全 文 ：　第28卷 第3期　　　　　　 　　　　　　　　　宁夏大学学报(自然科学版) 2007年9月
　Vol. 28 No. 3　　　　　　　　 Journal o f Ningxia Unive rsity(Natural Science Edition) Sep. 2007
文章编号:0253-2328(2007)03-0264-04
培养基类型 、环境因子和激素对发菜细胞增殖的影响
梁文裕 , 　赵　辉 , 　谢亚军 , 　王　俊
(宁夏大学 生命科学学院 ,宁夏 银川　750021)
摘　要:为探讨发菜(Nostoc f lagel li forme)生长增殖所需的适宜条件 , 研究了培养基类型 、pH 值 、温度 、光周期 、光
照强度和激素等对发菜细胞生长增殖的影响. 结果表明 , 发菜细胞在 BG11 培养基中的增殖情况好于在 BG110 ,
MS ,土壤浸提液(S EL)和自制培养基(ZZ)中的增殖情况.在 BG11 培养基中 ,当 pH 值为 7. 5 ,温度为 25 ℃,光周期
为 12 h 光照 12 h 黑暗 , 光照强度为2 000 lx时 , 发菜细胞增殖明显. 此外 ,分别附加 2. 0 mg /L NAA , 1. 0 mg / L 6-BA
和 2. 0 mg / L 2 , 4-D对发菜细胞增殖有一定的促进作用.
关键词:发菜;细胞培养;BG11 培养基;pH;温度;光周期;光照强度;激素
分类号:(中图)Q949　　　文献标志码:A
　　发菜(Nostoc f lagell i forme)是一种世界性分
布的陆生经济藻类 ,属蓝藻门(Cyanophyta), 念珠
藻属(Nosto c). 发菜在我国主要分布于西北干旱半干
旱荒漠草原地区 ,是干旱荒漠地区主要的生物固氮资
源 ,且含有丰富的胶质和多种营养物质[ 1] ,是名贵的食
品和传统出口商品 ,具有重要的经济和社会价值.然
而 ,由于发菜的自然生长繁殖速度缓慢 ,分布范围小 ,
产量有限 ,加之长期无计划掠夺式采收 ,使得有限的发
菜资源濒临枯竭 ,草原的生态环境也遭到严重破坏.为
此 ,国家明令禁止采集发菜 ,取缔发菜贸易 ,发菜已被
列为国家一级保护植物.近几年来 ,国内外一些学者对
发菜的分布 、生态 、生理生化 、生长发育 、显微结构及人
工培养等做了大量的研究 ,取得了一定的成绩[ 2 - 7] .但
到目前为止大规模培养发菜或发菜细胞并未有突破性
进展 ,其主要原因是由于对发菜生命活动中的许多生
理特性和生长所需的环境条件没有深入的了解.为此 ,
本研究以发菜细胞和藻丝为研究对象 ,通过液体培养
途径 ,探讨了培养基类型 、温度 、pH 值 、光周期 、光照强
度、激素等对发菜细胞增殖的影响 ,以期获得其生长增
殖所需的适宜条件 ,为今后大规模培养发菜细胞及发
菜藻体奠定实验基础.
1　材料与方法
1. 1　材料
野生发菜和土壤样品均于 2004年采集于宁夏
贺兰山发菜自然生长地. 称取 1. 0 g 风干的发菜在
蒸馏水中浸润2 ～ 3 h ,至藻体不再吸水膨胀 ,光恢复
6 h(1 000 lx).然后用φ=75 %的酒精灭菌30 ～ 40 s ,用
无菌水漂洗4～ 5次 ,每次1min , 再用w=4%的HgCl2
溶液浸泡6 min , 无菌水漂洗 5 ～ 6次 ,每次 1min.在无
菌条件下轻轻压碎 ,然后用无菌水洗入灭菌的烧杯中 ,
用纱布过滤 ,镜检细胞悬液.在温度 25 ℃,光照强度
1 500 lx和光周期 12 h 光照 12 h黑暗的条件下培养细
胞作为实验用藻种 ,然后将处于对数生长期的细胞进
行计数 ,配制细胞数为 4×106 个/mL 的母液 ,然后取
1. 0 mL母液接种到100mL培养液中.
1. 2　方法
将发菜自然生长地土壤与蒸馏水按质量比 1∶5
混合 ,浸泡24 h ,过滤 ,澄清后取上清液作为土壤浸提液
(SEL)培养基.根据一般蓝藻培养所需元素和发菜生物
学特性[ 8]自制培养基(ZZ)(表 1),同时选用 MS ,BG11 ,
BG110等作为培养基. 在 pH 值为 7. 0 ,光照时温度
25 ℃,黑暗时 15 ℃,温差 10 ℃,日光灯垂直照射 ,光照
强度1 500 lx ,12 h光照 12 h黑暗交替进行的条件下在
人工气候模拟室中进行培养基的筛选.
表 1　自制培养基(ZZ)配方 mg /L
Ca(NO3)2 4H2O K 2HPO 4 MgSO 4 7H 2O Na2CO3
40 50 75 20
Na2 SiO 3 9H 2O 柠檬酸铁铵 柠檬酸
25 6 6
　　将筛选出的培养基分别按以下条件接种发菜细胞
进行实验:①温度为25 ℃,光照强度为 2 000 lx ,光周期
收稿日期:2005-08-31
基金项目:宁夏自然科学基金资助项目(2004B002)
作者简介:梁文裕(1969-), 男 ,副教授 , 硕士 ,主要从事植物生物技术及植物发育分子生物学研究.
为12 h黑暗12 h光照 ,pH 值梯度为 5. 0 ,6. 0 ,7. 0 ,7. 5 ,
8. 0 ,8. 5;②pH 值为7. 5 ,光照强度为2 000 lx ,光周期为
12 h黑暗 12 h 光照 ,温度为 10 ,15 ,20 , 25 , 30 , 35 ℃;
③温度为 25 ℃,光照强度为 2 000 lx , pH 值为 7. 5 ,光
周期为连续黑暗 ,连续光照 , 12 h黑暗 12 h光照 ,24 h
黑暗24 h光照 ,24 h光照12 h黑暗;④pH值为 7. 5 , 温
度为 25 ℃,光周期为 12 h黑暗 12 h光照 ,光照强度为
连续黑暗 ,500 , 1 000 ,2 000 , 3 000 , 4 000 lx;⑤温度
为25 ℃, pH 值为 7. 5 ,光照强度为 2 000 lx ,光周期
为12 h黑暗12 h光照 ,激素配比为 0. 5 ,1. 0 ,2. 0 ,5. 0 ,
10. 0mg /L NAA ,0. 5 ,1. 0 ,2. 0 , 5. 0 ,10. 0 mg /L 6-BA ,
0. 5 , 1. 0 , 2. 0 ,5. 0 ,10. 0 mg /L 2 ,4-D ,空白对照中不
加任何激素 ,在人工气候模拟室中进行培养. 采用浮
游植物计数筐记录细胞数目 ,每 5 d 测量 1次 ,30 d
为 1个周期 ,重复 3次 ,取平均值.
2　结果
2. 1　培养基类型的筛选
图 1为发菜细胞在不同类型培养基中的增殖状
况.由图 1可知 ,不同培养基中发菜细胞增殖速率差
异显著(P<0. 05). BG11 培养基中细胞增殖最好 ,
培养 30 d时细胞密度达 9. 437×104 个 /mL ,平均增
长率为 135. 92%, BG110培养基中的细胞增殖情
况次之. 而 MS 培养基和自制培养基中的发菜细胞
增殖状况较差 ,培养 30 d 时 ,细胞密度仅为5. 126×
104 个 /mL 和 6. 348×104 个 /mL. 上述结果表明 ,
在相同条件下 BG11培养基比较适合于发菜细胞的
培养 ,而 MS 和 ZZ 培养基培养效果较差.
图 1　发菜细胞在不同类型培养基中的增殖情况
2. 2　pH值对发菜细胞增殖的影响
图 2为 BG11培养基中不同 pH 值下发菜细胞
的增殖情况. 由图 2可知 ,在 BG11 培养基中 ,碱性
环境和酸性环境条件下发菜细胞的增殖速率有明显
差异(P<0. 05).当 pH 值为 5. 0时发菜细胞增殖状
况最差 ,培养 15 d时细胞已基本消失 ,而当 pH 值
为 7. 5时发菜细胞增殖状况较好 ,细胞数量高于其
他几种 pH 值时的细胞增殖数量.由此表明 ,适合发
菜细胞生长的液体培养基的 pH 值为 7. 5 ,过高或
过低的 pH 值均不利于其生长.
图 2　不同 pH值下发菜细胞的增殖情况
2. 3　温度对发菜细胞增殖的影响
图 3为BG11培养基中不同温度条件下发菜细胞
的增殖情况.由图 3可知 ,25 ℃时发菜细胞增殖状况最
好 ,培养30 d时细胞密度达10. 435×104 个 /mL ,30 ℃
时发菜细胞增殖状况次之.而 10 ℃时发菜细胞增殖
状况最差 , 培养 30 d 时 , 细胞密度仅为 5. 845×
10
4 个 /mL.上述结果表明 ,在相同条件下 25 ℃比较
适合于发菜细胞的培养 ,过高或过低的温度都不利于
发菜细胞的生长和增殖.
图 3　不同温度下发菜细胞的增殖情况
2. 4　光周期对发菜细胞增殖的影响
图 4为 BG11培养基中不同光周期下发菜细胞
的增殖情况.由图 4可知 ,当采用 12 h 光照 12 h黑
暗 ,24 h光照 24 h黑暗 , 24 h 光照 12 h黑暗的光周
期时 ,发菜细胞增殖状况较好 ,各种不同类型光周
期间的差异不显著(P>0. 05). 光周期为 12 h光照
12 h黑暗时的细胞数量稍高于其他几种光周期时的
细胞数量 ,而光周期为连续黑暗时发菜细胞不仅没
有增殖 ,且呈现明显下降的趋势. 上述结果表明 ,发
菜细胞在人工培养条件下的光周期为 12 h光照12 h
黑暗 ,与其在自然条件下基本相似.
图 4　不同光周期下发菜细胞的增殖情况
265　第 3期　　　　　　　　　梁文裕等:培养基类型 、环境因子和激素对发菜细胞增殖的影响
2. 5　光照强度对发菜细胞增殖的影响
图 5为 BG11培养基中不同光照强度下发菜细
胞的增殖情况. 由图 5 可知 ,当采用 12 h 光照 12 h
黑暗的光周期时 ,不同光照强度下的发菜细胞增殖
呈现 3种状况 ,光照强度为1 000 lx 和 2 000 lx 时细
胞增殖明显 ,黑暗和光照强度为 4 000 lx 时细胞数
量呈现下降趋势 ,光照强度为 500 lx 和 3 000 lx 时
细胞增殖平缓 , 30 d 时 3 组之间具有显著性差异
(P<0. 05).但总体上看光照强度在 2 000 lx 时发菜
细胞增殖状况较好 ,细胞数量高于其他几种光照强
度时的细胞数量 ,而在光照强度为 4 000 lx 的条件
下 ,发菜细胞增殖状况相对较差 ,细胞密度自 15 d
后呈下降趋势. 表明发菜细胞在人工培养条件下其
适宜的光照强度在 2 000 lx 左右 ,过高或过低的光
照强度对发菜细胞的生长和增殖均不利.
图 5　不同光照强度下发菜细胞的增殖情况
2. 6　激素对发菜细胞增殖的影响
表 2为 BG11培养基中不同浓度 NAA 对发菜
细胞增殖的影响. 由表 2 可知 ,在其他条件相同的
情况下 ,2. 0 mg /L NAA对发菜细胞增殖的促进作
用好于其他浓度 NAA 的促进作用 ,培养 30 d时 ,细
胞密度可达 11. 442×104 个 /mL ,而加入 0. 5 mg /L
和 10. 0 mg /L NAA 时细胞密度分别为 10. 025×
104 个 /mL 和 6. 453×104 个 /mL ,表明 NAA 浓度
过高或过低都不利于细胞的增殖 ,尤其是过高的浓
度会显著抑制细胞的生长.
　　表 3为 BG11培养基中不同浓度 6-BA对发菜细
胞增殖的影响. 由表 3可知 ,在其他条件相同的情况
下 ,1. 0 mg /L 6-BA对发菜细胞增殖的促进作用好于
其他浓度 6-BA 的促进作用 ,但加入 0. 5 mg /L 和
10. 0mg /L 6-BA 时细胞的增殖情况较差 ,表明 6-BA
浓度过高或过低均不利于细胞的增殖.表 4为 BG11培
养基中不同浓度 2 ,4-D对发菜细胞增殖的影响.由表 4
可知 ,在其他条件相同的情况下 ,2. 0mg /L 2 ,4-D对发
菜细胞的增殖有显著的促进作用 ,培养 30 d时 ,细胞密
度可达11. 623×104 个 /mL ,而加入 10. 0 mg /L 2 ,4-D
时过会显著抑制细胞的生长.
3　讨论
3. 1　培养基类型与发菜细胞增殖的关系
比较 5种培养体系中发菜细胞的增殖状况(图
1),培养 30 d时细胞密度由大到小的培养基依次为
BG11 ,BG110 , SEL , ZZ , MS. 从培养基的成分及适
用性方面分析 , BG11 培养基是一种较适合固氮微
生物生长的培养基[ 9] ,发菜是一种固氮蓝藻 ,因此 ,
发菜细胞在 BG11 培养基中生长增殖状况良好.
BG110培养基是未加 NaNO 3 的 BG11培养基 ,其发
菜细胞增殖状况仅次于 BG11 , 说明在缺氮的条
件下发菜虽然能够通过固氮作用得到所需的氮源 ,
表 2　BG11 培养基中不同浓度 NAA 对发菜细胞增殖的影响
培 养 基 类 型 发菜细胞平均数量 /(104 个 mL - 1)
0 d 5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d
30 d 时增长率
/ %
BG11 4. 000 4. 867 6. 897 8. 953 9. 795 10. 213 10. 435 160. 88
BG11+0. 5 mg /L NAA 4. 000 5. 225 6. 457 8. 995 9. 235 9. 447 10. 025 150. 63
BG11+1. 0 mg /L NAA 4. 000 5. 335 7. 887 10. 201 10. 623 10. 885 11. 234 180. 85
BG11+2. 0 mg /L NAA 4. 000 5. 886 8. 125 10. 321 10. 992 11. 345 11. 442 186. 05
BG11+5. 0 mg /L NAA 4. 000 6. 681 7. 862 10. 002 10. 227 10. 326 10. 568 164. 20
BG11+10. 0 mg / L NAA 4. 000 4. 560 5. 014 5. 843 6. 226 6. 424 6. 453 61. 33
表 3　BG11培养基中不同浓度 6-BA对发菜细胞增殖的影响
培 养 基 类 型 发菜细胞平均数量 /(104 个 mL - 1)
0 d 5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d
30 d 时增长率
/ %
BG11 4. 000 4. 867 6. 897 8. 953 9. 795 10. 213 10. 435 160. 88
BG11+0. 5 mg / L 6-BA 4. 000 5. 548 7. 102 8. 236 10. 012 10. 198 10. 225 155. 62
BG11+1. 0 mg / L 6-BA 4. 000 5. 886 8. 231 9. 465 10. 324 10. 778 10. 983 174. 58
BG11+2. 0 mg / L 6-BA 4. 000 5. 335 6. 512 8. 135 9. 231 9. 996 10. 024 150. 60
BG11+5. 0 mg / L 6-BA 4. 000 5. 123 6. 381 7. 856 8. 767 9. 231 9. 454 136. 35
BG11+10. 0 mg /L 6-BA 4. 000 4. 652 5. 024 5. 646 6. 147 6. 219 6. 428 60. 70
表 4　BG11 培养基中不同浓度 2 , 4-D对发菜细胞增殖的影响
培 养 基 类 型 发菜细胞平均数量 /(104 个 mL - 1)
0 d 5 d 10 d 15 d 20 d 25 d 30 d
30 d 时增长率
/ %
BG11 4. 000 4. 867 6. 897 8. 953 9. 795 10. 213 10. 435 160. 88
BG11+0. 5 mg /L 2 , 4-D 4. 000 4. 667 6. 771 10. 301 10. 434 11. 223 11. 227 180. 68
BG11+1. 0 mg /L 2 , 4-D 4. 000 5. 778 8. 012 10. 201 10. 623 10. 885 11. 234 180. 85
BG11+2. 0 mg /L 2 , 4-D 4. 000 5. 807 8. 113 10. 334 10. 982 11. 410 11. 623 190. 58
BG11+5. 0 mg /L 2 , 4-D 4. 000 5. 534 6. 765 7. 674 8. 995 9. 221 9. 301 142. 53
BG11+10. 0 mg / L 2 , 4-D 4. 000 4. 562 4. 879 5. 536 6. 012 6. 165 6. 167 54. 18
266 宁夏大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　第 28卷　
但其固氮作用要消耗大量的能量 ,必然会对生长增殖
造成不利影响.土壤浸提液直接来源于发菜生长地 ,生
活基质与其原生境相似且营养成分较为复杂 ,基本上
可以满足发菜生长的营养需求 ,但由于其成分难以确
定 ,稳定性和可操作性差 ,因此在实际应用中仍有许多
问题需要解决. ZZ培养液可能由于其成分相对过于简
单 ,无法较好地满足发菜细胞生长增殖的需求. MS培
养基虽然含有大量的碳源 ,但对于不需要大量合成胶
质鞘的单细胞和藻丝可能并不是最佳选择.
3. 2　环境因子与发菜细胞增殖的关系
金洪等[ 6] 认为 ,发菜生长在 pH 值为 8. 0 ～ 9. 0的
环境中好于其他 pH值环境 ,而本文实验结果表明 pH
值在7. 5左右时发菜细胞的增殖情况最好.分析认为 ,
发菜藻体是由许多外被胶质包被的藻丝包埋在公共胶
鞘中形成的丝状体 ,碱性环境有利于抑制微生物的繁
殖而保护胶鞘免受破坏 ,而单细胞或单细胞藻丝处于
无菌的液体环境中时 ,其生理代谢机制与完整藻体的
生理代谢机制可能存在一定的差异 ,由此表现为细胞
在pH 值为7. 5的环境中增殖略好于其他pH值环境.
而发菜细胞培养的适宜温度 、适宜光照强度及适宜光
周期与自然生长状态基本一致 ,这与其他研究者的结
论基本一致[ 3, 5 - 6, 10] .
3. 3　激素与发菜细胞增殖的关系
实验中发现 2. 0 mg /L NAA , 1. 0 mg /L 6-BA和
2. 0mg /L 2 ,4-D对发菜细胞增殖的促进作用好于其他
浓度的促进作用 ,而过高或过低的激素浓度都不利于
细胞的增殖 ,尤其是高浓度条件下细胞增殖显著减缓 ,
这与笔者研究人工培养发菜藻体时的情况基本一
致[ 11] .然而 ,激素对细胞及个体的生理影响是复杂而多
方面的 ,是不同种类的激素在不同浓度和水平相互配
合的情况下 ,在特定的生长发育阶段综合作用的结果.
此外 ,激素处理细胞能诱导产生新的 mRNA 和蛋白
质 ,说明激素的许多作用是通过调节基因表达的方式
实现的[ 12] .因此 ,不同激素组合和不同浓度梯度配比对
发菜细胞增殖的影响及相关基因的调控和蛋白质(酶)
含量 、种类的变化还有待于进一步的研究.
参考文献:
[ 1] 　沈瑞清 , 张萍. 我国发菜研究的进展[ J] . 北方园艺 ,
2003(1):27.
[ 2] 　钱凯先 ,朱浩然 ,陈树谷.发菜的生态条件及其规律分析
[ J] .植物生态学与地植物学报 , 1989 , 13(2):97-105.
[ 3] 　施定基,周国飞 ,方昭希,等.发菜的光合作用 、呼吸作用和
形态学的研究[ J] .植物学报, 1992 , 34(7):507-514.
[ 4] 　刘明志 , 潘瑞炽.培养条件下发菜超微结构的观察[ J] .
植物学报 , 1997 , 39(6):505-510.
[ 5] 　朱乘婧 , 曾义斌 , 张文君 , 等. 发菜人工培养途径初探
[ J] . 同济大学学报:医学版 , 2002 , 23(3):221-223.
[ 6] 　金洪 ,杜凤玲 , 谢君仁 ,等. 发菜的人工繁殖的研究[ J] .
内蒙古农业大学学报 , 1999 , 20(4):43-48.
[ 7] 　QIU BAOSHENG , GAO KUNSHAN. Dired field popula-
tions of Nostoc falgelli forme(Cyanophyceae) require exog-
enous nutrients for their pho tosynthetic recovery[ J] . Journal
of Applied Phycology , 1999(11):535-541.
[ 8] 　叶清泉 ,王立美 , 刘富瑞 ,等. 固氮蓝藻的大量培养方法
[ J] . 水生生物学集刊 , 1959(4):445-451.
[ 9] 　STANIER R Y , KUNISAWA M M , COHEN B G.
Purification and prope rties o f unicellar blue-gr een alg ae
(order Chroococcales)[ J] . Bacteriol Rev , 1971(35):
171-201.
[ 10] 　毕永红 , 胡征宇.温度 、营养和光强对发状念珠藻生长
的影响[ J] .过程工程学报 , 2004 , 4(3):245-249.
[ 11] 　梁文裕 , 孙兰芳 , 赵辉 , 等. 发菜液体培养的初步研究
[ J] .宁夏农林科技 , 2005(5):6-8.
[ 12] 　李宗霆 ,周燮. 植物激素免疫检测技术[ M ] . 南京:江
苏科学技术出版社 , 1996.
Influence of Tapes of Medium , Environmental Factors and Hormone on the
Multiplication of Nostoc f lagellif orme Cell
Liang Wenyu , 　Zhao Hui , 　X ie Yajun , 　Wang J un
(School of Life Science , Ningx ia Unive rsity , Yinchuan 750021 , China)
Abstract:In order to discuss the optimal conditions of Nostoc f lagel li forme multiplication , the effect of types of
medium , pH , temperature , light period , light intensity and hormone on grow th and multiplication of Nostoc
f lagel li forme cells were investigated. The results show ed that grow th and multiplication rates of cells were bet ter
in BG11 than that in other mediums. The multiplication rates at 25 ℃, pH =7. 5 , 2 000 lx , 12 hour light 12 hour
dark were the most rapid than that in other conditions in medium BG11 , besides , it could promote multiplication of
cells obviously when separately added 2. 0 mg /L NAA , 1. 0 mg /L 6-BA and 2. 0 mg /L 2 , 4-D under the same
conditions in medium BG11.
Key words:Nostoc f lagelli forme;cell culture;BG11;pH;temperature;light period;light intensity;hormone
(责任编辑 、校对　李　琼)
267　第 3期　　　　　　　　　梁文裕等:培养基类型 、环境因子和激素对发菜细胞增殖的影响