全 文 ：[ 基金项目] 　广东省自然科学基金科技三项资助项目(No . K1022039)
Co rr espondence to:Zhi-Ping LÜ, MD , P rofessor . E-mail:lzping@fimmu. com
白背叶根抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究
徐　舒 ,吕志平 ,蔡红兵 ,张晓刚 ,刘　强 ,谭　焱
(南方医科大学中医药学院 ,广东 广州 510515)
[摘要] 　目的:观察白背叶根体内抗鸭乙型肝炎病毒(duck hepati tis B virus , D-HBV)的作用 。方法:采用
PCR技术筛选 D-HBV阳性 3日龄广州麻鸭 40只 。将麻鸭随机分为空白对照组 ,白背叶根高 、中 、低剂量组
和拉米夫定组 ,分别给予相应药物进行干预。用药前 、用药第 7 、14 、21天及停药第 7天 ,取各组麻鸭静脉血 ,
采用实时定量荧光 PCR技术检测血清 D-HBV DNA 含量;治疗前后取肝脏组织进行病理组织学观察。结
果:拉米夫定组于用药后 ,血清病毒水平迅速降低 ,但停药后存在反跳现象 。白背叶根高 、中剂量组分别于治
疗第 14 、21天其血清病毒含量明显下降 ,低剂量组治疗期间未见明显的抑制病毒作用 。停药后 ,白背叶根
高 、中剂量组与空白对照组比较仍表现出一定的病毒抑制作用。白背叶根高剂量组对肝脏炎症的改善作用
较拉米夫定组明显。结论:白背叶根有抑制体内 D-HBV 复制的作用 ,其作用大小与剂量及用药时间相关;
其治疗作用较拉米夫定弱 ,但作用维持时间长 ,且用药较为安全 。
[关键词] 　中草药;白背叶根;鸭乙型肝炎病毒;实时定量 PCR;动物实验
[中图分类号] 　R512. 62　　[文献标识码] 　A　　[文章编号] 　1672-1977(2006)03-0285-04
Inhibit ing effects of root of Mallotus apelta on duck hepatit is B virus
Shu XU , Zhi-Ping LÜ, Hong-Bing CAI , Xiao-Gang ZHANG , Qiang LIU , Yan TAN
(School of T raditional Chinese Medicine , Nanfang Medical Univer sity , Guang zhou , Guangdong P rov ince 510515 , China)
ABSTRACT　Objective:To evaluate the inhibit ing effects of the root of Mallotus apelta (Lour.)Muell.-Arg.
on duck hepat it is B virus(D-HBV) in vivo. Methods:Forty nestling duckswith congenitally infect ion of D-HBV
detected by PCR were randomly divided into five groups:untreated group , lamivudine-treated group , and
high-, medium-and low-dose root of Mallotus apelta-treated groups. The ducks in the lamivudine-treated
group were fed lamivudine with a dose of 50 mg/kg once. Ducks in the three-dose Mallotus apelta-treated
groups were treated with different doses of decoction of this herbal medicine for 21 days respect ively. The
serum content of D-HBVDNAwas determined by quantitat ive real-time PCR technique before and 7 days after
the treatment , and on the 7th , 14th and 21st day of the treatment. Liver biopsy was also executed before and
after the treatment to observe the histopatholog ical changes. Results:Lamivudine showed a rapid inhibiting
effect on D-HBV DNA , but this effect didn’ t last long , and the serum level of D-HBV DNA increased again
after treatment. The serum level of D-HBV DNA dropped markedly in the high-and medium-dose Mallotus
apelta-treated groups on the 14th and 21st day. Low-dose Mallotus apelta revealed no obvious inhibiting
effect on D-HBV. After treatment , the inhibiting effect in the root of Mallotus apelta-treated group continued
as compared with that in the untreated group. The histopatholog ical changes of liver t issues showed that the
inflammation in the high-dose root of Mallotus apelta-treated group was weakened as compared with that in
the lamivudine-treated group. Conclusion:The root of Mallotus apelta has therapeut ic effect on D-HBV. It
can restrain the duplication of D-HBV in vivo. Although this effect is weaker than that of lamivudine , it cont in-
ues longer. Thus this herbal medicine is an effective , safe and economical drug for hepat itis B.
285 中西医结合学报 2006年 5月第 4卷第 3期　J ou rnal of C hinese Integrative Medicine , May 2006 , Vol. 4 , No. 3
KEY WORDS　drugs , Chinese herbal;root of Mallotus apelta (Lour.) Muell.-Arg. ;duck hepatit is B virus;
quant itative real-time PCR;animal experimentation
Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao/J Chin Integr Med , 2006 , 4(3):285-288　　www. jcimjournal. com
　　人乙型肝炎病毒(hepat itis B virus , HBV)是导
致肝脏疾病的首要病因 ,每年因慢性乙型肝炎(或因
其继发的肝硬化 、肝细胞癌)导致 50万 ～ 120 万患
者死亡 ,是全球第 10大死亡病因[ 1] 。抗病毒治疗是
降低乙型肝炎致死率的重要途径。天然药物具有副
作用小 、经济及长期使用安全等优点。在长期的临
床观察中 ,我们发现白背叶根对慢性乙型肝炎和肝
纤维化有较好的疗效 。本实验旨在观察白背叶根体
内抗鸭乙型肝炎病毒 (duck hepat itis B virus ,
D-HBV)的效果 ,并初步探讨其作用机制 。
1　材料与方法
1. 1　实验动物　3日龄广州麻鸭 150只 ,购自广州
大沥江夏村鸭场 ,雌雄不拘 ,体质量 40 ～ 50 g ,常规
PCR法筛选 D-HBV 阳性鸭子 。
1. 2　药物　白背叶根购于南方医科大学中医系中
药房 , 水煎 3 次后经 75 ℃水浴浓缩成含生药
10 g /m l。拉米夫定 , G laxow ellcome 公司产品 ,
100 mg /片。
1. 3　主要试剂　标准 D-HBV 阳性血清由广州中
医药大学张奉学教授惠赠 。Taq酶 , 10×PCR buff-
er 、dNT P mix ture 、6×loading buf fer ,均购自大连
宝生物工程有限公司 。DNA提取液 ,购自中山大学
达安公司 。引物参照文献[ 2] 设计 ,由北京赛百盛生
物工程有限公司合成 ,扩增产物 217 bp;上游引物
5’ AACCA T TGAAGCAA TCACTAGAC 3’ ,下游
引物 5’ A TCTA TGG TGGCTGCTCGAACTA 3’ 。
LightCycler FastStar t DNA MasterPlus SYBR Green
Ⅰ [含 PCR Grade ,Master Mix (Taq酶 , 10×buff-
er , dN TP , SYBR Green Ⅰ , Mg 2+),双蒸水] ,购自
Roche 公司。常规 HE 染色及 D-HBsAg特殊染色
(地衣红)所需试剂由南方医科大学病理学教研室提
供。
1. 4　主要仪器　PCR System 9700 扩增仪 ,美国
GeneAmp 公司产品;Light Cycler Ⅱ实时定量
PCR检测仪 , Roche 公司产品。
1. 5　动物模型筛选　150 只雏鸭均颈静脉取血各
0. 1 ～ 0. 2 ml , 10 000 r /min离心 5 min 后取血清 。
将 10 μl DN A提取液加入 10 μl待测血清中 ,混匀
后经沸水浴 10 min , 10 000 r /min离心 5 min 后取
上清 。PCR 反应液组成:10 ×PCR buf fer 5 μl 、
dNTP 4 μl ,上游引物(10 μmol /L)2 μl 、下游引物
(10 μmol /L)2 μl 、Taq酶 0. 5 μl 、血清提取物 5 μl、
双蒸水 31. 5μl ,构建成 50μl反应体系。反应条件:
94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s ,55 ℃退火30 s ,
72 ℃延伸 40 s ,共 37 个循环;扩增产物217 bp。在
2%琼脂糖凝胶上电泳 ,参照阳性血清和标准分子量
印迹检测 PCR结果 。
1. 6　动物分组和药物干预　PCR筛选 H-DBV 阳
性雏鸭共 40只 ,随机分成 5组 ,每组 8只:空白对照
组 、拉米夫定组 、白背叶根高剂量组 、白背叶根中剂
量组 、白背叶根低剂量组。各组均喂以普通饲料 ,自
由 饮 水 。 将 拉 米 夫 定 研 碎 溶 于 水 , 按
50 mg kg -1 d - 1给拉米夫定组雏鸭 1次性灌胃。
白背 叶根 高 、中 、低 剂 量 组 分 别按 30 、 20 、
10 g kg - 1 d- 1白背叶根浓缩液灌胃 , 1次 /d;复
测体质量 1次 /周 ,根据体质量调整用药剂量。连续
喂药 21 d后 ,停药观察 1 周。
1. 7　D-HBV DNA 定量检测　于用药前 、用药第
7 、14 、21 天及停药后第 7 天各抽取雏鸭颈静脉血
0. 2 m l ,离心后 - 20 ℃保存待检。参照说明书 ,反
应液组成:上游引物(10 μmo l/L)1 μl , 下游引物
(10μmol /L)1 μl(引物序列同前), LightCycler
FastStar t DNA M aster
Plus
SYBR G reen Ⅰ 13 μl ,血
清提取物 5 μl。构建 20 μl 反应体系 。反应条件:
93 ℃预变性 2 min;95 ℃变性 10 s ,60 ℃退火10 s ,
72 ℃延伸 12 s ,共 40个循环;温度变化速率设定为
20 ℃/ s;参照标准样品拷贝数为 1. 0×107 。实验条
件设置 、荧光信号检查 、数据读取和分析均由 Roche
LightCycler Run 5. 32软件完成 。
1. 8　肝脏组织病理学检查 　用药前剖杀 D-HBV
阳性雏鸭 2只 ,灌药第 21天剖杀白背叶根高剂量组
和拉米夫定组雏鸭各 2只 ,取肝脏组织行常规 HE
染色后观察炎症情况 , 地衣红特殊染色观察
D-HBsAg分布的变化 。
1. 9　统计学方法　所有数据采用 SPSS 13. 0软件
进行统计学分析 ,血清 D-HBV DNA 含量组内比较
采用配对 t检验 ,各时间段组间比较采用单因素方
差分析(LSD法)。
2　结　果
2. 1 　PCR 筛选 D-HBV 阳性雏鸭的结果 　从
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150只雏鸭中共筛选出 43 只 D-HBV 阳性雏鸭 ,阳
性率为 28. 7%,符合文献报道[ 3] 。见图 1 。
图 1　PCR 扩增产物电泳图谱
Figure 1　Electrophoregram of PCR products of D-HBV
A &B:Posi ti ve sam ples;C &D:Posit ive-detected samples.
2. 2　各组雏鸭治疗效果的比较　拉米夫定起效最
快 ,白背叶根组血清D-HBVDNA含量则缓慢下
降 ,下降程度与剂量和用药时间相关。治疗第 7 、
14天时 ,拉米夫定组的疗效要优于白背叶根各组;
治疗第 21天 ,拉米夫定组和白背叶根高 、中剂量组
疗效比较无统计学差异;停药后 ,拉米夫定组 D-
HBV DNA含量明显回升 ,而白背叶根组则有后续
抑制 D-HBV 复制的作用 ,但两组比较无统计学差
异 。见表 1。
2. 3　各组雏鸭治疗前后肝脏组织的病理学变化　
治疗前后肝脏组织 HE 染色结果:治疗前雏鸭肝脏
组织可见肝细胞小灶状坏死 ,炎性细胞浸润 ,周边部
分肝脏细胞肿胀 ,水样变性;治疗后 ,白背叶根高剂
量组和拉米夫定组肝脏组织可见炎症有不同程度的
减轻 ,未见小灶状坏死 ,变性肝细胞减少。治疗前后
肝脏组织地衣红特殊染色结果:伴随炎症程度的减
轻 ,D-HBsAg 分布减少 ,白背叶根高剂量组较拉米
夫定组炎症改善明显。见图 2 、3。
表 1　各组治疗不同时期血清 D-HBV DNA含量的比较
Table 1　Copy number of D-HBV DNA in serum of nestling ducks before , during and af ter treatment in different groups
( x ±s , copy /ml)
Group n
Copy number of D-HBV DNA
Pre-t reatment T re atment fo r 7 day s T reatment fo r 14 day s T rea tment fo r 21 day s 7 day s afte r treatment
Unt reated 8 (1. 95±0. 95)×108 (1. 73±0. 74)×108 (1. 47±0. 71)×108 (6. 64±0. 77)×108 (1. 45±0. 75)×108*
High-do se M.
ape lta-t reated 8 (1. 92±1. 13)×108 (1. 80±1. 09)×108▲▲ (6. 69±2. 84)×107 *△ (4. 97±4. 83)×107 *△△ (4. 02±3. 53)×107*△
Medium-do se M.
ape lta-t reated 8 (1. 87±0. 90)×108 (1. 54±0. 69)×108▲▲ (7. 48±4. 81)×107△▲▲ (5. 66±4. 14)×107 *△△ (4. 87±4. 27)×107*△
Low-dose M.
ape lta-t reated 8 (1. 73±0. 66)×108 (1. 52±0. 61)×108▲▲ (1. 51±0. 61)×108▲▲ (1. 36±0. 47)×108▲▲ (1. 28±0. 65)×108*
Lam ivudine-
t reated
8 (1. 68±1. 17)×108 (1. 14±0. 57)×107 *△△ (6. 35±8. 79)×106 *△△ (3. 77±3. 43)×106 *△△ (6. 82±6. 39)×107
　　*P <0. 05 , ** P <0. 01 , vs pre-treatment;△P <0. 05 , △△P <0. 01 , vs untreated g roup;▲P <0. 05 , ▲▲P <0. 01 , vs lamivudine-t rea ted group.
图 2　治疗前后肝脏组织病理学改变(HE染色 , ×400)
Figure 2　Histopathological changes of liver tissue in nestling ducks with D-HBV infection before
and after treatment (HE staining , ×400)
A:Pre-t reatmen t;B:Lamivudine-t reated g rou p af ter t reatment;
C:High-dose Ma llotus a pelta-t reated group af ter t reatm en t.
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图 3　治疗前后肝脏组织病理学改变(地衣红染色 , ×400)
Figure 3　Histopathological changes of liver tissue in nestling ducks with D-HBV infection before
and after treatment (aceto-orcein staining, ×400)
A:Pre-t reatment;B:Lamivudine-t reated group after t reatment;C:High-dose Mallotus apel ta-t reated group after treatment .
3　讨　论
D-HBV 与人 HBV 两者的分子结构和发病机
制存在许多相似之处 。近年来 ,鸭乙型肝炎动物模
型已经成为国内外公认的用以筛选抗 HBV 药物 、
评价疗效和研究其发病机制的模型 。先天感染 D-
HBV 模型较后天感染 D-HBV 模型有更好的实验
价值 ,血清 D-HBV DNA相对稳定 ,维持时间长[ 4] ,
有利于客观地评价药物疗效 。本实验采用 PCR法
筛选较常用的 Do t-blot 法灵敏度高 、特异性强 、时
间短[ 2] 。筛选出的雏鸭可立即用于实验 ,保证用药
期间血清 D-HBV DNA的稳定性 ,可进一步减小实
验误差。
荧光实时定量 PCR技术利用能特异标记 PCR
产物的荧光物质 ,以显示 PCR产物的动态积累 ,从
而得到 S型的扩增曲线 。在曲线的前期阶段 , PCR
反应符合指数性扩增 ,因此可以在单纯指数方程的
基础上 ,通过比较产物积累的速度(时间)进而确定
初始模板的分子量 。其与传统的 Do t-blot 检测方
法存在着本质的区别 ,是一种全定量的方法 ,具有灵
敏度高 、误差小 、可重复的优点[ 5] 。
目前对乙型肝炎病毒引起的慢性肝病尚无理想
的治疗方法。临床常用的两类抗病毒药为干扰素 ɑ
和核苷类药物。干扰素 ɑ 治疗的有效率较低以及难
以耐受的副作用限制了其临床应用;核苷类代表药物
拉米夫定同样因为需要较长的疗程及耐药性问题而
难以成为理想的治疗药物[ 1] 。因此 ,寻找疗效确切 、
长期服用安全且价格低廉的药物是亟待解决的问题。
本实验观察了白背叶根抗 D-HBV DNA 的作
用。实验结果表明 ,白背叶根具有一定的体内抑制
D-HBV 的作用 ,其起效较慢 ,且疗效与用药剂量及
用药时间相关。白背叶根高剂量组在治疗第14天
显效;而中剂量组在治疗第 21天显效;低剂量组在
治疗期间未见明确的抑制病毒作用。白背叶根高 、
中剂量组在停药后仍显示有明显的抑制病毒的作
用。拉米夫定抑制 D-HBV 起效较早 ,在治疗第
14天其病毒含量已降至较低水平 ,但停药后病毒含
量又立即回升。拉米夫定组和空白对照组血清病毒
含量的动态变化结果与其他学者的实验报道一致 ,
实验过程中各组血清 D-HBV均未转阴。白背叶根
组与拉米夫定组比较 ,白背叶根起效慢 ,但其抑制病
毒复制的作用平稳而持久 ,提示白背叶根抑制体内
D-HBV 复制的机制不同于拉米夫定。血清病毒检
测结果与肝脏病理组织学表现基本一致 ,随着病毒
复制水平的降低 ,肝脏炎症也有所减轻 ,但白背叶根
高剂量组比拉米夫定组炎症改善程度更为明显。说
明白背叶根不仅能抑制病毒的复制 ,同时具有保护肝
脏细胞 、抗氧化及抑制炎症反应的作用 ,这与我们先
期对白背叶根抗肝纤维化研究所得的结论一致[ 6] 。
本实验结果证实 ,白背叶根能够抑制 D-HBV
在体内的复制 ,其作用较拉米夫定弱但疗效稳定。
关于白背叶根抗病毒的作用机制及其抗病毒的有效
成分 ,尚待进一步研究 。
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[收稿日期] 　2005-07-27
288 中西医结合学报 2006年 5月第 4卷第 3期　Journal of Chinese Integ rat ive Medicine , May 2006 , Vol. 4 , No. 3