全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2006, 26( 8): 67~ 71
百日草链格孢菌粗毒素的生产、
提取及稳定性的研究*
李荣金 强 胜**
(南京农业大学杂草研究室 南京 210095)
摘要 百日草链格孢菌是从世界性恶性杂草苍耳罹病植株上分离得到的植物病原真菌, 研究表
明该菌对紫茎泽兰有致病作用,可产生致病的次生代谢产物 ) 毒素。对该菌的次生代谢产毒能
力情况进行了研究。对培养基条件进行了筛选, 确定了有利于该菌产毒的温度为 25e 、pH值为
6. 5、培养时间为 9~ 12d、转速 110r /m in、黑暗与充分溶氧等培养条件。利用大规模发酵与发酵产
物后提取工艺获取粗毒素,并通过分析贮存时间、温度、光照对粗毒素稳定性的影响, 表明其具有
开发为天然微生物源除草剂的潜力。
关键词 百日草链格孢菌 产毒 毒素提取 大孔吸附树脂 稳定性
中图分类号: Q819
收稿日期: 2005-12-19 修回日期: 2006-03-29
* 国家 / 8630计划资助项目 ( 2001AA246012)
** 通讯作者,电子信箱: wr@l n jau. edu. cn
利用微生物的次生代谢产物 (抗生素, 致病毒素
等 )作为农药不仅具有活体微生物的优点, 还克服了部
分活体微生物农药作用目标有害生物单一、货架期短、
对环境条件要求较苛刻等方面的一些缺点 [1 ]。多数天
然产物源除草剂尤其是微生物源除草剂施用环境较多
数化学除草剂安全的优点吸引了很多人的注意力 [2]。
而深入探究毒素物质, 以期从中找到天然源的环保型
化学除草剂之先导化合物 ( lead compound),是天然产
物利用研究的一个热门领域。
紫茎泽兰 (Eupa toriun adenophorum )是一种外来入
侵恶性杂草,在我国南方一些地区有迅速蔓延之势, 对
生态多样性产生了不利影响。百日草链格孢菌
(Alterna ria zinn iae)作为广泛分布的真菌链格孢菌
(Alterna ria sp. )之一种, 具有开发为生物除草剂的潜
力 [3, 4 ]。百日草链格孢菌培养液对外来入侵恶性杂草
紫茎泽兰 (Eupa toriun adenophorum )与加拿大一枝黄花
(So lidago canadensis)有毒害作用,证明其经次生代谢
向环境释放了毒素物质。但是目前还没有关于百日草
链格孢菌的产毒最适液体深层培养条件的报道,并且
也未见其放大深层发酵产毒培养实例。Karlatti等 [ 5]对
自万寿菊分离出的百日草链格孢菌在多种培养基中的
生长情况进行了描述,发现马铃薯葡萄糖肉汤培养基
最适宜该菌的生长,对百日草链格孢菌毒素的提取,除
了 Vurro等 [6 ]利用冷冻干燥技术作了相关工作以外,目
前为止没有为开发生物源除草剂而对百日草链格孢菌
毒素进行大规模提取的研究报道。本文从百日草链格
孢菌的生产、提取及其稳定性研究入手,为该毒素的利
用做前期工作。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株与生测植物
百日草链格孢菌 QS10101(Alternaria zinniae)从自
然发病的苍耳 (Xan th ium sibiricum )病斑上分离筛选出
来,对紫茎泽兰与加拿大一枝黄花有一定程度的致病
性。紫茎泽兰生物测定生物体为温室培育 5个月的实
生苗的倒数第二片新叶。
1. 2 产毒培养方法
菌种从经保藏的试管中接出来进行活化,然后转
接于 PDA培养基上,在培养箱中于 25e、黑暗条件下
培养 5d,用直径为 1cm的圆形打孔器取菌落边沿菌丝
3块,接种到盛装有 75m l PSK液体培养基的 150m l三
角瓶中, 置于摇床 ( DHZ-D, 江苏太仓 )中于 25e 、
110r /m in条件下进行培养。 ( PSK:自配土豆汁,葡萄糖
DOI：10.13523/j.cb.20060814
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 26 No. 8 2006
2% ,琼脂 2% ) (自配土豆汁: 200g土豆去皮,加 1000m l
水煮沸 30m in, 用双层纱布过滤, 最后加水定容至
1000m l的水溶液 )。
1. 3 无菌丝毒素滤液的制备及其生测方法
利用 150目铁丝网将发酵原液过滤,将滤液用两
层 15 @15cm中速定性滤纸于 0. 1MP a真空压力下抽
滤,得无菌丝纯滤液。为了便于控制, 尽量模拟自然环
境条件,快速反映毒素的毒害能力, 生测采用健康叶片
的离体叶片针刺法 [7 ]接种 15L l无菌丝滤液或粗毒素
溶液 (见 1. 6节 ), 5次重复,植物离体叶片培养一定时
间后,置解剖镜下测定, 取近圆斑状病斑直径作为病斑
大小,以无菌水作对照。
1. 4 不同培养条件对产毒的影响
1. 4. 1 时间设置 按照 1. 2节中方法培养后 1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15d取样,每次 3瓶, 制
备无菌丝滤液。
1. 4. 2 温度设置 参照 1. 2节中方法分别于 5、10、
15、25、30、35、40e 下培养 9d,制备无菌丝滤液。
1. 4. 3 溶氧设置 参照 1. 2节中方法分别往体积为
1000m l的三角瓶中加入体积为 100、200、300、400、500、
600、700m l的培养基,利用箔金纸与塑料薄膜进行封口
处理培养 9d,制备无菌丝滤液。
1. 4. 4 光照设置 按照 1. 2节中方法设计 3种处理:
12L /12D、连续光照、连续黑暗培养 9d后制备无菌丝
滤液。
1. 4. 5 转速设置 参照 1. 2节中方法分别在转速设为
20、40、60、80、100、120、140、160、180、200r /m in条件下
培养 9d,制备无菌丝滤液。
1. 4. 6 pH值设置 按照 1. 2节中方法利用 HC l和
NaOH调节配制 pH值从 3至 10 (间隔 0. 5)的 PSK培
养基,培养 9d,制备无菌丝滤液。生测时将无菌丝滤液
和对照的 pH统一调至 7. 0。
1. 5 大批量放大发酵生产工艺初探
利用 20L的发酵罐 ( GUCS磁力搅拌不锈钢发酵
罐,镇江东方生物工程公司 )进行放大发酵产毒试验,
以摇床培养条件为基准摸索进行产毒培养条件以积累
毒素粗制品。将 PSK以 1倍浓度、1 /2浓度、1 /4浓度
和 SCS培养基 (成分:黄豆粉:玉米粉:蔗糖 ),其中黄豆
粉:玉米粉: 蔗糖配比分别以 30gB30gB50g、45gB45gB
75g、60gB60gB100g进行试验,控制温度为 25e ,转速为
40r /m in,最大通氧量达到 80%。 (各处理条件得到的
无菌丝滤液与经过 150目筛孔及两层滤纸过滤的培养
基与无菌水作对照 CK0、CK1)。
1. 6 发酵产物提取工艺 (大孔吸附树脂浓缩 +有机溶
剂萃取法 )
选择极性不同的有机溶剂石油醚、1, 2-二氯乙烷、
氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等,分别对经浓缩的毒素
水溶液进行萃取,方法是:将百日草链格孢菌培养原液
5L制成无菌丝滤液后经大孔树脂 D101进行吸附过柱
浓缩,酒精洗脱后利用减压旋转蒸发浓缩 ( RE52CS旋
转蒸发器,上海亚荣 )后剩下约 500m l毒素水溶液即停
止浓缩,从中取 6份,每份 50m l再用等体积有机溶剂萃
取 1次,分层得到有机相,浓缩干燥后少量甲醇溶解加
水至 50m l并用水稀释 3倍,用离体叶片针刺法进行活
性测定,以同样稀释 3倍的毒素浓缩水溶液作对照,以
确定具有最佳萃取效率的有机溶剂。再用等体积有机
溶剂对剩余水相进行 3次萃取,合并所有同类有机溶
剂之有机相,常压蒸馏、(正丁醇在 0. 1MPa, 80e 条件
下减压浓缩 )回收有机溶剂,得粗毒素制品,稀释到原
液浓度,以培养基作对照,用离体叶片针刺法对粗毒素
进行活性测定, 并与无菌丝滤液作活性比较。每个处
理重复 3次。
1. 7 粗毒素的稳定性
1. 7. 1 温度对粗毒素稳定性的影响 将粗毒素制品
分别置于 0、30、60、90、120e 下处理 30m in, 然后测定、
比较各自的活性,以无菌水作对照,每个处理重复3次。
1. 7. 2 贮存时间对粗毒素稳定性的影响 将粗毒素
制品置于 25e 下贮存 5、30、90、180、360d后,生测比较
各自的活性,以无菌水作对照,与不经处理的粗毒素的
活性比较。每个处理重复 3次。
1. 7. 3 贮存光照对粗毒素稳定性的影响 将粗毒素
制品置于 25e 下贮存于自然光照 1、5、10、15、20、25、
30d后,生测比较各自的活性, 以放置于黑暗处的粗毒
素与无菌水作对照。每个处理重复 3次。
2 结果与分析
2. 1 培养时间对百日草链格孢菌产毒能力的影响
百日草链格孢菌在 PSK液体培养基中培养, 培养
液中毒素含量在第 9d达到最高。在培养前 9d,毒素含
量随培养时间的延长而增加, 到第 9d达到最高峰, 然
后就基本保持在该水平上 (图 1)。
2. 2 培养温度对百日草链格孢菌产毒能力的影响
温度对百日草链格孢菌的产毒能力影响显著。在
测定的温度范围内,该菌培养液均含有致病毒素,但是
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2006, 26( 8) 李荣金 等: 百日草链格孢菌粗毒素的生产、提取及稳定性的研究
图 1 培养时间对百日草链格孢菌产毒能力的影响
F ig. 1 In fluence of cu ltu re tim e on the tox in-
p roduc ing capab ility ofA lterna r ia zinn ia e
其最大毒素含量的最适培养温度是 25e ,在此条件下,
测试植物的病斑直径为 318mm,与其它的温度条件下
相比差异极显著 ( P < 0. 01),见图 2。当培养温度较低
时,菌丝生长缓慢;温度高于 30e 时,菌丝变黑,培养液
中毒素含量急剧下降。
图 2 培养温度对百日草链格孢菌产毒能力的影响
F ig. 2 In fluence of cu ltur e tempera tur e on the tox in-
produc ing capab ility ofAlte rna r ia zinnia e
2. 3 培养溶氧情况对百日草链格孢菌产毒能力的影响
图 3表明,溶氧量越高,培养液中毒素含量越高,
表明百日草链格孢菌产毒能力越强,在本实验条件下,
当溶氧量达到最高 100m l(空气 B容器 = 9B10)时,毒素
含量最高,且与其它溶氧条件差异极显著。该结果表
明百日草链格孢菌属于好氧型真菌。
图 3 溶氧条件对百日草链格孢菌产毒能力的影响
F ig. 3 Inf luence of d issolved O2 on th e toxin-
p roduc ing capab ility ofA lterna r ia zinn ia e
2. 4 光照对百日草链格孢菌产毒能力的影响
在 12L /12D与连续黑暗条件下, 百日草链格孢菌
产毒培养液中毒素含量均较高, 病斑直径分别达到
01222、0. 234;而在连续光照条件下毒素含量有所下降,
病斑直径为 0. 200,表明连续光照对产毒积累有一定程
度的抑制作用。
2. 5 转速对百日草链格孢菌产毒能力的影响
转速在 80至 120r /m in时培养液中毒素含量最大
(图 4),转速在 80至 180r /m in时毒素含量的差异不很
大,但与其它处理差异极显著。转速低于 80r /m in时,
菌丝生长速度慢, 毒素含量低;转速高于 120r /m in时,
菌丝呈黑色,毒素含量也随之减小。
图 4 转速对百日草链格孢菌产毒能力的影响
F ig. 4 In fluen ce of rota tion sp eed on th e toxin-
produc ing capab ility ofA lterna ria zinn ia e
2. 6 培养基的 pH值对百日草链格孢菌产毒能力的影响
百日草链格孢菌用 PSK液体培养基培养时, 培养
液中毒素含量最高的 pH值是 6与 6. 5(图 5),即最适
产毒 pH,与其它 pH值的毒素含量差异极显著。这说
明微偏酸的条件利于百日草链格孢菌产毒。
图 5 pH值对百日草链格孢菌产毒能力的影响
F ig. 5 In fluen ce of cu ltur e pH on the tox in-produc ing
capab ility ofAlterna r ia zinn iae
2. 7 百日草链格孢菌大批量发酵生产工艺初探
因为百日草链格孢菌培养时溶氧越大越有利于产
毒的积累,故以最大通气量进行发酵罐通气培养,并且
通气引起培养基翻滚,有利于溶氧、培养基的搅拌以及
菌丝对营养的全面高效吸收,加快其生长速度,提高发
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中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 26 No. 8 2006
酵效率。在第 4d与第 6d分别流加 10%的 C、N源。保
持温度在 25e ,同时转速保持 40r /m in。
利用不同浓度的 PSK培养基进行培养试验,培养
基为 1 /4倍 PSK浓度时,大发酵罐的培养产毒能力最
强。培养基浓度为 PSK与 1 /2PSK时,培养产毒能力反
而下降,并且发酵产生泡沫较多, 引起培养基的部分损
失,其发酵液粘度变大。
利用不同配比 SCS培养基进行培养试验,当黄豆
粉 B玉米粉 B蔗糖配比为 45gB45gB75g时,产毒力最强。
黄豆粉B玉米粉 B蔗糖配比为 60gB60gB100g时,菌丝生
长量多,但产毒能力降低。 30gB30gB50g时, 菌丝较少
且微黑,产毒能力较低。
2. 8 发酵产物提取工艺 (大孔吸附树脂浓缩 +有机溶
剂萃取法 )
等体积有机溶剂萃取 1次, 稀释 3倍检测活性, 萃
取前的毒素浓缩水溶液稀释相同倍数作为对照。毒素
的第一次萃取回收率正丁醇、乙酸乙酯、1, 2-二氯乙烷、
氯仿、乙醚可分别达到 50. 7%、39. 6%、36. 9%、
2011%、12. 4%。石油醚的萃取液毒害效果最差。再
用等体积有机溶剂对剩余水相进行 3次萃取,合并所
有相同有机溶剂的萃取物,常压蒸馏得到的粗毒素进
行活性检测,萃取最终相对于酒精浓缩液总回收效果
正丁醇、乙酸乙酯、1, 2-二氯乙烷、氯仿、乙醚可分别达
到 98. 3%、91. 8%、89. 4%、51. 0%、51. 7%。
大孔吸附树脂浓缩 +有机溶剂萃取法毒素回收率
最高可达 87. 4% @98. 3% = 85. 9%。
经过有机溶剂提取的毒素活性能力表明了发酵原
液中的毒害物质应属于性质较为稳定的物质, 不可能
是大分子水溶性蛋白、酶类、多糖等物质。
2. 9 粗毒素稳定性的确定
2. 9. 1 温 度 百日草链格孢菌粗毒素的活性对温
度不敏感,各组差异不显著, 即使高温处理对粗毒素的
活性也几乎没有影响, 可见百日草链格孢菌毒素通过
次生代谢产生了热稳定的、对紫茎泽兰叶片具有致病
活性的外毒素,可贮存于室温下。
2. 9. 2 贮存时间 百日草链格孢菌粗毒素的活性随
着贮存天数的增加并没有出现衰减,各组差异不显著,
可见百日草链格孢菌毒素通过次生代谢产生了可以长
时间保留的对紫茎泽兰叶片具有致病活性的外毒素。
这为该毒素的积累提供了方便, 并揭示了更加广阔的
市场开发应用潜力。
2. 9. 3 贮存光照 百日草链格孢菌粗毒素的活性随
着自然光照天数的增加并没有减弱,各组差异不显著,
可见百日草链格孢菌毒素通过次生代谢产生了耐光照
而可以长时间保留活性的、对紫茎泽兰叶片具有致病活
性的外毒素。这进一步揭示了其田间施用的适用性。
3 讨 论
利用微生物所产生的次生代谢产物开发生物源除
草剂,首先要积累并寻找出致病毒素物质,因此, 对微
生物的产毒能力进行研究, 以找到最有利于该菌次生
代谢向高效率生产毒素方向进行的工作是非常重要
的。本研究筛选出百日草链格孢菌最佳产毒温度、pH
值、时间、黑暗与光照、溶氧、转速等培养条件,并且发
现培养环境条件对产毒能力的影响非常明显。温度较
低时,其菌丝生长速度缓慢,菌丝产量较少,且发酵原
液粘度较大,产毒能力下降,可能是因为菌丝对环境产
生应激反应而向外分泌了胞外多糖并因此改变了次生
代谢的方向从而使得产毒能力降低。温度高于 30e
时,菌丝变黑,菌丝产量急剧减少,产毒能力急剧下降,
可能是因为温度过高,导致呼吸速率加快,营养因此而
消耗,次生代谢的方向可能因此而被改变使得产毒能
力急剧下降。培养时间必须达到一定天数,且随着天
数的增加,产毒能力持续增加,可以推测毒素不会被利
用来作为其它代谢的底物并因此得以积累。稍微偏酸
的条件与非连续光照有利于产毒,而保证充分的溶氧
是菌丝生长与产毒进行的关键因素之一。转速对溶氧
速度与营养利用速度的影响也是至关重要的:摇床转
速的大小影响了培养过程中营养物质与氧气的摄入量
与摄入速度。一方面,转速大时,培养液与空气的接触
面积大,供氧量多; 反之,则供氧量少。另一方面,转速
大时,菌丝与营养物质的接触几率上升, 接触面积大,
利用营养的速度也就提高了, 特别是振荡使得菌丝表
面微环境因营养被菌丝吸收利用而形成的营养低浓度
区域遭到破坏, 促进了营养物质向菌丝体表面液层的
渗透。但是,转速过大或过小都会使得菌丝产量受到
影响,过小,菌丝生长量不足, 过大,菌丝呼吸消耗过
旺,菌丝变黑,生物量也较少。所以,转速过大或过小,
产毒也受到影响。
现代生物深层发酵工程理论与设备与后提取工艺
为微生物除草剂的开发提供了强有力的工具,能够加
速微生物除草剂的开发与利用,对微生物除草剂放大
发酵的实践是对其产业化发展方向的积极而有益的探
索。放大发酵的首要条件是:本着经济的原则,在摇床
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发酵摸索出的有利于产毒代谢条件的基础上, 克服放
大发酵中因溶氧能力与流质系数的变化而产生的对菌
丝生长与产毒代谢的不利影响, 努力利用其它条件加
以协调。利用 PSK培养基进行不同浓度的产毒能力比
较试验,发现培养基为 1 /4倍 PSK浓度时,大发酵罐的
培养产毒能力最强, 说明大发酵罐的培养产毒在 PSK
浓度比较低时反而能够得到提高, 这有利于节约大规
模发酵的原料用量,使得产毒培养更加经济; 而利用较
高浓度的 PSK培养时,发酵液粘度较大,不利于后续过
滤提取加工工作的顺利进行。利用不同 SCS培养基浓
度配方的产毒培养说明培养基浓度过小时, 菌丝较少
且容易变黑,产毒能力较低;培养基浓度过大时,发酵
菌丝多,但是产毒能力并未因此而增加, 这可能是因为
菌丝的营养生长与毒素代谢平衡发生了改变, 不利于
产毒。发酵罐转速超过 60r /m in, 菌丝未到 5d就变黑,
导致产毒能力下降,而低于 40r /m in又使得菌丝产量不
足,可能是没有充分溶氧造成。利用发酵产物后提取
工艺进行提取流程的优化,有利于毒素的有效积累。
毒素的稳定性是毒素生产积累的又一关键因素。从贮
存时间、温度、光照对粗毒素活性的影响来看, 百日草
链格孢菌产生的致病毒素是比较稳定的,为进一步利
用其毒素,开发生物源化学除草剂提供了理论依据与
实践保障。
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P roduction, Extra ct ion and Stab ility for Crud e Phytotoxin
P roduced byAlterna ria zinn iae
LIRong- jin QIANG Sheng
(W eed Research Laboratory, N an jingAgricu ltura l Un iversity 210095, China)
Ab stract Alterna ria zinn ia e was a plan t fungal pa thogen isola ted from a world-wide weed Xan th ium
occidenta le, which cou ld cause someweeds ofAsteraceae disease. Itwas found that the fungusmade d isease spot
on the leaf through p roducing seconda ryme tabolite) phytotoxin. The toxin-produc ing capability of the fungus was
stud ied. The optimal cu ltura l conditions for producing phytotoxin were temperature 25e , pH 6. 5, cultu red
period 9~ 11d, rota ting speed 110r /m in, darkness and enough dissolved O2, crude toxin was ob tained through
large sca le fermentation. Analysis on the influence of time, temperature, lightness for storing on the stab ility of
phytotoxin ofAlterna ria zinnia e showed tha t the phytotoxin had the poten tial to develop as a herbicide origina ting
from m icroorgan ism.
K ey words Alternar ia zinnia e Production of phytotoxin Toxin extraction Microreticu lar resin
Stability
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