全 文 ：北方园艺２０１２（０７）：６１～６４ 植物·园林花卉·
第一作者简介：田凡（１９８５－），女，硕士，现主要从事兰科植物菌根
真菌研究工作。
责任作者：白新祥（１９７９－），男，博士，副教授，现主要从事兰科花卉
资源的遗传多样性与保护利用研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：２５４７１５１７４＠
ｑｑ．ｃｏｍ。
基金项目：贵州省科技厅社会发展科技攻关资助项目（黔科合ＳＹ
字［２００８］３０２０号）；贵州大学人才引进基金资助项目（贵大人基合
字［２００７］４１号）；贵州省农业科学院博士科研启动资助项目（黔农
科院人才启动项目［２００９］００６号）；贵州省科技计划资助项目（黔
科合院所创能［２０１０］４００２）。
收稿日期：２０１１－１２－２８
硬叶兜兰菌根真菌的分离及培养特性研究
田 　 凡１，朱 国 胜２，３，桂 　 阳２，３，白 新 祥１
（１．贵州大学，贵州 贵阳５５００２５；２．贵州省农业科学院，贵州省现代中药材研究所，贵州 贵阳５５０００６；
３．贵州省农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳５５０００６）
　　摘　要：采用单菌丝团法分离硬叶兜兰菌根真菌，纯化后，用打孔法培养菌株并观察形态特
征并测定生长速度，初步鉴定了８株内生真菌（ＤＪＹＹＤＬ００１、ＤＪＹＹＤＬ００３、ＤＪＹＹＤＬ００４、
ＤＪＹＹＤＬ００６、ＤＪＹＹＤＬ００８、ＤＪＹＹＤＬ００９、ＤＪＹＹＤＬ０１１、ＤＪＹＹＤＬ０１５）。结果表明：单菌丝团法分离
出的菌丝团在恒温培养１２ｈ后镜检及吸取萌发菌丝团为最佳时间。没有经过升汞处理的根段菌
丝团污染率最大，而处理２～３ｍｉｎ后根段的菌丝团污染率最小。
关键词：硬叶兜兰；菌根真菌；菌丝团；分离；培养
中图分类号：Ｓ　６８２．３１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１２）０７－００６１－０４
　　硬叶兜兰（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ　ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ）属兰科
（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）兜兰属（Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ），主要分布于我国
的重庆南部、广西西部至北部、贵州东北部至西南部、湖
南西南部、云南东南部以及越南北部［１－２］。其株形俊俏，
花形奇特，具有非常高的观赏价值，曾勇夺世界兰展全
场总冠军，惊艳兰坛，园艺学界常称之为“玉女”［３］。由于
过度采集、走私出境猖獗以及生境破坏等原因，近十几
年来野生硬叶兜兰的数量急剧减少，分布区逐渐萎缩，
已经到了灭绝的边缘。因此，硬叶兜兰野生资源的保护
和人工繁育问题亟待引起社会各界的重视。
自然条件下，兰科植物的根系与真菌共生，形成兰
科菌根。自２０世纪初由Ｂｅｒｎａｒｄ和Ｂｕｒｇｅｆ揭示兰科植
物菌根之谜，并指出真菌的存在可促进种子萌发后，国
外相继开展了兰科植物菌根真菌的研究。我国在该领
域的研究工作起步较晚，近年来也有一些学者对兜兰属
植物菌根真菌进行了研究［４－６］。由于兰科植物菌根真菌
能促进种子胚的萌发和萌发后的生长发育，因此在兰科
植物的人工栽培中，引入兰科菌根技术具有广阔的应用
前景。现采用新研发的一种兰科植物菌根真菌分离方
法－单菌丝团分离法对硬叶兜兰菌根真菌进行分离研
究［７］，为其有性繁殖及人工培育提供理论基础和实践经
验，最终实现硬叶兜兰的保护和开发利用。
１　材料与方法
１．１　试验材料
１．１．１　供试植物　野生硬叶兜兰成年植株采于贵州省
铜仁地区德江县青龙镇潮水河，选择长势良好的植株。
１．１．２　培养基　分离菌根真菌培养基：为双抗ＰＤＡ培养
基，马铃薯２００ｇ，琼脂６ｇ，葡萄糖１５ｇ，补水至１　０００ｍＬ，
ｐＨ自然，１５０μｇ／ｍＬ庆大霉素和１００μｇ／ｍＬ青霉素。培
养菌根真菌培养基：为标准培养基，美国ＢＤ（Ｄｉｆｃｏ）公司生
产的标准ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ　ｄｅｘｔｒｏｓｅ　ａｇａｒ）培养基和ＣＭＡ（Ｃｏｒｎ
ｍｅａｌ　ａｇｅｒ）培养基。
１．１．３　主要仪器设备　ＳＷ－ＣＪ－ＩＧ单人净化工作台，
ＧＺ－２５０Ｓ生化培养箱，ＣＸ２１ＦＳ１Ｃ生物显微镜，１０１－１ＡＢ电
热鼓风干燥箱，ＭＬＳ－３７５０全自动高压灭菌器，电磁炉，微
波炉。
１．２　试验方法
１．２．１　根的处理及含菌丝团根段的选择　截取的硬叶兜
兰新鲜根段于流水状态下冲洗干净，分装于盛有无菌水的
培养皿中，在超净工作台上用解剖刀轻轻刮掉根毛、根被、
表皮和其它附属物，显微镜检。选出具有菌丝团的根段
（图１－１～２），无菌水冲洗干净，再用０．１％升汞溶液分别处
理０、１、２、３ｍｉｎ，无菌水冲洗４～５次，将具有菌丝团的根切
成３ｃｍ小段（图１－３），然后用解剖针和镊子刮根段，使单
菌丝团从皮层细胞中游离出来，扩散到装有１０ｍＬ无菌水
的直径为６０ｃｍ培养皿中，２４℃恒温箱培养，分别在６、１２
和１８ｈ后显微镜观察。
１６
·园林花卉·植物 北方园艺２０１２（０７）：６１～６４
１．２．２　菌丝团的选择及分离培养　在显微镜暗视野中找
到生长出菌丝的菌丝团或菌丝结（图１－４），然后将光线调
到最强，肉眼找到视界范围内的菌丝团，用１　０００μＬ的移
液枪吸取菌丝团，每次吸取４５μＬ菌丝团液，然后转接到
面积为１ｃｍ２小块双抗ＰＤＡ培养基上（图１－５），置于２４℃
恒温箱培养至菌丝开始生长。
１．２．３　菌丝团的纯化及培养　显微镜下镜检小块培养
基，找到长出菌丝的菌丝团，将菌丝团从小块培养基上切
下，然后转接至小块ＰＤＡ培养基（图１－６），２４℃恒温培养，
当菌丝生长至０．５ｃｍ长时，切取菌丝尖端转接直径为
９０ｃｍ的ＰＤＡ培养皿，纯化后转接试管，培养保存。
１．２．４　菌株生长速度的测定　利用直径０．５ｃｍ的打孔
器打取菌片，转接至ＢＤＰＡＤ和ＢＤＣＭＡ标准培养基，每
个菌株每种培养做３次重复，记录下接种时间，然后以菌
片中心为圆点，向８个方向各画一条线，在每条线与菌片
的交点作上标记，２４℃恒温培养。第２天开始观察，在每
条线上标记对应的菌丝生长点，注明时间，然后选择稳定
生长的２～３次标记，用此区间的长度除以时间（时间以ｈ
计）从而算出稳定的生长速度，算出３次重复的稳定生长
速度，再算出平均值即为该菌株在标准培养基上的生长
速度［８］。
图１　硬叶兜兰含菌丝团根段的选择
注：１－１：从土壤中挖出的整个植株；１－２：去除了根毛、表皮、根被和其它附属物的根段；１－３：具有菌丝团的根段；１－４：菌丝团被刮制释放于无菌水中，孵
育的菌丝团长出菌丝；１－５：抽取的菌丝团液置于小块培养基上；１－６：萌发的菌丝团转接至小块培养基。
２　结果与分析
２．１　试验方法的影响
２．１．１　培养时间对菌丝团萌发率的影响　硬叶兜兰虽然
具有典型的兰科植物菌根结构，菌根真菌菌丝团主要分布
在根中部的皮层细胞中，经常集中分布于横截面的某一区
域，同于杜鹃兰［９］，但分布量较少且活力也较低。由表１
可知，将刮取的菌丝团在２４℃恒温培养６ｈ后显微镜镜检
的萌发率很低，１２ｈ后镜检的萌发率较６ｈ后镜检的萌发
率高，而１８ｈ后萌发率更高，但是１８ｈ后抽取的萌发菌丝
团污染量较大，所以筛选出硬叶兜兰菌根真菌采用单菌丝
团法分离出的菌丝团在２４℃恒温培养１２ｈ后镜检及吸取
萌发菌丝团为最佳时间。
表１　　培养时间对菌丝团萌发率的影响
２４℃恒温培养时间／ｈ菌丝团数／个萌发菌丝的菌丝团数／个 萌发的菌丝团比率／％
６　 １００　 ６　 ６．０
１２　 １００　 ２１　 ２１．０
１８　 １００　 ２８　 ２８．０
２．１．２　升汞灭菌时间对菌丝团液污染率的影响　据报
道，刮取的菌丝团恒温培养后的４～６ｈ镜检和吸取菌丝
团为最佳时间［１０］，因为培养时间越短菌丝团的污染率也
相对较低。但是，由表１得知镜检菌丝团萌发率的时间为
２４℃恒温培养１２ｈ后为最佳，所以该试验结果为１２ｈ后
观察的试验结果。由表２可知，没有经过升汞处理的根段
菌丝团污染率为７６．７％，而处理２ｍｉｎ和３ｍｉｎ后根段的
菌丝团污染率为２６．７％。由于升汞的毒性很大，处理时间
应当越短越好，所以筛选出对硬叶兜兰根段灭菌处理的最
佳时间为２ｍｉｎ。
表２　　升汞灭菌时间对菌丝团液污染率的影响
时间／ｍｉｎ 抽取４５μＬ菌丝团液数／次 污染菌丝团液的次数／次 污染率／％
０　 ３０　 ２３　 ７６．７
１　 ３０　 １３　 ４３．３
２　 ３０　 ８　 ２６．７
３　 ３０　 ８　 ２６．７
　　注：以上是吸取菌丝团液２４℃恒温培养１２ｈ后观察的试验结果。
２．２　硬叶兜兰菌根真菌的培养特征
试验通过单菌丝团法分离出８株菌根真菌，分别命
名为ＤＪＹＹＤＬ００１、ＤＪＹＹＤＬ００３、ＤＪＹＹＤＬ００４、ＤＪＹＹＤＬ００６、
ＤＪＹＹＤＬ００８、ＤＪＹＹＤＬ００９、ＤＪＹＹＤＬ０１１、ＤＪＹＹＤＬ０１５，各
菌株培养特征如下。
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北方园艺２０１２（０７）：６１～６４ 植物·园林花卉·
２．２．１　ＤＪＹＹＤＬ００１　ＢＤＰＤＡ培养基上气生菌丝绒毛
状，菌落边缘整齐，细丝状，淡黄色，形成同心环，菌丝生
长速度０．１３～０．１８ｍｍ／ｈ；ＢＤＣＭＡ培养基上菌丝贴培
养基生长，不形成气生菌丝，生长速度０．１７～０．１９ｍｍ／ｈ
（图２）。
图２　ＤＪＹＹＤＬ００１在ＢＤＰＤＡ培养基上的菌落形态特征
（左：正面；右：背面）
２．２．２　ＤＪＹＹＤＬ００３　ＢＤＰＤＡ培养基上菌落早期边缘
整齐，厚薄均匀，气生菌丝细绒状，后期菌落中央气生菌
丝白色呈棉花状隆起，菌丝的生长速度０．１２～
０．１５ｍｍ／ｈ，念珠状细胞球形或椭圆形；ＢＤＣＭＡ培养基
上贴培养基生长，无气生菌丝，生长速度０．１９～０．２９ｍｍ／ｈ
（图３）。
图３　ＤＪＹＹＤＬ００３在ＢＤＰＤＡ培养基上的菌落形态特征
（左：正面；右：背面）
２．２．３　ＤＪＹＹＤＬ００４　ＢＤＰＤＡ培养基上气生菌丝雪白
色，细绒状，边缘不整齐，生长较慢，菌丝生长速度０．０８～
０．１３ｍｍ／ｈ；ＢＤＣＭＡ培养基上形成气生菌丝，菌丝生长
速度０．１２～０．１５ｍｍ／ｈ（图４）。
图４　ＤＪＹＹＤＬ００４在ＢＤＰＤＡ培养基上的菌落形态特征
（左：正面；右：背面）
２．２．４　ＤＪＹＹＤＬ００６　ＢＤＰＤＡ培养基上气生菌丝绒毛
状，菌落边缘稀疏不均匀，白色，菌丝生长速度０．１３～
０．１８ｍｍ／ｈ；ＢＤＣＭＡ培养基上形成气生菌丝，菌丝生长
速度０．０８～０．１７ｍｍ／ｈ（图５）。
２．２．５　ＤＪＹＹＤＬ００８　ＢＤＰＤＡ培养基上菌落早期贴培
养基生长，菌落表面光滑，边缘整齐，厚薄均匀，后期产
生气生细绒状菌丝，不明显，菌落乳白色，形成同心环，
菌丝的生长速度０．１２～０．１４ｍｍ／ｈ，念珠状细胞球形；
ＢＤＣＭＡ培养基上贴培养基生长，无气生菌丝，生长速度
０．１９～０．２９ｍｍ／ｈ（图６）。
２．２．６　ＤＪＹＹＤＬ００９　ＢＤＰＤＡ培养基上菌落早期贴培
养基生长，菌落表面光滑，蜡质，边缘波纹状，厚薄均匀，
后期菌落中央开始出现墨绿色孢子，菌丝的生长速度
０．０７～０．０９ｍｍ／ｈ；ＢＤＣＭＡ培养基上贴培养基生长，无
气生菌丝，生长速度０．１１ｍｍ／ｈ（图７）。
图７　ＤＪＹＹＤＬ００９在ＢＤＰＤＡ培养基上的菌落形态特征
（左：正面；右：背面）
２．２．７　ＤＪＹＹＤＬ０１１　ＢＤＰＤＡ培养基上菌落贴培养基
生长，菌落表面光滑，菌落边缘整齐，厚薄均匀，较薄显
细纹状，淡粉色，质地如粉饼，菌丝的生长速度０．０８～
０．０９ｍｍ／ｈ；ＢＤＣＭＡ培养基上贴培养基生长，无气生菌
丝，生长速度０．０８～０．０９ｍｍ／ｈ（图８）。
图８　ＤＪＹＹＤＬ０１１在ＢＤＰＤＡ培养基上的菌落形态特征
（左：正面；右：背面）
２．２．８　ＤＪＹＹＤＬ０１５　ＢＤＰＤＡ培养基上菌落早期贴培
养基生长，边缘不规则，厚薄均匀，细绒状菌丝，菌丝的
生长速度０．０８～０．１１ｍｍ／ｈ，念珠状细胞球形或椭圆形；
ＢＤＣＭＡ培养基上贴培养基生长，无气生菌丝，生长速度
０．２０～０．２７ｍｍ／ｈ（图９）。
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·园林花卉·植物 北方园艺２０１２（０７）：６１～６４
图９　ＤＪＹＹＤＬ０１５在ＢＤＰＤＡ培养基上的菌落形态特征
（左：正面；右：背面）
３　结论与讨论
兰科植物菌根真菌的分离方法主要包括组织块表
面消毒分离法和单菌丝团分离法。该研究采用新建立
的单菌丝团法对硬叶兜兰菌根真菌进行分离，解决了兰
科植物菌根真菌分离过程中的污染问题和分离效率低
的问题。研究过程中，由于硬叶兜兰菌丝团活力较低，
不易萌发，所以延长了菌丝团在无菌水中的培养时间，
同时也致使菌丝团极易污染，于是在操作过程中将根段
用０．１％升汞溶液消毒，可能杀死部分的菌丝团，从而影
响了硬叶兜兰菌根真菌动态变化的萌发率。从试验中
可以看出，升汞的使用和消毒时间的长短将影响根内内
生菌的分离，应根据具体的试验材料对根段的表面消毒
做相应的调整，选择适宜的灭菌试剂和灭菌时间是进行
内生菌分离培养时应该仔细考虑的问题，需要不断的探
索，寻求新的消毒剂加以代替，将是下一步试验的关键
所在。
分离得到的菌根真菌在培养过程中观察发现，硬叶
兜兰内生真菌不同种类的生长速率差异很大。
ＤＪＹＹＤＬ００１、ＤＪＹＹＤＬ００３、ＤＪＹＹＤＬ００８、ＤＪＹＹＤＬ００６这
４株菌均能在２周内长满培养皿。ＤＪＹＹＤＬ００９、
ＤＪＹＹＤＬ０１１、ＤＪＹＹＤＬ０１５和ＤＪＹＹＤＬ００４生长速率稍
　　　　
慢，这可能是真菌本身的生长特性或这种菌的种群数量
所决定。
研究兰科植物与共生真菌的关系以及利用共生真
菌来促进种子萌发和幼苗生长已成为兰科植物繁殖生
物学研究的重要方向。该试验只是对硬叶兜兰菌根真
菌共生关系进行初步的观察和探讨，进一步对硬叶兜兰
菌根真菌进行系统而深入的研究，将促进兰科植物的快
速繁殖、减轻其面临的濒危压力，对其保护与开发利用
具有重要意义。
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Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　Ｆｕｎｇｉ
ＴＩＡＮ　Ｆａｎ１，ＺＨＵ　Ｇｕｏ－ｓｈｅｎｇ２，３，ＧＵＩ　Ｙａｎｇ２，３，ＢＡＩ　Ｘｉｎ－ｘｉａｎｇ１
（１．Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　５５００２５；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｏｒｄｅｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　５５０００６；３．Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　５５０００６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｉｇｈｔ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｅｎｄｏｐｈｙｔｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｐｅｌｏｔｏｎ　ｏｆ　Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ　ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ．Ａｆｔｅｒ
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ｒｏｏｔ　ｓｅｇｍｅｎｔ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｍｉｎｉｍｕｍ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍ　ｍｉｃｒａｎｔｈｕｍ；ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ　ｆｕｎｇｉ；ｐｅｌｏｔｏｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｃｕｌｔｕｒｅ
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