全 文 ：植物内生真菌(endophytic fungi)是指在其生
活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织
内部, 而不引起宿主植物表现出（至少暂时不表
现出）明显病症的真菌[1]. 它的存在十分普遍, 到
目前为止, 尚未发现无内生真菌的植物. 内生真
菌次生代谢产物丰富、种类繁多, 是天然产物的
一个重要来源[2~4]. 我们课题组在前期研究中发现
水生植物多裂碎米荠(Cardamine multijuga)内生真
菌隐孢丛赤壳菌株 C2 能产生大量黄色色素, 通
过液体发酵、有机溶剂提取和色谱分离, 从 C2代
谢产物中分离得到两个化合物, 经 NMR、MS等光
谱学方法分别鉴定为蒽茜素（skyrin）(1)和大黄素
（emodin）(2), 并对其抗病原真菌和杀线虫活性进
行了研究.
多裂碎米荠内生真菌隐孢丛赤壳菌 C2
代谢产物研究
收稿日期：2012-09-03；修回日期：2012- 1-29
基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目资助(2011FB034)
作者简介：张昌飞(1985-),男,云南昆明人,硕士研究生,从事微生物代谢产物活性研究；*通讯作者：魏大巧(1970-),女,云南昆明人,昆明
理工大学呈贡校区生命科学与技术学院讲师,主要从事真菌多样性及其代谢产物活性研究,Tel：0871-3399 12,E-mail：602812067@qq.com.
张昌飞1, 任晓光1, 赵春安1, 刘亚君2, 李海燕1, 魏大巧1*
（1. 昆明理工大学 生命科学与技术学院, 中国云南 昆明 650500；
2. 云南大学 生物资源保护与利用重点实验室, 中国云南 昆明 650091）
摘 要： 从多裂碎米荠（Cardamine multijuga）内生真菌隐孢丛赤壳菌 Cryphonectria radicalis C2 的代谢产物中
分离得到两个化合物, 经 NMR、MS 等现代谱学方法分别鉴定为蒽茜素（skyrin）(1)和大黄素（emodin）(2). 活性测
定结果表明, 两个化合物对秀丽隐杆线虫没有杀虫活性. 但蒽茜素对小麦根腐病菌禾旋孢腔菌和稻恶苗藤仓
赤霉菌具有良好的抗真菌活性, 而大黄素对禾旋孢腔菌、 藤仓赤霉菌和魔芋镰刀菌等 7 株植物病原菌均具有
良好的抗菌效果.
关键词： 内生真菌； 蒽茜素； 大黄素； 杀线虫活性； 抗真菌活性
中图分类号： Q939.9 文献标识码： A 文章编号： 1007-7847（2013）01-0043-04
The Metabolites of Endophytic Fungal Cryphonectria radicalis
Isolated from Cardamine multijuga
ZHANG Chang-fei1, REN Xiao-guang1, ZHAO Chun-an1, LIU Ya-jun2,
LI Hai-yan1, WEI Da-qiao1*
(1. Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, Yunnan, China；
2. Laboratory for Conservation and Utilization of Bioresources, Yunnan University, Kunming 650091, Yunnan, China)
Abstract：Two compounds were isolated from the endophytic fungus Cryphonectria radicalis, which was iso-
lated from Cardamine multijuga. Their structures were elucidated on the basis of spectral data. Compound 1
were identified as skyrin and 2 were emodin. Nematicidal activity test indicated that skyrin and emodin have
no nematicidal activity against Caenorhabditis elegans. However, skyrin showed antifungal activities against
Cochliobolus sativus and Gibberella fujikuroi, and emodin showed antifungal activities against all 7 tested
pathogenic fungi.
Key words：endophytic fungi；skyrin；emodin；nematicidal activity；anti-fungi activity
（Life Science Research，2013，17（1）：043～046）
第 17 卷 第 1 期 生命科学研究 Vol．17 No．1
2013 年 2 月 Life Science Research Feb. 2013
DOI:10.16605/j.cnki.1007-7847.2013.01.005
生 命 科 学 研 究 2013 年
1 材料与方法
1.1 仪器设备
Bruker AM-400、DRX-500型超导共振仪(TMS
内标)；VG Auto Spec-3000型质谱仪.
1.2 菌株来源
内生真菌隐孢丛赤壳菌 C2分离自多裂碎米
荠（Cardamine multijuga）, 菌株保存于昆明理工大
学生命科学与技术学院.
1.3 菌株鉴定
1.3.1 形态学鉴定
依据菌株的菌落形态特征、产孢方式及孢子
形态特征进行鉴定.
1.3.2 分子生物学鉴定
用 CTAB 方法提取菌株 C2 的 rDNA, 用
ITS1-F和 ITS4为引物, 对 rDNA进行 PCR扩增,
然后送北京三博生物技术有限公司进行测序.
1.4 菌株发酵与代谢产物的提取分离
在 15 L发酵罐中装入 10 L马铃薯葡萄糖液
体培养基（PDB）, 按 10%接种量接入菌种, 28 ℃
培养 7 d. 发酵液用三层纱布过滤, 收集滤液并减
压浓缩, 依次用石油醚、乙酸乙酯、丙酮萃取, 得
石油醚相浸膏 15.33 g, 乙酸乙酯相浸膏 25.11 g,
丙酮相浸膏 58 g. 乙酸乙酯相经硅胶柱层析, 石
油醚/乙酸乙酯梯度洗脱（4∶1, 3∶1, 2∶1, 1∶1）, 得到
1～6个组分. 组分 6经凝胶柱层析, 再经硅胶柱层
析（石油醚/丙酮 3∶1）洗脱,得到化合物 1（9.7 mg）.
组分 4经过硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯 4∶1）,
其中有丝状黄色晶体析出组分经凝胶柱层析, 过
硅胶柱（石油醚/丙酮 3∶1）,得到化合物 2（8.7 mg）.
1.5 活性测定
1.5.1 材料
线虫：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）.
病原真菌：苹果轮纹梨生囊孢壳菌（Physa-
lospora pyricola）、苹果斑点病菌苹果链格孢（Al-
ternaria mali）、魔芋镰刀菌（Fusarium solani）、黄瓜
枯萎病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、棉花
黄萎病菌（Verticillium dahliae）、小麦根腐病菌禾
旋孢腔菌（Cochliobolus sativus）和稻恶苗藤仓赤
霉菌（Gibberella fujikuroi）.
1.5.2 方法
化合物 1 和 2 分别溶于甲醇和丙酮配制成
300 mg/L的溶液进行活性测定.
杀线虫活性测定：取线虫悬浮液和有机溶剂
溶解的样品加到直径为 6 cm的培养皿中. 将样
品和线虫 (约 600条) 轻轻混匀后于室温下静置.
在解剖镜下随机选择 5～7个视野,于 12、24和 48 h
后分别进行观察, 计数死虫数和总线虫数(用针尖
挑刺, 以线虫僵直不动为死亡). 每个处理 3个重
复, 以含5%丙酮或甲醇 (体积分数)的线虫悬浮液
为阴性对照, 以含 0.5%阿维菌素的线虫悬浮液为
阳性对照,计算样品对线虫的平均校正致死率 [5, 6].
抗真菌活性测定：用无菌打孔器从培养好的
病原菌平板上打下直径为 5 mm的菌片, 放入装
有马铃薯葡萄糖培养基 PDA的平板四周, 中央打
孔, 加入样品, 按照五点对峙培养法, 置于 25 ℃
培养后, 测定抑菌圈直径, 每个处理 3个重复. 抑
菌圈直径大于 10 mm判断为有强抑制作用, 抑菌
圈直径大于 5 mm 而小于 10 mm 有较强抑制作
用, 抑菌圈直径小于 5 mm有较弱抑制作用[7]. 以
丙酮或甲醇作为阴性对照, 以含 2.5 g/L 两性霉素
B（Amphotericin B）的溶剂作为阳性对照.
2 结果
2.1 菌株鉴定结果
菌株 C2在 PDA平板上等径生长, 菌落圆形,
边缘整齐, 菌丝白色, 稀少, 棉絮状, 初为白色, 后
转为棕黄色.培养 2 d后菌落直径 24 mm,培养 4 d
后可达 35 mm, 培养 10 d后达到 85 mm, 长满整
个平板. 促孢后, 产褐色孢子器, 形状不太规则,
内生椭圆形, 无色单孢孢子. 根据菌株 C2的形态
特征、产孢方式和孢子特征,再结合其 ITS序列分
析结果（GenBank中序列号为 GU109283）, 将菌株
C2鉴定为隐孢丛赤壳菌（Cryphonectria radicalis）.
2.2 化合物结构鉴定
化合物 1, 红色针状晶体, 易溶于 DMSO和甲
醇. FABMS m/z 538 [M]+,推断其分子式为 C30H18O10.
1HNMR（DMSO-d6, 500 mHz：δ7.26 (1H, d, 2.6),
7.59(1H, brs), 7.14(1H, brs), 6.67(1H, d, 2.3), 2.48
(3H, s), 12.20(1H, s) , 12.07(1H, s)；13CNMR（DM-
SO-d6, 500 mHz）：δ63.7 s, 125.3 d, 149.9 s, 121.9
d, 110.1 d, 166.2 s, 109.2 d, 166.8 s, 192.1 s, 182.6 s,
137.1 s, 110.8 s, 114.9 s, 134.7 s, 29.7 t. 通过
1HNMR显示,在低场区（δ12.20, 1H, s；12.07, 1H,
s）有两个螯合羟基, 在中低场区（δ6.67, 1H, s, ；
7.14, 1H, s；7.26, 1H, s）有 3个单峰, 判断其具有
苯环结构 , 低场区（δ2.48, 3H, s）是一个甲基 .
13CNMR可以看出, 含有一个甲基（δ29.7t）和 13
44
第 1 期
个不饱和碳（125.3 d, 149.9 s, 121.9 d, 110.1 d,
166.2 s, 109.2 d, 166.8 s, 192.1 s, 182.6 s, 137.1 s,
110.8 s, 114.9 s, 134.7 s）, 结合质谱, 鉴定该化合
物为蒽茜素（skyrin, 1, 1, 6, 6, 8, 8-六羟基-3, 3-二
甲基连二蒽醌）, 以上数据与相关报道[8, 9]一致.
化合物 2, 黄色针状晶体, 易溶于丙酮. EIMS
m/z 270 [M]+. 1HNMR（DMSO-d6, 500 mHz）：δ7.26
(1H, d, 2.6), 7.59(1H, brs), 7.14(1H, brs), 6.67(1H,
d, 2.3)；13CNMR（DMSO-d6, 500 mHz）：δ163.7 s,
125.3 d, 149.9 s, 121.9 d, 110.1 d, 166.2 s, 109.2
d, 166.8 s, 192.1 s. 通过 1HNMR可以显示, 在高
场区（δ2.48, 3H, s） 出现一个单峰 , 在低场区
（δ12.20, 1H, s；12.07, 1H, s）也各自出现一个单
峰, 显示出具有螯合羟基, 在中低场区（δ6.67, 1H,
s, ；7.14, 1H, s；7.26, 1H, s）和化合物 1出现相
同的 3个单峰, 并且通过 13CNMR显示出, 化合物
2和化合物 1出现的峰数目与化学位移相近, 结
合质谱数据, 鉴定该化合物为大黄素（emodin, 1,
3, 8-trihydroxy-6-methyl-9, 10-anthraquinone）. 以上
数据与相关报道[10, 11]一致.
OHOOH
HO
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OHOOH
O
2.3 活性测定结果
从表 1和表 2可以看出, 蒽茜素和大黄素对
秀丽隐杆线虫的校正致死率均低于 5%, 没有杀
线虫活性, 但蒽茜素对小麦根腐病菌禾旋孢腔菌
和稻恶苗藤仓赤霉菌两株病原菌具有良好的抗真
菌活性, 平均抑菌直径分别可达 5 mm和 5.5 mm.
大黄素对禾旋孢腔菌、藤仓赤霉菌和魔芋镰刀菌
等 7株植物病原菌均具有良好的抗菌效果, 平均
抑菌直径在 4.7～7 mm之间, 其中对禾旋孢腔菌
的抑制效果最好, 抑菌直径最高达到 11 mm, 显
示了较好抗菌活性.
图 1 化合物 1 和 2 的结构
Fig.1 Structures of compounds 1 and 2
表 1 蒽茜素和大黄素杀秀丽隐杆线虫结果
Table 1 The results of skyrin and emodin on
Caenorhabditis elegans
Sample
Skyrin
Emodin
12 h
0.52
0.78
24 h
0.78
2.34
48 h
1.00
3.17
The rate of average correction lethal /(%)
表 2 蒽茜素和大黄素抗病原真菌活性结果
Table 2 The antifungal activity of skyrin and emodin on pathogenic fungi
Sample
Skyrin
Emodin
Amphotericin B
Methanol
Acetone
P.pyricola
0
9.5
12
0
0
A.mali
0
8.5
13
0
0
F.solani
0
7.5
12
0
0
F.oxysporum
0
7
12.5
0
0
V.dahliae
0
6.5
14
0
0
C.sativus
5
9
13
0
0
G.fujikuroi
5.5
7
12
0
0
Antifungal activity of various pathogens (inhibition zone diameter)/mm
3 讨论
蒽茜素和大黄素是两种十分常见的蒽醌类化
合物,它们存在于许多植物和微生物中[8~12], 具有抗
虫[13]、抗菌[14, 15]、抗氧化和抗癌[16]等活性. 本研究结
果显示, 蒽茜素和大黄素对秀丽隐杆线虫没有杀
虫活性, 但蒽茜素对小麦根腐病菌和稻恶苗藤仓
赤霉菌两株病原菌具有良好的抗菌活性, 而大黄
素对梨生囊孢壳菌、苹果链格孢、魔芋镰刀菌等 7
种供试病原菌都具有较好的抑菌活性. 菌株 C2
作为植物内生真菌, 能产生蒽茜素和大黄素等对
植物病原菌具有较好抑制效果的代谢产物, 可能
张昌飞等：多裂碎米荠内生真菌隐孢丛赤壳菌 C2代谢产物研究 45
生 命 科 学 研 究 2013 年
在植物-内生真菌共生体系中起到保护植物、抵抗
病原菌侵染的作用.
此外, 内生真菌菌株 C2产生的蒽茜素和大
黄素, 色彩鲜艳、产量高、发酵周期较短, 可进行
规模化生产而应用于医药、化工等产业, 具有一
定的应用前景.
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