全 文 ：第 17 卷
第 2 期

Vol. 17
No . 2
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2009 年
3 月

Mar .

2009
红豆草黑腐病菌菌丝生长和产毒培养条件的优化
郭
霞,黄晓亚,李瑞华,朱建兰*
(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室(甘肃农业大学) ,
中
美草地畜牧业可持续发展研究中心,兰州
730070)
摘要:从红豆草自然发生的黑腐病病斑上分离得到细链格孢菌( A lternaria tenuis )菌株, 对该病菌的菌丝生长及其
产毒条件进行了研究。结果表明,病原菌在供试的 6 种培养液中均能生长并且产毒, 但在 PSK 培养液中生长及产
毒最好;在 1- 19 d 的培养时间内该病菌均可以生长及产生毒素,而在 13 d 时菌丝生长量及其产毒能力均达到最
大,菌丝生长与产毒能力间显著正相关; 该病原菌在 5~ 40
的范围内均可生长并产生毒素,但菌丝生长的最适温
度为 25
,而最适合产毒的温度为 15
;在 pH 值为 3~ 11 的范围内,该病菌均能生长并产毒, 而且偏酸性条件有
利于菌丝的生长及其毒素的产生,菌丝生长和产毒的最佳 pH 值分别为 4和 6。
关键词:黑腐病菌; 菌丝生长; 产毒; 培养条件
中图分类号: S812; Q939. 96




文献标识码: A




文章编号: 1007
0435( 2009) 02
0255
04
Optimization of Culture Condition for Hyphae Growth and Toxin
Production of Alternaria tenuis of Onobrychis viciaef olia Scop.
GUO Xia, HUANG Xiao
ya, LI Rui
hua, ZHU Jian
lan*
( Key laboratory of Gras sland Ecosystem of M inist ry of Educat ion & Sino
US Centers for Grazingland Ecosys tem
Su stainabilit y, Pratacultu ral College, Gansu Agricultural University, Lanzhou, Gansu Province 730070, China)
Abstract: Factor s af fect ing the hyphae g row th and tox in product ion of Al ternar ia tenuis isolated from black
rot o f sainfoin w ere studied. The results show that the pathogen could grow and product tox in in six kinds
of f luid media, but the opt imal liquid cultur e media fo r hyphae g row th and tox in product ion w as PSK.
During the cultural period o f 1 to 19 days, the hyphae grow th and phytotox in production w er e detected and
reached to max imum on 13th day, and there w er e a posit ive correlation betw een mycelial g row th and to xin
product ion. T he pathogen could g row and produce to xin under 5 to 40
, and the opt imum temperature fo r
mycelial growth and tox in production w as 25
and 15
, r espect ively. In a pH range of 3 to 11, the
pathogen could grow and produce tox in w ith favorable environment o f acid condit ion, the opt imal pH value
fo r hyphae g row th and tox in product ion w as 4 and 6, respect ively.
Key words: Al ternar ia tenuis ; Hyphae gr ow th; Toxin production; Culture condit ion


红豆草 ( Onobr y chis v iciaef ol ia Scop. ) 产量
高,适口性好,营养物质含量高,具有较强的抗旱、抗
寒能力,已成为干旱地区重要豆科牧草 [ 1]。黑腐病
是红豆草较为常见的病害, 流行年份严重威胁其产
量和品质[ 2] 。红豆草黑腐病是由链格孢属的细链格
孢( A l ternar ia tenuis Nees. ) (异名: 链格孢 A . al

ter nata)引起的[ 3] 。其致病主要机理是通过产生多
种致病毒素,引起被侵染植物组织的病理反应和伤
害。现已报道的 21 种寄主选择性植物病原真菌毒
素中,有 9种是由链格孢属病原菌引起的[ 4]。病原
菌的产毒能力与培养基类型和环境条件密切相
关[ 5 , 6]。据报道, 百 日草链格孢 菌 ( Al ternar ia
z inniae ) 产毒最佳条件为温度 25
, pH 值 6. 5, 培
养时间 9- 12 d, 足够的黑暗等[ 7] 。目前, 国内外对
牧草病害毒素的相关研究较少。本文对红豆草黑腐
病病菌的菌丝生长特性及其产毒条件进行研究,以
收稿日期: 2008
09
19;修回日期: 2009
01
12
基金项目:甘肃农业大学草业学院国家级重点学科学术骨干科研项目
作者简介:郭霞( 1984
) ,女,甘肃徽县人,硕士研究生,研究方向为植物病理学, E
m ail : gu oxia1984@ yahoo. cn; * 通讯作者 Au thor for cor

respondence, E
m ail: zhu jl@ gsau. edu . cn
草
地
学
报 第 17卷
期为该病害的防治提供理论依据。
1
材料与方法
1. 1
供试材料
菌株从自然发病的红豆草黑腐病叶片上经常规
分离、纯化 [ 8, 9]得到, 经室内致病性测定[ 10] , 对红豆
草叶片有较强的致病性。红豆草种子由甘肃农业大
学草业学院提供, 于 2006年采集, 品种为甘肃红豆
草( O. v iciaef ol ia cv. Gansu)。
1. 2 菌株培养
将供试菌种转接到 PDA 平板上活化培养 7 d
( 25
, L
D= 12
12) [ 11] ,使用灭菌打孔器( d= 4
mm)沿菌落边缘取相同大小的菌饼, 接种到盛有 30
mLPSK 液体培养基的小三角瓶中(均在无菌条件
下操作) [ 12] , 每瓶接菌饼 3个, 按照实验设计分别置
于不同条件下培养。
1. 3 试验设计
设置 6 种液体培养基: PD、PD + 红豆草汁
液[ 7]、PS、Fr ies、Czapek 和 PSK 培养液 [ 11] , 分别培
养1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 d。筛选出最适培养
基后, 将菌株分别置于最适培养基, 在不同温度
( 5
、10
、15
、20
、25
、30
、35
和 40
)的
培养箱中, 筛选出适宜培养时间。使用最适温度和
培养基,测定 pH 值从 3至 10的 8个梯度的培养液
菌丝干重和红豆草根长。
1. 4
菌丝干重的测定和无菌滤液的制备
每次每种培养液取 3瓶, 将培养好的菌液,用滤
纸过滤,测定其菌丝干重及处理催芽后的种子,并且
制备无菌滤液。采用已知重量的滤纸过滤培养好的
菌丝,过滤 6- 7 h后将滤纸连同菌丝体置于 80

2
的烘箱内烘 2 h, 然后称重, 减去滤纸重即为菌
丝干重[ 12]。滤液进行常规灭菌后即为红豆草黑腐
病菌的无菌培养滤液。
1. 5
种子催芽方法[ 13]
选取颗粒饱满、无污染的红豆草种子, 挑去杂
质,用 50
的水浸泡 10 min,经自来水冲洗 2~ 3次
后置于铺好滤纸的培养皿中, 并用干净的纱布覆盖,
置于 28
的恒温培养箱中, 1- 2 d后即出芽。
1. 6
毒素的生物测定[ 14] (采用种子根伸长法)
用毒素(无菌培养滤液)处理催芽 (芽长 1~ 2
mm)后的红豆草种子, 置于 23
的培养箱中培养96
h,测量根长, 同时设清水对照。计算根长抑制率,
公式如下:
根长抑制率( %) = 对照根长
处理的根长对照根长
100%
1. 7
数据处理
利用 Excel和 DPS数据处理系统 Duncan 新复
极差法进行差异显著性测定 [ 15]。
2
结果与分析
2. 1
液体培养基对红豆草黑腐病菌菌丝生长及其
产生毒素的影响
红豆草黑腐病菌在 PD、PD+ 、PS、Fries、Cza

pek 和PSK 培养液中均可生长,但是在 PSK培养液
中培养 13 d 时, 菌丝生长量达到最大值 1674. 97
mg,极显著高于其他培养液(表 1、图 1)。红豆草黑
腐病菌在 PSK 培养液制备的无菌滤液中产毒量最
多,并且对红豆草根长的抑制率也最高,达91. 73%;
而在 Czapek培养液中菌丝生长量最少, 为 334. 90
mg, 产毒量也最少, 对红豆草根长的抑制率为
54. 31% (图 2)。因此, 以下均选用 PSK 培养液为
最佳培养液。
表 1
不同培养液对菌丝的生长量及根长抑制率的影响
Table 1
Effect of different liquid culture medium on hyphae
g rowt h and inhibition r ate of sainfoin r oot
培养液
Liquid cultur e medium
菌丝干重( mg)
Dry w eigh t of hy phae
根长抑制率( % )
Root inhibit ion rate
PSK 1674. 97
0. 33aA 92. 64
1. 34aA
PD+ 720. 90
0. 25bB 87. 87
2. 05bAB
Fries 462. 57
0. 29bcB 85. 88
2. 68bcABC
PD 377. 23
0. 73cB 82. 02
2. 68cdBCD
PS 340. 73
1. 00cB 79. 79
4. 77deCD
Czapek 334. 90
0. 48cB 75. 49
4. 04eD


注:同列中不同大(小)写字母间差异极显著( P < 0. 01) ( 显著, P
< 0. 05) ,下同;表中数据均为 13 d时测量
Note: means w ith dif ferent smal l or capital let ters in the same
column are signif icant ly dif feren t at 0. 05 or 0. 01 level, r espect ively,
same as below; Data w ere measu red on 13th day
2. 2
培养时间对红豆草黑腐病菌菌丝生长及其产
生毒素的影响
在第 1- 7 d,在 PKS 培养液中菌丝生长量随着
256
第 2期 郭霞等:红豆草黑腐病菌菌丝生长和产毒培养条件的优化
培养时间的延长呈缓慢递增的趋势, 第 11 d开始,
菌丝量开始急剧增加, 在 13 d达到最大值 1647. 97
mg。此后, 菌丝生长量开始下降, 到第 15 d 后, 下
降变得很缓慢; 从同时期的根长抑制率可以看出, 菌
株产毒最强的时期与菌丝生长速度最快的时期相吻
合(图 1)。由此说明, 相同时期内, 在一定条件下,
红豆草黑腐病菌产毒量与菌丝的旺盛生长呈正相关。
图 1
不同时间对菌丝干重和根长抑制率的影响
Fig. 1
Effect of time on hyphae dry weight
and inhibition rate of sainfo in roo t
2. 3
培养温度对红豆草黑腐病菌菌丝生长及其产
生毒素的影响
红豆草黑腐病菌在 PSK 培养液中培养时,培养
温度对黑腐病菌菌丝生长和毒素产生均有极大的影
响(图 2)。病菌在 5~ 40
都能生长, 以 20~ 25

为适宜温度, 25
为最适温度;而产毒的最佳温度是
15
,其次是 20
、10
,这说明红豆草黑腐病菌产
毒的最适宜温度和体外培养生长最适宜温度不一致。
图 2
不同温度对菌丝干重和根长抑制率的影响
F ig . 2
Effect of t em perat ur e on dry w eight o f hyphae and
inhibition rate of sainfo in r oo t
2. 4
培养液 pH值对红豆草黑腐病菌菌丝生长及
其产生毒素的影响
在 PSK 培养液中, 25
培养时, 红豆草黑腐病
菌菌丝在 pH 为 3~ 10的范围内都能较好的生长,
最适宜为 4,菌丝干重达到 903. 60
0. 03 mg ,极显
著高于其他 pH 值(表 2)。产毒最佳的培养液 pH
值为 6,其次为 4。这说明该菌株菌丝生长与产毒的
最佳 pH 值不一致。
表 2
不同 pH培养液对菌丝的生长量及
根长抑制率的影响(PSK, 25
)
Table 2
Effect of liquid cultur e media pH on hyphae g rowth




and inhibition rat e o f sainfoin ro ot ( PSK , 25
)
pH 值
pH value
菌丝干重( m g)
Dry w eight of h yphae
pH 值
pH value
根长抑制率( % )
Root inhibit ion rate
4 903. 60
0. 03aA 6 92. 93
0. 96aA
7 508. 60
0. 15bB 4 84. 70
2. 17bB
5 443. 60
0. 03bcB 7 79. 28
0. 94cC
8 416. 50
0. 15bcB 5 77. 25
1. 83cdCD
9 386. 00
0. 03bcB 3 75. 87
1. 86deCDE
6 330. 90
0. 20bcB 8 74. 75
0. 96deDE
10 272. 80
0. 11cB 9 73. 91
1. 96eDE
3 244. 20
0. 03cB 10 72. 92
1. 83eE
3
讨论
3. 1
前人研究表明,病原菌在人工培养时的生长及
其产生毒素直接受培养基成分和外界环境条件的影
响。适宜的培养条件对毒素高产具有很大作用。万
佐玺等[ 6] 在研究分离自紫茎泽兰( Eupator ium A d

enophor um Spreng . ) 叶斑病 ( Mycor al losiel la eu

par i iodor ati )毒素时, 采用了设置不同的培养基、温
度、培养时间及培养液 pH 值等来筛选产毒条件,确
定了最适合该菌产毒的温度为 25
、培养时间为 5
- 7 d及培养液 pH 值为 4. 13。本试验与此结果不
一致,有关机理尚待进一步研究。
3. 2
据报道,培养基直接影响病菌的产毒量。禾谷
镰刀菌 ( Fusarium gr aminear um ) 可以在 MY

ROT T 和 MOSS 液体培养基中产生 DON 毒素, 而
在马铃薯( S olanum tuber osum L. )液体培养基中不
产生 [ 16]。改良 Richar d培养液适宜水稻( Or y z a sa

t iv a L. ) 纹枯病菌 ( Thanatep hor us cucumer i s ) 产
毒[ 1 7]。本试验结果表明, 红豆草黑腐病菌在 PSK
液体培养基中菌丝生长量及其产毒量均显著高于同
条件培养的其他液体培养基,与前人报道的紫茎泽
兰链格孢菌产毒的最适培养基相一致 [ 11]。
3. 3
吴蔼民等[ 18]报道, 不同培养时间的棉花( Gos

257
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报 第 17卷
sy p ium hirsutum L. )黄萎病菌( Vert i cil l ium dahl

iae )毒素产量相差很大, 培养 8 d的产毒量仅为培养
14 d的 1/ 3。周惠 [ 19]等对小麦( Tr i ti cum aest iv um
L. )黑胚病菌( Black po int of wheat )链格孢产毒条
件进行研究时发现, 该菌在 pH 值为 4的 PSK 培养
液中培养 13- 15 d 时提取的粗毒素毒性最强。在
本试验中, 培养到 11- 13 d 时, 最有利于病原菌菌
丝生长及产毒, 在第 13 d 时,病原菌在 PSK 培养液
中菌丝生长和产毒达到最大值。
3. 4
不同的温度可以显著影响病原菌菌丝生长及
其产毒的能力。本试验发现, 温度较高时有利于红
豆草黑腐病菌菌丝的生长, 最适宜菌丝生长的温度
为 25
,温度较低时有利于毒素的产生,最佳的产
毒温度为 15
, 而高温可抑制其毒素的产生, 这与
拓植尚志[ 21] 研究链格孢产毒规律的结果一致。但
是, Pathre等 [ 20]认为低温( 12
~ 15
)有利于禾谷
镰刀菌产毒。李荣金等[ 7] 研究发现, 温度对百日草
链格孢菌的产毒能力影响显著, 但其最大毒素含量
的最适培养温度是 25
,与其他的温度条件下相比
差异极显著,与本试验的结果不一致。
3. 5
病原菌在不同 pH 的 PSK 培养液中其菌丝生
长与产毒量存在显著差异。如张志强 [ 22]等研究大
蒜( A ll ium sat ivum L. ) 叶枯病菌 ( S temp hy l ium
vesicariu)产生的粗毒素时得出, 病菌培养液 pH 值
对其毒性影响很大。经过 24 h黑暗振荡培养 20 d
后, pH 值为 6. 0和 7. 0的菌株产生的粗毒素对种
子发芽的抑制作用最大, 发芽率分别为 13. 0% 和
10. 5%,均极显著大于其他各处理。M iller [ 16] 研究
发现, pH7~ 8时禾谷镰刀菌产生的毒素量最多。
4
结论
4. 1
PSK培养液最适于红豆草链格孢菌菌丝生长
及产毒培养;
4. 2
培养 13 d的红豆草链格孢菌生长及产毒能力
最强;而且随着时间的变化,红豆草黑腐病菌菌丝干
重及根长抑制率之间显著相关;
4. 3
最适红豆草链格孢菌菌丝生长和产毒温度为
25
和 15
;
4. 4
最利于红豆草链格孢菌菌丝生长和产毒的
PSK培养液 pH 值分别为 4和 6。
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(责任编辑
张蕴薇)
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