol-1)
AG6901 -177.66 5 -46.62 -61.32
Benzofuran-5 -151.62 4 -45.36 -59.22
122 高 等 学 校 化 学 学 报 　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.29　
的相互作用能 , 说明 AG6901有望成为全新结构类型的 CaNMT抑制剂 , 目前相关的化学合成和活性测
试研究正在进行之中.
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MCSSAnalysisofDrugBindingSitesforCandidaalbicans
N-Myristoyltransferase
SHENGChun-Quan1 , ZHUJie2 , ZHANGWan-Nian1＊ , XUHui1 , SONGYun-Long1 ,
ZHANGMin1 , YAOJian-Zhong1 , MIAOZhen-Yuan1
(1.MilitaryKeyLaboratoryofMedicinalChemistry, SchoolofPharmacy,
2.DepartmentofScienceandResearch, SecondMilitaryMedicalUniversity, Shanghai200433, China)
Abstract　NMTisapromisingtargetforthedevelopmentofnovelanfifungalagentswithanewmodeofac-
tion.InordertoknowtheimportantfunctionalresiduesandregionsintheactivesiteofCandidaalbicans
N-myristoyltransferase(CaNMT)indetail, multiplecopysimultaneoussearch(MCSS)wasusedtoidentifythe
hydrophobicpockets, hydrogen-bondingsitesandelectrostaticnegativesites.TheresultsfromMCSScalcula-
tionrevealthatthereweretwohydrophobicpockets.OnepocketwaslinedwithTyr107, Tyr119, Val108,
Phe117, Phe123, Ala127, Phe176 andLeu33, theotherpocketwaslinedwithPhe115, Phe240 and
Phe339.Moreover, twohydrogen-bondingsiteswereidentifiedbyMCSScalculations.Amongthosehydrogen-
bondingresidues, Tyr119, His227, Asn392andLeu451couldformhydrogenbondwiththebenzofuraninhibi-
torsandTyr107, Asn175, Thr211 andAsp412 werenewlydiscoveredhydrogen-bondingresidues, whichwere
highlyconservedresiduesacrosstheNMTfamilyandwouldplayanimportantroleinthedesignofNMTinhibi-
torswithnovelchemicalscafold.ImportantfunctionalresidueLeu451 couldserveasbothhydrogen-bonding
siteandelectrostaticnegativesite, whichwasindispensableininhibitordesign.Theaboveresultscouldpro-
videimportantcluesforthedenovodesignandvirtualhigh-throughputscreeningofnovelNMTinhibitors.
Keywords　N-Myristoyltransferase;Antifungal;Multiplecopysimultaneoussearch;Drugbindingsite;Drug
design
(Ed.:Y, I)
123　No.1 　 盛春泉等:白色念珠菌 N-肉豆蔻酰基转移酶中药物结合位点的 MCSS分析