全 文 :第 42 卷 第 2 期
2014 年 5 月
贵 州 林 业 科 技
Guizhou Forestry Science and Technology
Vol. 42,No. 2
May,2014
硬叶兜兰菌根真菌的形态学特征与鉴定
田 凡1 白新祥2 王莲辉1 姜运力1 罗在柒1
(1. 贵州省林业科学研究院,贵州 贵阳 550005;2. 贵州大学林学院,贵州 贵阳 550025)
摘 要:将采集获得的野生硬叶兜兰植株,采用新单菌丝团分离法,分离纯化后,获得 6 株菌根真菌。对 6
株内生菌的菌落形态、产孢结构和分生孢子形状、大小作了测量与观察及一些生物学特性初步鉴定,结果为 5
株菌根真菌分别属于瘤菌根菌属 (Epulorhiza)、胶膜菌属 (Tulasnella)和镰刀菌属 (Fusariu),未鉴定 1 种。
关键词:硬叶兜兰;菌根真菌;鉴定;形态学
中图分类号:Q948. 12 + 2. 3 文献标识码:B
Morphological Features and Identification of the Mycorrhizal Fungi of
Paphiopedilum micranthum
TIAN Fan1 BAI Xin - xiang2 WANG Lian - hui1 JIANG Yun - li1*
(1Guizhou Academy of Forestry,Guiyang,Guizhou 550005,2Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025)
Abstract:by using the method of single peloton isolation and purification,six mycorrhizal endophyte strains
were obtained from a wild plant of Paphiopedilum micranthum. These endophytes were then morphologically studied
for the colony,the conidiogenous structures and the spores,based on which 5 strains were preliminarily identified to
genera of Epulorhiza,Tulasnella and Fusariu,while the remainder was still unidentified
Key words:Paphiopedilum micranthum Tang et Wang,mycorrhizal fungi,morphology,identification
硬叶兜兰花奇色美,具有非常高的生物学研究
和观赏价值,引起了全世界兜兰专家及兰花爱好者
的极大兴趣[1]。由于过度采集、走私出境猖獗以及
生境破坏等原因,近十几年来野生硬叶兜兰的数量
急剧减少,已经到了灭绝的边缘。属 “野生动植物
濒危物种国际贸易公约” (CITES)附录Ⅰ的保护
对象。因此,硬叶兜兰野生资源的保护和人工繁育
问题亟待引起社会各界的重视。
硬叶兜兰快速生长成为兰科植物生产者急切关
注的问题,已有的研究结果表明,共生真菌有助于
提高幼苗移栽后的成活率和生长速度,增加植株对
逆境的抵抗能力,维持较低的发病率[3 ~ 8]。将兰科
菌根技术应用于硬叶兜兰种子萌发和植株生长将成
为保护其种质资源和使其产业化的必然趋势。
国内外对于硬叶兜兰菌根真菌分类鉴定的研究
报道较少,仅见 1 名学者对硬叶兜兰菌根真菌进行
了分离、鉴定[9]。目前兰科菌根真菌的分离和形态
鉴定还主要依靠组织分离法和传统形态学的方法。
本研究采用新的单菌丝团分离法对硬叶兜兰菌根进
行分离[10],形态鉴定采用经典形态学方法,即根
收稿日期:2013 - 11 - 22
作者简介:田凡 (1985 -)女,硕士,主要从事兰科植物菌根真菌研究。
* 通讯作者:罗在柒 (1978 ~)男,副研究员,主要从事林木生物技术研究 (E - mail:luozaiqi@ 163. com)
贵 州 林 业 科 技 42 卷
据培养性状 (菌落特征),显微形态特征及一些生
物学特性进行分类研究,对硬叶兜兰菌根真菌进行
初步分类鉴定,为硬叶兜兰的资源保存奠定基础,
同时也为其快速繁殖提供技术支持。
1 试验材料和方法
1. 1 试验材料
1. 1. 1 供试植物
野生硬叶兜兰 (Paphiopedilum micranthum Tang
et Wang)成年植株采于贵州省惠水县。
1. 1. 2 培养菌株培养基
标准培养基:美国 BD (Difco)公司生产的标
准 PDA (Potato dextrose agar)培养基和 CMA
(Corn meal ager)培养基。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 分离方法
截取的硬叶兜兰新鲜根段于流水状态下冲洗干
净,分装于盛有无菌水的培养皿中,在超净工作台
上用解剖刀轻轻刮掉根毛、根被、表皮和其他附属
物,显微镜检,选出具有菌丝团的根段,无菌水冲
洗干净,再用 0. 1%升汞溶液分别处理 2min,无菌
水冲洗 4 ~ 5 次,将具有菌丝团的根切成 3cm 的小
段,然后用解剖针和镊子刮根段,使单菌丝团从皮
层细胞中游离出来,扩散到装有 10ml 无菌水的直
径为 60cm 培养皿中,24℃恒温箱培养,培养 12h
后在显微镜暗视野中找到生长出菌丝的菌丝团或菌
丝结,然后将光线调到最强,肉眼找到视界范围内
的菌丝团,用 1000μl 的移液枪吸取菌丝团,每次
吸取 45μl菌丝团液,然后转接到面积为 1cm2 小块
双抗 PDA培养基上,置于 24℃恒温箱培养。培养
48 小时后显微镜下镜检小块培养基,找到长出菌丝
的菌丝团,将菌丝团从小块培养基上切下,然后转
接至小块 PDA 培养基,24℃恒温培养,当菌丝生
长至 0. 5cm 长时,切取菌丝尖端转接到直径为
90cm的 PDA培养皿,纯化后转接到试管,培养保
存。
1. 2. 2 菌落培养特征
将分离获得的菌株分别接到 BDPDA 培养基和
BDPDA培养基平板上,24℃恒温培养,每天观察、
记录各菌株的菌落特征,包括菌落形状、大小、色
泽、生长速度及是否产生色素和香味等情况。挑取
菌落边缘及中央菌丝在光学显微镜下观察菌丝特征
(是否有隔和分枝,形状和颜色等),测量菌丝直
径。
1. 2. 3 菌株显微形态观察
插片培养法:将菌丝块接种于 BDPDA 标准培
养基和 BDCMA 标准培养基平板的中间,用小镊子
夹起一块无菌的盖玻片,在距接种点一定距离处以
45 度角的角度斜插入培养基中,不要插入培养基太
深,让菌丝爬上盖玻片约 2 /5 时,再用小镊子将盖
玻片取出,自然干燥以后,将盖玻片转移到干净的
滴加有染色液或蒸馏水的载玻片上,显微镜下观察
产孢结构特征。
显微照片摄影:在 OLYMPUS 倒置荧光数码显
微镜下,观察并选取具典型特征的视野拍照、直接
测量相关数据并进行描述记载。
菌丝细胞核染色计数:取 BDPDA 培养基上生
长旺盛的菌丝,以番红 T - KOH 和考马斯亮蓝染色
液染色,显微镜下进行细胞核计数。
1. 2. 4 菌种鉴定
菌种鉴定依据菌株菌落的培养特征及菌株显微
形态观察的结果,结合大量可靠的文献资料,综合
分析对比相关特征的异同,最后确定鉴定菌株的分
类地位。
2 结果与分析
2. 1 菌落培养特征及显微形态观察
采用单菌丝团分离法分离获得 19 株菌株,通
过 BDPDA培养基的菌落培养特征相似度的观察,
将 19 株内生菌筛选为 6 株菌株 (菌落培养特征均
不一致的菌株)。6 株菌株在 BDPDA 培养基上具有
以下培养特征:
(1)YYDL008
基本特征:菌丝细胞为双核。BDPDA 培养基
上菌落早期贴培养基生长,菌落表面光滑,边缘整
齐,厚薄均匀,后期产生气生细绒状菌丝,不明
显,菌落乳白色,形成同心环,具有香味 (图 1)。
菌丝的生长速度 0. 12 ~ 0. 14mm /h,菌丝直角或近
直角分枝,分枝第一隔与分枝点的距离为 2. 87 ~
3. 49μm,直角或近直角分枝,距分枝起源很近处
有横隔,念珠状细胞球形,少数柱状或椭圆形,大
小 12. 64 ~ 14. 25μm × 13. 27 ~ 21. 40μm,念珠状细
胞链一般 5 个细胞 (图 1);BDCMA 培养基上贴培
养基生长,无气生菌丝,生长速度 0. 19 ~ 0. 29mm /
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2 期 田 凡等:硬叶兜兰菌根真菌的形态学特征与鉴定
h,菌丝分枝,有隔,分枝第一隔与分枝点的距离 为 1. 98 ~ 6. 48μm。
图 1 YYDL008 菌落形态 图 2 YYDL008 菌丝显微结构:念珠状细胞
(2)YYDL012
基本特征:PDA 培养基上菌落淡紫色,蜡质,
稍厚,贴培养基生长,无气生菌丝,边缘不整齐,
中央部分呈锯齿状突起,淡黄色 (图 3),菌丝生
长速度 0. 03 ~ 0. 04mm /h,菌丝分枝,有隔,分枝
第一隔与分枝点的距离为 2. 27 ~ 4. 39μm (图 4);
BDCMA培养基上贴培养基生长,无气生菌丝,生
长速度 0. 03mm /h,菌丝分枝,有隔,分枝第一隔
与分枝点的距离为 1. 53 ~ 7. 39μm。
图 3 YYDL012 菌落形态 图 4 YYDL012 菌丝的显微结构
(3)YYDL013
基本特征:菌丝细胞为双核。BDPDA 培养基
上菌落乳白色,菌丝细绒毛,气生菌丝不明显,边
缘不整齐,整个菌落形如雪花状,生长速度慢,具
有香味 (图 5),菌丝的生长速 0. 04 ~ 0. 05mm /h,
直角或近直角分枝,距分枝起源很近处有横隔念珠
状细胞椭圆形及短圆柱状,大小 11. 08 ~ 13. 08μm
×33. 47 ~ 63. 61μm,有隔,分枝第一隔与分枝点的
距离为 5. 09 ~ 20. 51μm (图 6);BDCMA 培养基上
贴培养基生长,无气生菌丝,生长速度 0. 11 ~
0. 18mm /h,菌丝分枝,有隔,分枝第一隔与分枝
点的距离为 1. 36 ~ 5. 12μm。
(4)YYDL019
基本特征:菌丝细胞为双核。BDPDA 培养基
上菌落淡褐色,菌丝稀薄,中央菌落逐渐形成雪白
色绒毛状菌丝,边缘不整齐,针齿状,具有香味
(图 7),菌丝的生长速度 0. 07 ~ 0. 08mm /h,菌丝
分枝,有隔,分枝第一隔与分枝点的距离为 3. 59 ~
. 19μm (图 8);BDCMA 培养基上贴培养基生长,
无气生菌丝,生长速度 0. 16 ~ 0. 21mm /h,菌丝分
31
贵 州 林 业 科 技 42 卷
枝,有隔,分枝第一隔与分枝点的距离为 4. 33 ~ 6. 36μm。
图 5 YYDL013 菌落形态 图 6 YYDL013 菌丝显微结构:念珠状细胞
图 7 YYDL019 菌落形态 图 8 YYDL019 菌丝显微结构
(5)YYDL020
基本特征:菌丝细胞为双核。BDPDA 培养基
上菌落早期贴培养基生长,边缘不规则具树枝状,
厚薄均匀,细绒状菌丝,浅褐色,后期菌落中间气
生菌丝雪白色,具有香味 (图 9),菌丝的生长速
度 0. 07 ~ 0. 14mm /h,直角或近直角分枝,距分枝
起源很近处有横隔念珠状细胞椭圆形及短圆柱状,
大小 7. 19 ~ 13. 03μm × 20. 88 ~ 36. 78μm,念珠状
细胞链长一般为 4 个细胞,有隔,分枝第一隔与分
枝点的距离为 2. 04 ~ 4. 19μm (图 10);BDCMA 培
养基上贴培养基生长,无气生菌丝,生长速度 0. 23
~ 0. 25mm /h,分枝第一隔与分枝点的距离为 2. 64
~ 4. 07μm。
图 9 DJYYDL020 菌落形态图 图 10 DJYYDL020 菌丝显微结构:念珠状细胞
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2 期 田 凡等:硬叶兜兰菌根真菌的形态学特征与鉴定
(6)YYDL041
基本特征:BDPDA 培养基上菌落乳黄色,绒
毛状,厚薄均匀,边缘整齐 (图 11),菌丝的生长
速度 0. 16 ~ 0. 18mm /h,分生孢子长椭圆状或镰刀
状,两端尖,多有 3 个隔 (图 12);BDCMA 培养
基上贴培养基生长,无气生菌丝,生长速度 0. 24 ~
0. 25mm /h,分生孢子镰刀状。
图 11 YYDL041 菌落形态 图 12 YYDL041 菌丝显微结构:分生孢子
2. 2 菌落及显微结构特征对比
根据上述的研究结果,6 株菌株的菌落及显微
结构特征对比如表 1 所示。
表 1 菌株的菌落及显微结构特征
菌株 菌落形态
菌落
颜色
香味 菌丝结构
分生
孢子
菌丝分枝点
附近形成隔
菌丝细
胞核
DL013 菌丝细绒状,边缘不整齐 乳白色 有
念珠状细胞椭圆形及短
圆柱状
无 有 双核
DL019 绒毛状菌丝,边缘不整齐 雪白色 有 无念珠状细胞 无 有 双核
DL008
平滑较稀薄,具同心环,
边缘整齐
浅褐色 有 念珠状细胞长椭圆形 无 有 双核
DL012 蜡质,边缘不规则 淡黄色 有 短圆柱状 无 有 未鉴定
DL041
细绒状菌丝,不规则锯齿
状
乳白色 无 长椭圆状或镰刀状 有 无 未鉴定
DL020
细绒状菌丝,边缘不规则
具树枝状
浅褐色 有
念珠状细胞椭圆形及短
圆柱状
无 有 双核
2. 3 菌株生长速率对比
将 6 个菌株按照生长速率进行分组,结果见表
2。
表 2 不同生长速率的菌株分组
速度组 菌株 生长速率 /mm
慢速组 YYDL012 YYDL013 0. 03 ~ 0. 05
匀速组 YYDL019 YYDL020 0. 05 ~ 0. 11
较快速组 YYDL008 YYDL041 0. 11 ~ 0. 18
从表 2 可以看出,不同的菌种在相同的培养基
及培养条件下,具有不同的生长速度,菌株
YYDL012 和 YYDL013 生长极其缓慢,表明不同的
菌株间具有不同的生物学特性。并且各菌株在不同
的时间段里,生长速度也不稳定,并不会随着时间
的增长而匀速增长,可能与菌种本身的生长机制和
培养条件的差异性有关。
2. 4 鉴定结果
Ogoshi (1975)明确了丝核菌的概念,丝核菌
51
贵 州 林 业 科 技 42 卷
类真菌主要包括以下几个特征:细嫩菌丝隔的远侧
端附件形成一个分枝;分枝处缢缩,并在分枝点附
近形成一个隔;具有桶孔隔膜;不形成分生孢子、
根状菌索和不具有锁状联合;具念珠状细胞[11]。
由表 1 的数据可知,5 株菌株没有分生孢子、仅有
DL041 株有,DL013、DL019、DL008 和 DL020 菌
株菌丝分枝点附近形成一个隔和菌丝细胞双核,都
具念珠状细胞,大多数具有香味,根据以上特征与
朱国胜[8]等学者的分类鉴定结果对比,初步鉴定 6
株菌株为胶膜菌科 (Tulasnellaceae)的瘤菌根菌属
和胶膜菌属。鉴定结果见表 3。
表 3 菌株初步鉴定结果
菌株 属
YYDL013 瘤菌根菌属 (Epulorhiza)
YYDL019 瘤菌根菌属 (Epulorhiza)
YYDL008 瘤菌根菌属 (Epulorhiza)
YYDL041 镰刀菌属 (Fusarium)
YYDL020 胶膜菌属 (Tulasnella)
YYDL012 未鉴定
3 讨论
本次试验从硬叶兜兰菌根中分离获得与其共生
的菌根真菌 6 株,根据其菌落培养特征,光学显微
镜等传统形态学的特征观察,初步将其中 5 菌株鉴
定为瘤菌根菌属 (Epulorhiza)、胶膜菌属 (Tulas-
nella)和镰刀菌属 (Fusarium),未鉴定 1 种。本
次试验分离到镰刀菌,众所周知,镰刀菌是一种植
物病原菌,能够危害多种经济植物。李明从杏黄兜
兰菌根中分离到的真菌类群中镰刀菌为优势菌
群[12]。范黎等自香果兰 (Vanilla annamica)等 5
种附生兰花根中分离到了 2 种镰刀菌,镰刀菌菌株
经过实验证明可促进长苏石斛 (D. brymerianum)
的种子发芽,可以说明该种可能是兰科植物菌根真
菌[13]。上述可以看出,镰刀菌能够在多种兰科植
物中被分离到,说明镰刀菌在兰科植物生长的环境
中普遍存在,与兰科植物生长关系密切。
Moore对原来隶属于丝核菌属 (Rhizoctoni)的
兰科菌根真菌重新研究后,建立了 3 个新属,即角
菌根菌属 (Ceratorhiza)、瘤菌根菌属 (Epulorhiza)
和念珠菌根菌属 (Moniliopsis),对应的有性世代分
别是:角担菌属 (Ceratobasidium)、胶膜菌属 (Tu-
lasnella)和蜡壳菌属 (Sebacina)、瓜亡革菌属
(Thanatephorus)[14]。范黎、郭顺星等对产于我国云
南和福建地区的 19 种兰科植物的菌根内生真菌进
行了分离、鉴定,发现了 26 个兰科丝核菌类 (Or-
chidaceous rhizoctorias)菌株,分别属于 3 个属,即
角菌根菌属、瘤菌根菌属和念珠菌根菌属[15]。其
中有 3 个菌株已经证明能与某些兰科植物共生,促
进其种子发芽形成原球茎,可以说明这 3 个菌株可
能是某些兰科植物的菌根真菌。本研究从硬叶兜兰
菌根中也分离到了 Epulorhiza 和 Tulasnella 两个属
的。本研究的结果进一步的提示我们胶膜菌属和其
对应的无性态瘤菌根菌属可能是中国兰科植物较普
遍存在的共生菌根真菌。有关硬叶兜兰菌根的共生
机制有待深入研究。
目前兰科菌根真菌的分类和鉴定还主要依靠形
态学的方法。本研究分离到的真菌只鉴定到属,而
没有鉴定到种,这是因为兰科菌根真菌的鉴定比较
困难,由于某些高等真菌与低等真菌的同源性较
高,随着生物化学、遗传学以及分子生物学等相关
学科的发展,真菌的现代分类学中也不断引入了分
子生物学技术手段,在采用传统方法的同时,辅以
分子生物学手段,并结合计算机分析技术,将菌株
尽可能的鉴定到种。采用分子鉴定技术与传统方法
相结合,才能使鉴定结果更为准确。
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(下转第 5 页)
61
2 期 仲维赫等:生长调节剂对马尾松扦插效果及内源物质的影响
物质发生变化。合理的生长调节剂处理后,扦插初
期,穗条内源抑制物质含量提高。这样穗条在活力
相对较高的离体初期便开始降解抑制生根的苯酚类
和酮类物质。由于穗条在本身活性较高时期便分解
掉较高浓度的生根抑制物质,使生根过程中穗条生
根阻力降低。不当的生长调节剂刺激后,穗条细胞
的活性下降,降低了生根过程中细胞的脱分化再分
化能力。在今后的研究中,可以把吲哚丁酸、吲哚
乙酸作为马尾松主要生长调节剂,辅以微量 6 - BA
进行调节。针对酮类物质和苯酚类物质的变化,可
以在扦插初期施加少量酮类和苯酚类物质,刺激穗
条内源物质的降解机能升高,辅助穗条生根。
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