全 文 ：农业部 948计划资助项目（991029）资助
蔡汉权 男，1967年生，讲师。 研究方向：植物组织培养
*通讯作者，男，1966年生，博士，研究员，博士生导师。E-mail：Laizx01@163.com
收稿日期：2005-07-26 修回日期：2005-08-30
热 带 作 物 学 报
CHINESEJOURNALOFTROPICAL CROPS
Vol.27No.1
Mar.2006
第 27卷 第 1期
2006年 3月
罗勒（Ocimumbasilicum）悬浮细胞系的建立与保持
蔡汉权 1,2,3 赖钟雄 2,3* 林珊珊 2,3 林庆良 2,3
1广 东 韩 山 师 范 学 院 广东 潮州 521041
2 福建农林大学园艺植物生物研究所
3 福 建 农 林 大 学 园 艺 学 院
福州 350002
摘 要 通过罗勒茎尖培养获得疏松型（CA）、泥状型（CB）和绿色块状型（CC）愈伤组织；以这 3种愈伤组织
为起始材料，研究了建立罗勒悬浮细胞系的方法、影响因素及继代保持的方法。结果表明：疏松型、泥状型愈
伤组织均能建立悬浮细胞系；以泥状型愈伤组织为起始材料，建立悬浮细胞系时间仅需 7~8d。
关键词 罗勒 愈伤组织 悬浮细胞培养
中图分类号 Q943.1 S573.9 S567.219
罗勒（Ocimumbasilicum）属于唇形科罗勒属，一年生草本植物，全草具芳香，花苞含精油，从叶中提
取的精油为黄绿色，成分为甲基黑椒酚、芳樟醇、桉叶油素等，是具有较高开发前景的香料植物[1]。国内
悬浮细胞培养在许多植物已获得成功，如：赖钟雄等 [2]、向太和等[3]、葛台明等[4]、夏光敏等 [5]在龙眼、水
稻、小麦、石防风等植物的悬浮细胞培养中阐述了影响因素和培养物生理状况的变化；贾士荣[6]、赖钟雄[7]、俞
长河 [8]在黄瓜、龙眼、荔枝的胚性悬浮细胞的原生质体培养中获得再生植株。国外也有许多有关悬浮细
胞培养研究的报道，如：AlpiA[9]，BhansaliRR[10]，BoulayMP[11]，Dhed′AD[12]分别在 Phaseoluscoccineus，
Prunuspersica，PicenabiesKarst和Musaspp.ABBgroup的悬浮细胞培养中获得再生体胚。利用细胞培养
进行细胞杂交、遗传转化和高产细胞株的选育，进而用于细胞工程育种和次级代谢产物的工业化生产，
是现代生物工程技术迅速发展的一个领域，目前至少已在200种植物上生产 500种以上的有用成分[13]。
罗勒的组织培养方法仅见蔡汉权[1]的报道，其悬浮细胞培养尚未见报道。笔者通过研究建立罗勒悬浮细
胞系的方法，为进一步应用于原生质体分离、细胞培养、遗传转化和次级代谢产物生产等研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
罗勒（Ocimumbasilicum）的顶芽或侧芽。
1.2 方 法
1.2.1 愈伤组织的诱导 参照文献[1]的取材和消毒方法，用培养基MS1：MS+6-BA4mg/L+NAA0.1mg/L
作为启动培养基，诱导罗勒顶芽、侧芽分化获得大量愈伤组织，继代培养2周后，调整激素配比，诱导和
筛选各种类型愈伤组织，诱导培养基共8组：DK1，MS+2,4-D0.5mg/L+KT0.5mg/L；DK2，MS+2,4-D
1mg/L+KT0.5mg/L；DK3，MS+2,4-D2mg/L+KT0.5mg/L；DK4，MS+2,4-D3mg/L+KT0.5mg/L；
Y1，MS+NAA0.2mg/L+KT0.5mg/L；Y2，MS+NAA0.2mg/L+KT1mg/L；Y3，MS+NAA0.2mg/L+
KT2mg/L；Y4，MS+NAA0.2mg/L+KT3mg/L；以上培养基均附加蔗糖 30g/L、琼脂 6g/L，pH
5.8，121℃高压灭菌20min，培养条件为（25+2）℃，光照强度1500lx，光周期12h/d。
1.2.2 罗勒悬浮细胞系的建立 根据愈伤组织在固体培养基上的生长、分化表现，DK3培养基能诱导
泥状愈伤组织，笔者将 DK3去除琼脂，其液体培养基 DK5作为悬浮细胞培养的培养基。DK5培养基为：
MS+2，4-D2mg/L+KT0.5mg/L的液体培养基，其蔗糖浓度为30g/L，pH5.8，配制后分装于 50mL三
1期 蔡汉权等：罗勒（Ocimumbasilicum）悬浮细胞系的建立与保持
角锥瓶中，每瓶装培养基20mL，121℃灭菌20min备用。将CA型、CB型继代培养6~8d，CC型继代培
养 13~14d，生长旺盛的各类型愈伤组织分别接种于 DK5培养基中，接种量为每瓶 0.5~0.7g，每种材料
接种10瓶，于超净工作台无菌接种后置于PYC普通摇床上进行液体振荡培养，振荡速度为120~130r/min，培
养条件为温度（25+2）℃，弱光 150lx，光周期 12h/d。接种 24h后，每隔 24h取少量培养物在倒置显微
镜下镜检，在观察到培养物由大量小细胞团和单细胞组成时，用115目尼龙网滤去较大组织块，滤液接
入新鲜DK5培养基继代培养，直至形成快速、大量生长的悬浮细胞系。
1.2.3 罗勒悬浮细胞的生长 以CB型泥状愈伤组织为材料，建立悬浮细胞系，研究接种密度对悬浮细
胞生长的影响；为促进悬浮培养细胞的分化，笔者设计了 DK6：MS+2，4-D0.5mg/L+KT1mg/L，附加
100mg/L肌醇的液体培养基，比较 2，4-D，KT浓度变化和肌醇对细胞分化的影响；在成批培养下，以培
养时间为横坐标，悬浮培养物的鲜重为纵坐标，绘制悬浮细胞生长曲线。细胞增长率计算方法为，增长率
=[（终鲜重-接种鲜重）/接种鲜重]×100%，接种密度以每瓶（20mL培养基）的接种量来表示。
1.2.4 罗勒悬浮细胞系的保持 参照文献[14]悬浮细胞系的固体—液体轮回培养法：即在DK5液体培
养基上建立悬浮培养系，7~8代后转入DK3的固体培养基上培养继代，每10~12d继代1次，需要悬浮培养
之时，将愈伤组织转入DK5，可重新建立悬浮细胞系，依此轮回。
2 结果与分析
2.1 不同诱导培养基上愈伤组织类型的分化
罗勒顶芽或侧芽在 DK1~DK4；Y1~Y48种培养基的诱导下，愈伤组织出现绿色、淡绿色、黄白色、白
色；块状、泥状、粒状等不同类型的分化，见表 1。结果表明：激素类型和浓度对愈伤组织的生长、分化有
明显的影响，低浓度下（DK1，Y1）愈伤组织生长慢，继代周期长；高浓度下（DK4，Y4）愈伤组织易出现老化
状态。诱导结果有CA型、CB型和CC型3种具有代表性的愈伤组织。
CA型为疏松型愈伤组织，黄色颗粒状、松散易于夹碎。CC型为绿色块状型愈伤组织，表面有颗粒
状突起，有诱导芽的能力。CB型为泥状型愈伤组织，生长迅速，细胞活力强，形态极为松散，可以在固体
培养基上平铺摊开，继代培养时将愈伤组织摊开，用镊子夹去小块的愈伤组织，这样经 3~4次继代，愈
伤组织为均一的细沙状，称为泥状愈伤组织，将此愈伤组织在滴有 CPW-13M溶液[15]的玻片上作涂片，
可见分散的单细胞及小细胞团（见图1）。因此，选用为建立悬浮细胞系的起始材料。CA型和CC型作为
对比材料。
2.2 罗勒悬浮细胞系的建立
2.2.1 愈伤组织类型对悬浮细胞系建立的影响 分别以生长旺盛、继代培养 6~8d的 CA型、CB型愈
伤组织以及继代培养13~14d的 CC型愈伤组织为起始材料，在20mL的 DK5培养液上接入各 0.5g的
愈伤组织，比较愈伤组织类型对悬浮细胞系建立的影响。结果表明：在接入 CB型愈伤组织4d后，悬浮
表1 不同培养基下诱导的罗勒愈伤组织类型
培养基
代 号
生长调节剂/mg·L-1 愈伤组织形态
继代周期/d
2，4-D NAA 颜 色 质地 表面特征
DK1 0.5 黄绿色 块状 平 滑 15~20
DK2 1 黄色、黄白色 疏松 粒 状 8~10
DK3 2 淡绿色、褐色 泥状 微粒状 8~10
DK4 3 黄色、褐色 块状 片 状 10~12
Y1 0.2 浅绿色 块状 平 滑 25~30
Y2 0.2 绿 色 块状 细粒状 15~20
Y3 0.2 绿 色 块状 粗粒状 15~20
Y4 0.2 绿 色 块状 片 状 15~20
KT
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
1
2
3
类型代号
CA型
CB型
CC型
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热 带 作 物 学 报 27卷
液中可见有大量的单细胞和小细胞团出现（见图 2-A），此时用 115目的滤网将大块愈伤组织过滤，滤
液继续振荡培养了 3~4d即可获得分散的悬浮细胞系。镜检结果表明，这一细胞系生长迅速，细胞分裂
快，分散性好（见图2-B），从接种培养到建立这种悬浮培养物，只要 8d左右。在接入CA型愈伤组织振
荡培养4d后，悬浮液仍为小细胞团和较大细胞团组成（见图 3），继续振荡培养 3~4d后，可见单细胞和
小细胞团的数量增加，此时用115目的滤网将大细胞团和大块愈伤组织过滤，加入新鲜培养液继续振荡培
养5~6d，即可获得分散的悬浮细胞系，从接种培养到建立悬浮细胞系，约需 13~15d。CC型愈伤组织为
块状，接种前将其表面颗粒状愈伤组织切下，作为接种材料，振荡培养 10d后，有少量细胞团产生，但培
养物仍为较大的愈伤组织块，振荡培养20d后，单细胞和小细胞团数量仍较少，悬浮培养失败。结果表
明：愈伤组织类型对建立悬浮细胞系有明显影响，CA型疏松愈伤组织和CB型泥状愈伤组织均可建立
悬浮细胞系。CB型是建立悬浮细胞系的良好起始材料，从接种到建立悬浮细胞系，仅需8d左右。而CC
型块状愈伤组织，不适合作为悬浮培养的起始材料。
2.2.2 愈伤组织生理状态对悬浮细胞系建立的影响 CB型愈伤组织生长快，不同培养时间内生理状
态有明显差别，不适时继代（14d以上）容易出现褐变，长气生根等衰老现象。以不同培养时间内的CB
型愈伤组织为材料，比较不同生理状态的愈伤组织对悬浮细胞系建立的影响（建立方法同 1.2.2）。结果
发现，培养 3~4d的愈伤组织细胞活力较低，建立悬浮细胞系所需的时间较长；培养 7~8d的愈伤组织
活力很强，建立悬浮细胞系所需的时间短，效果很好；而培养 13~14d的愈伤组织建立悬浮细胞系的效
果较差，且有部分死亡细胞的出现。由此可见：愈伤组织的生理状态、继代时间对建立悬浮细胞系也有
明显影响。
2.3 接种密度对悬浮细胞系生长的影响
以 CB型愈伤组织建立的悬浮细胞系为材料，比较了不同接种密度（每 20mL的接种量）对罗勒悬
浮细胞系生长的影响（继代培养基为DK5，培养方法同1.2.2）。结果表明：接种密度对建立悬浮细胞系的
周期和细胞生长有明显影响；低密度（0.1g/瓶）接种的情况下细胞无法生长，无增殖；能正常继代增殖的
细胞密度应达到 0.3g/瓶以上；0.5～0.7g/瓶的接种密度是罗勒悬浮细胞生长的适宜接种量。
2.4 罗勒悬浮细胞系的生长曲线
以罗勒CB型泥状愈伤组织在DK5培养基上建
立的悬浮细胞系为材料，测定接种密度为 0.5g/瓶
的悬浮细胞系在成批培养下的生长动态。结果（见
图 4）表明，在成批培养周期中，悬浮细胞系的细胞鲜
重呈动态变化，生长曲线大致为S型。按王蒂[16]的划
分方法，罗勒悬浮细胞系的生长曲线延滞期为接种
后1~2d；对数生长期为3d；直线生长期为 4~5d；缓
慢期为6~7d；静止期为8d。生长曲线的制作，有助
于确定继代周期的时间，罗勒悬浮培养细胞系的最
佳继代周期应在接种后4~5d。
时间 /d
图4 成批培养下罗勒悬浮细胞系的生长曲线
图1 CB型愈伤组织涂片：
分散的小细胞团
A分散性良好; B分裂快，分散性好。
图2 悬浮培养细胞
图3 CA型愈伤组织振荡
培养 4d后，悬浮液
组成
细
胞
鲜
重
/g
A B
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1期 蔡汉权等：罗勒（Ocimumbasilicum）悬浮细胞系的建立与保持
2.5 罗勒悬浮细胞系的固体—液体轮回保持
罗勒CB型、CA型愈伤组织在同一固体培养基上至今已保持 6个月之久，仍然表现良好的生长状
态，证明其愈伤组织在同一固体培养基上继代有较好的连续性。罗勒悬浮细胞系在DK5培养基上已继
代培养 10代，细胞生长仍然处于正常状态，推断其悬浮细胞系可能也可以长期继代。但长期悬浮培养
继代周期短，操作烦琐，易污染，费时费力，采用固体—液体轮回保持方法，解决了上述问题。结果表明：
罗勒悬浮培养的细胞在转入 DK3固体培养基上 15~20d后即可形成愈伤组织并保持良好的疏松状态，
生长迅速。用这种愈伤组织重新建立悬浮细胞系，只需 7~8d。CB型、CA型愈伤组织均能建立悬浮细胞
系，其再生植株研究正在研究之中。
3 讨 论
3.1 建立罗勒悬浮细胞系的关键因素
本实验在7~8d内建立于罗勒的悬浮细胞系，其技术关键在于 CB型泥状愈伤组织的成功诱导。CB
型泥状愈伤组织生长快、松散度极好，在愈伤组织涂片中已可见分散的单细胞及大量由十几个细胞组
成的小细胞团，因此，CB型泥状愈伤组织是建立悬浮细胞系的极佳材料。适合的培养基也是建立悬浮
细胞系的必要条件，诱导CB型泥状愈伤组织的 DK3培养基成分和建立悬浮细胞系的 DK5培养基成分
基本相同，只存在是否添加琼脂的差异，证明了 DK3培养基适合罗勒松散细胞的生长和分裂。
3.2 罗勒悬浮细胞系的长期保持方法
采用固体—液体轮回保持方法可以对悬浮细胞系进行长期保持，荔枝[17]、龙眼[7]等植物的悬浮细胞
系的长期保持已见报道，在本实验中罗勒悬浮细胞系采用此方法也有较好的效果。但在本实验中 CB型
愈伤组织在固体培养基上长期继代具连续性，用其建立悬浮细胞系迅速、方便。因此，可以将其在固体
培养基上长期继代培养，作为罗勒悬浮细胞系保持的一种方式。
3.3 罗勒悬浮细胞系的应用价值
罗勒是一种具很高开发前景的香料植物，全草芳香，国外已用于香水的制造[18]。其食用、药用价值
的开发研究前景非常广阔[19]。国内学者通过气相色谱质谱联用技术[20]已鉴定其挥发油的化学成分，以及
其挥发油的萃取工艺[21]，这表明罗勒有用成分的工业化生产已进入实质性阶段。罗勒悬浮细胞系的建
立，为进一步进行原生质体分离、高产细胞株选育、细胞大量培养和次级代谢产物的工业化生产奠定了
基础，具有潜在的生产、开发和应用价值。
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EstablishmentandMaintenanceofCelSuspensionsofOcimumbasilieum
CaiHanquan1,2,3 LaiZhongxiong2,3 LinShanshan2 LinQingliang2
1DepartmentofBiology,HanshanTeachersColege Chaozhou 521041
2InstituteofHorticulturalBiotechnology,FujianAgricultureandForestryUniversity Fuzhou 350002 China
3DepartmentofHorticulture,FujianAgricultureandForestryUniversity Fuzhou 350002 China
Abstract TheshoottipofOcimumbasilieumwasinducedandculturedtoobtainthreetypesofcali,CA,CBand
CC.Thefactorsafectingestablishmentofsuspensionsextractedfromthesecali,andthemethodsofsuspension
maintenancewerestudied.TheresultsshowedthatboththeCAandCBcalicouldbeusedasinitialmaterialsfor
establishingsuspensions,andthatittookonly7~8daystoestablishcelsuspensionsfromtheCBcalus.
Keywords Ocimumbasilieum calus celsuspensionculture
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