全 文 ：化学与生物工程 2006, Vol. 23 No. 3　Chemistry &Bioengineering 59　
基金项目:国家高技术研究发展计划“863”项目(2001AA246012)
收稿日期:2005 - 01 - 05
作者简介:李荣金(1979 -),男 ,四川隆昌人 ,硕士研究生 , 研究方向微生物代谢活性物;通讯联系人:强胜 ,教授。 E-mail:wr l@njau.
edu. cn。
百日草链格孢菌除草活性物的分离 、纯化与结构鉴定
李荣金 , 强　胜
(南京农业大学生命科学学院植物科学系 ,江苏 南京 210095)
　　摘　要:利用三次经典硅胶柱层析 、多次 TLC 和 H PLC 制备得到对紫茎泽兰有致病性的毒素单体。按照常规有机
化合物鉴定方法对百日草链格孢菌毒素化学结构进行鉴定。利用 MS 、NM R、X-射线衍射法进行分子结构信息的精确分
析 , 得到该物质的晶体结构的信息并将其与软件结合得到直观的分子结构模型。该纯毒素物质分子量为 280 ,毒素化学
结构确定为 Brefeldin(BFA)。
关键词:百日草链格孢菌;毒素;纯化;鉴定;X-射线衍射
中图分类号:S 451　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1672 - 5425(2006)03 - 0059 - 04
　　微生物农药 ,尤其是利用微生物的次生代谢产物
(抗生素 、致病毒素等)作为农药不仅具有活体微生物
的优点 ,还克服了活体微生物农药作用目标有害生物
过于单一 、货架期短 、对环境条件要求苛刻的缺
点[ 1 ～ 4] 。
百日草链格孢菌(A lternaria z inniae)作为广泛
分布的真菌链格孢菌(Alternaria spp. )之其中一种 ,
具有开发为生物除草剂的潜力[ 5 , 6] 。植物病原真菌具
有致病性的主要原因之一是其向外分泌产生具有杀草
活性的天然活性物质 ———毒素 ,影响植物的正常生理
活动[ 6] 。百日草链格孢菌培养液对紫茎泽兰有致病效
果 ,证明其经次生代谢向环境释放了毒素物质。探究
该种毒素物质 ,以期从中找到天然源的环保型化学除
草剂之先导化合物(Lead compound),是天然产物利
用研究的一个热门领域 。为了弄清百日草链格孢菌产
生的具体毒素物质种类 、性质及分子结构 ,为微生物源
除草剂的开发做进一步的深入研究 ,作者对百日草链
格孢菌次生代谢产物进行了活性化合物的分离 、纯化 、
鉴定工作。
1　实验
1. 1　主要材料 、试剂和仪器
1. 1. 1　材料
百日草链格孢菌粗毒素的制备方法:百日草链格
孢菌按本实验确定的培养条件培养 5 d后制得无菌滤
液 ,通过大孔树脂吸附并用酒精洗脱 、减压浓缩剩下毒
素水溶液后 ,再用等体积乙酸乙酯萃取 3次 ,合并乙酸
乙酯相 ,用一层 15 cm×15 cm中速定性滤纸过滤并用
无水硫酸钠除去其中水分 ,常压蒸馏回收乙酸乙酯 ,得
粗毒素50 mL 。反复进行毒素积累。温室培养的成株
紫茎泽兰。
1. 1. 2　试剂
石油醚 、甲醇 、氯仿 、苯 、冰乙酸 、丙酮 、乙酸乙酯 、
乙醇和二甲亚砜皆为国产分析纯 ,经二次重蒸备用;自
配三氯化铁 、碘化铋钾和茚三酮试液;碘;层析用硅胶
(100 ～ 200目 ,上海五四化学试剂厂);薄层层析硅胶
G(F254)(化学纯 ,青岛海洋化工有限公司);羧甲基纤
维素钠 。
1. 1. 3　仪器
DRX 500MHz超导核磁共振仪;Finigen 2000 型
质谱仪(EI-MS);X-射线仪;岛津制备型 HPLC ,紫外
检测器 。
1. 2　方法
1. 2. 1　接种方法
采用离体叶片针刺法[ 7 , 8] ,在同一叶片上接种不
同处理 ,不同叶片进行重复 ,将接种过无菌滤液或粗毒
素的植物离体叶片于 25℃、L ∶D =12∶12 条件下的
光照培养箱中培养 2 d后 ,置解剖镜下 ,测定病斑直径
大小。
1. 2. 2　经典柱色谱(CC)
采用湿法装柱 、干法上样。按极性由弱到强的顺
序用不同的溶剂系统不连续梯度洗脱 。每100 mL收
集 1次 ,常压浓缩后用水稀释一定的倍数检测生物活
性 ,有活性部位依预知检测硅胶板上的展开情况合并 ,
李荣金等:百日草链格孢菌除草活性物的分离 、纯化与结构鉴定 /2006 年第 3 期60　
备下一次的硅胶柱层析分离 。
1. 2. 3　T LC 制备板与检测板
将柱层析得到的活性部位混合物用适量乙酸乙酯
溶解 ,利用四片大载玻片制成的槽型器在 TLC 制备板
基部 1. 5 ～ 2 cm处进行上样形成均匀线形 ,用展开剂
展开 ,分别刮下装柱 ,用乙酸乙酯或乙醇洗脱。对洗脱
液进行活性跟踪 ,再对具有活性的部位进行第二次层
析 ,使用极性较之上次为小展开剂 ,刮下装柱并洗脱 。
跟踪活性物质 ,多次反复制备。
检测板用毛细管进行点样 ,不同极性梯度的溶剂
进行展开 ,观察分离状况 ,使用最佳的溶剂体系进行薄
层制备;同时也可观察纯度水平 。
1. 2. 4　制备型高效液相色谱
岛津制备型 HPLC(PRC-OPS),紫外检测器 ,溶
剂为甲醇与乙酸乙酯的混合液。分不同的先后顺序进
行分段回收 ,并检测毒性。
1. 3　化学结构鉴定
以上工作的整个流程图如下:
图 1　毒素的分离 、纯化流程图
Fig. 1　Separation and purification procedure of crude toxin
2　结果与分析
2. 1　物质分离
2. 1. 1　经典柱色谱
共进行 3次柱层析 ,利用针刺法进行活性跟踪 ,收
集于不同瓶号中并浓缩。3次过柱情况流程如图 2所
示。
图 2　经典色谱流程图
Fig. 2　Classic chromatography flow chart
2. 1. 2　毒素分布
(1)毒素分布定性
按照上述实验方法根据柱中物质色带变化以及生
物活性物质的动态变化 ,对洗脱液进行分段收集浓缩
并合并 。总的说来 ,开始与结尾能够去除一些没有或
者只有少量活性的杂质成分 。收集较强的活性段并浓
缩 。第一次过柱根据色谱带颜色及活性变化分布收集
12个不同部位 ,其中 5 、6 、7 部分具有强毒性 , 2 、3 与
10 、11 、12具有一定毒性 。把毒性强的5 、6 、7部分合并
后继续进行过柱分离 ,分 7个不同部位进行收集 ,将毒
性强的 3 、4 、5进行合并并继续第三次过柱 ,每50 mL
分步收集 ,29 ～ 36毒性强 ,40 ～ 45有一定活性。
(2)毒素分布定量
收集的瓶号表明了柱中色带分布情况 ,一般把一个
色带合并为一个大瓶号 。毒素一般定量分布在极性中
李荣金等:百日草链格孢菌除草活性物的分离 、纯化与结构鉴定 /2006 年第 3 期 61　
等的溶剂体系[乙酸乙酯∶石油醚为5∶(3 ～ 6)]中。
2. 1. 3　T LC 薄板层析
利用薄板层析 ,结合薄板检测技术 ,不断变换溶剂
体系 ,反复跑板 ,将活性部位进行进一步分离纯化 ,收
集得到 2个活性位点。
2. 1. 4　制备型高效液相色谱
利用 HPLC得到结晶状白色固体物质 ,经过活性
测定 ,其在 400 ×10 - 6浓度下48 h能够使紫茎泽兰致
病病斑直径达到 1. 6 ～ 2. 0 mm 。T LC(乙醇∶乙酸乙
酯 ,1∶50)R f :0. 56。
2. 2　化学结构的初步鉴定
2. 2. 1　质谱(图 3)
图 3　毒素物质MS分析
Fig. 3　MS analysis of toxin substance
质谱是 EI 模式 , 281([ M +1] +)是分子离子峰 ,
263. 1是脱掉一个 H 2O 的碎片峰 , 245. 1是失去 2 个
H 2O 的碎片峰 。天然产物通常用 EI 模式为佳 ,因为
时常可以根据碎片峰推测结构。但此模式分子离子峰
较弱 ,有时完全看不见 ,聚集体的峰更看不见 ,所以质
谱中 300以上就看不见任何峰了。因此 ,从质谱可以
确定其分子量为 280。
2. 2. 2　X-射线模型
根据软件做出的分子结构模式图(如图 4),结合
质谱分子量的信息 、1HNMR信息看 ,样品纯度已经非
常好 ,氢谱上表明有 48个 H ,把化学位移于 3的那些
峰都当亚甲基了 ,定标时定义其中一个峰为 2个 H ,其
实却是一个 H 。对 X-射线衍射数据以及结构模型进
行分析 ,确定该物质分子式为:C16H24O 4 。
图 4　毒素物质分子模型(Mecury 1. 0)
Fig. 4　Molecular model of toxin substance(Mecury 1. 0)
其分子结构式见图 5 ,该物质的名称为:2 , 15-di-
hydroxy-7-methy l-6-oxabicyclo [ 11. 3. 0] hexadeca-3 ,
11-dien-5-one ,化学结构为 Brefeldin(BFA)。
图 5　毒素物质分子结构式
Fig. 5　Molecular structure of toxin substance
2. 2. 3　核磁共振谱
EIMS(电子轰击质谱)显示其分子量为 280 ,分子
式为 C16 H24 O 4 , 由此可以推导出其不饱和度为
5。1HNMR观察到由于 2个相关反式二取代烯基上烯
氢(H-2 ,H-3)的存在而导致 δ5. 83与 δ7. 34 处产生
双二重峰的现象。而且 H-3 在同核相关谱中还与
δ3. 98处的双二重峰的其中一组双峰相关 ,该组信号
归属于相邻羟基叔碳上的偕质子 H 。按顺序后者还
与δ1. 83处的两个相邻脂肪族叔碳质子上所连质子之
一 H-5的复杂信号相关。 H-9同样在 δ2. 29 处作为
一个复杂系统发生共振 ,并与δ5. 23处归属于另一个
反式二取代双键上的 H-10的双二重峰信号相关 。另一
个烯 H(H-11)在δ5. 66处作为一个与δ2. 00与 δ1. 69
处多重峰(该二信号归属于邻近 12位亚甲基上的二氢)
相关的双二重峰中的重峰产生共振。从这些结果可以
假设存在2个一边骈合的环。实际上 , δ2.12与 δ0. 87
之间存在其它 4个脂肪族 CH2 基团的多重峰 ,同时在δ
4. 22与 δ4. 79(H-7与 H-15)处出现 2个含氧叔碳上的
偕质子 dq(双四重峰)峰的二重裂分以及复杂信号 ,后者
亦同δ1. 21处出 d(四重峰)峰的 CH3 基团相关。
3　讨论
采用液体发酵生产的百日草链格孢菌粗毒素经 3
次硅胶柱层析和 TLC 与 HPLC 反复制备得到毒素的
化合物单体。柱层析和薄层层析都采用了常用的硅胶
作吸附剂 ,达到了较好的分离效果 。柱层析的繁琐性
表明了粗提毒素中物质的复杂性 ,但特定极性的洗脱
剂(第 1次柱层析石油醚∶乙酸乙酯=3∶5 或 3∶1 ,
第 3次柱层析石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)可以将目的
物质选择性地洗脱下来 。进一步提高溶剂系统的极性
得到的物质是没有生物活性的。
百日草链格孢菌毒素化学结构鉴定按照常规有机
化合物鉴定方法进行。首先利用质谱分析(EI模式),
李荣金等:百日草链格孢菌除草活性物的分离 、纯化与结构鉴定 /2006 年第 3 期62　
着重低分子量区域的扫描结果得到分子量的信息为
281(M +1),然后利用 X-射线衍射法进行分子结构信
息的进一步精确分析 ,得到物质晶体结构的信息并将
其与软件结合得到直观的分子结构模型。最后利用核
磁获取该物质的特征谱图信息 ,对该毒素化学结构进
行最终确定。
组合化学与生物技术能极大地提高以 Brefeldin
为合成前体的化学修饰的运用 ,参与大环内酯合成的
微生物基因簇已经成功实施[ 9] 。Brefeldin 的提取鉴
定为后期开发提供了可选先导化合物 ,且作为大环内
酯的化合物 , Brefeldin具有直接利用微生物基因簇参
与合成的优势 ,为后期开发提供了条件。
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Study on the Extraction 、Purification and Identification
of Phytotoxin of Alternaria Zinniae
LI Rong-jin , QIANG Sheng
(Department o f Botany , College of L i fe S cience , Nanj ing Agricultural Universi ty , Nanj ing 210095 , China)
Abstract:Through three times of classic silica g el co lumniation chromatog raphie s , seve ral times of TLC
and HPLC , the phyto tox in monomer w hich could cause disease to Eupatoriun adenophorum was prepared. The
st ructure o f the phy totoxin of Alternaria zinniae was identif ied by the conventional o rganic compound analy sis
techniques. MS , NMR , X-ray we re applied to determine the exact st ructure o f the to xin and then , it s visual mo-
lecular st ructure model w as obtained by the so f tw are. Toxins molecular w eight w as 280 and its chemical st ruc-
ture w as concluded to be Brefeldin (BFA).
Keywords:Alternaria zinniae ;toxin;puri ficat ion;identification;X-ray
(上接第 45页)
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Studies on Preparation of Sulfated Derivatives of Lentinan
YAN Hang1 , ZHONG Yao-guang1 , 2 , WANG Shu-qin2 , LIU Chang-jiang2
(1. Col lege o f B iolog y and Food Technolog y , Dalian Insti tute of L ight I nd ustry , Dalian 116034 , China;
2. Col lege o f Food S cience ,Shenyang Agricutural Univ ersity , S henyang 110161 , China)
Abstract:Sulfat ion of lentinan from frui tbody of lentinus edodes wi th sulfuric acid o r sulfur t rioxide-pyri-
dine or chl rosulfonic acid-py ridine we re compared , and chlrosulfonic acid-py ridine w as determined as the best
sulfating agent. For the method of chlrosulfonic acid-pyridine , experimental resul ts show ed the opt imum reac-
tion condi tions as fo llowing :the ratio of chlo sulfonic acid to py ridine w as 1∶(2 ～ 4), the react ion t ime w as 2 ～
4 h and the react ion temperature w as 30 ～ 60℃.
Keywords:lentinan;sulfation;facto rs