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滇藁本中黄酮类化合物的提取工艺



全 文 :*基金项目:国家民委-教育部重点实验室开放基金项目(NO:MJY090103;MJY080106);云南民族大学化生学院大学生创新实验
项目(NO:2009HSCX09)
 作者简介:段利平(1963~),女,高级实验师,研究方向:应用化学。
△通讯作者:白红丽(1962~),女,高级讲师,主要从事预防医学教学与研究。Email:baihongli@ynni.edu.cn
·实验研究·
滇藁本中黄酮类化合物的提取工艺*
段利平,刘记言,刘学娟,杨德娥,朱云勇,白红丽△
(云南民族大学 国家民委-教育部民族药资源化学重点实验室,云南 昆明 650031)
  摘 要:目的:研究彝药滇藁本总黄酮的最佳提取工艺。
方法:以槲皮素为对照品,HPLC测定的槲皮素含量和总固体
物收率为指标,考察提取方法加醇量、提取时间、乙醇浓度对
滇藁本总黄酮提取率的影响。结果:加醇量、提取时间、乙醇
浓度对滇藁本药材粗粉的槲皮素含量和总固体物收率都有显
著的影响,而提取时间影响最显著。最佳提取工艺为药材与
70%乙醇按照1:8(g/mL)的比例,75℃回流提取3h。结论:
本实验优选出了滇藁本中黄酮的最佳提取工艺,为滇藁本中
黄酮类化合物的进一步研究提供依据。
关键词:滇藁本;黄酮类;正交实验;高效液相法
中图分类号:R284.2 文献标识码:A
文章编号:1007-2349(2012)01-0053-03
彝药 滇 藁 本 为 伞 形 科 滇 芹 属 (Sinodielsiayunnanensis
Wolff),别名岩林、岩前胡,产自云南中部和西部,始载于《滇南
本草》,治头风疼痛,止诸头疼,明目[1]。彝族主要用于偏头痛,
肾盂肾炎,呼吸道感染等症[2]。初步研究表明,滇藁本能减缓
血细胞凝聚。为了更好的挖掘利用民族药资源,最大限度的提
取其中的有效成分,笔者对滇藁本进行了醇提工艺的研究,建
立了滇藁本中总黄酮类化合物的高效液相色谱测定方法。
1 材料与方法
1.1 药 材、仪器及试剂 药材:滇藁本采自红河哈尼族彝族
自治州泸西县,经鉴定为伞形科滇芹属(Sinodielsiayunnanen-
sis Wolff)的根部,粉碎过40目筛,干燥保存。试剂:盐甲醇
(色谱纯);槲皮素(对照品,中国药品生物制品检定所);去离
子水。仪器:Agilent1100型高效液相色谱仪、Zorba/sb-C18
色谱柱(150.0mm×4.6mm,5μm)、紫外检测器、自动进样
器、在线真空脱气机、智能化柱温箱及 Agilent化学工作站、
R-114型旋转蒸发仪(BüchI)、电热恒温水浴锅、CQX25-06
超声波清洗器、AE100型电子天平。
1.2 方法和结果
1.2.1 黄酮类检测 取滇藁本药材粗粉10g,加甲醇70mL,
置水浴中回流10min,趁热过滤。取滤液2滴于滤纸上,加
10%三氯化铝乙醇溶液2滴,挥干,置荧光灯下观察,有荧光
产生。
1.2.2 提取工艺条件的确定 采用正交试验来确定滇藁本
中黄酮类化合物最佳提取工艺条件。以总黄酮的提取率为评
价指标,乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取方法(C)、提取时间
(D)为考察的4个因素,每个因素各取3个水平(表1),选用
L9(34)正交表进行试验(表2)。取药材每份50g,提取液过
滤、减压蒸馏浓缩浸膏,再定容至50mL容量瓶中,作为供试
液备用。测定前充分摇匀。按正交试验设计要求试验。
表1 因素水平表
水平
因素

醇浓度/%

醇体积/L

提取温度/℃

提取时间/h
1  60  8  75  7
2  70  6  50  5
3  80  4  20  3
表2 正交试验设计表及结果
No. A  B  C  D  Quercetin content
1  1  1  1  1  4.126
2  1  2  2  2  0.310
3  1  3  3  3  1.789
4  2  1  2  3  3.825
5  2  2  3  1  1.733
6  2  3  1  2  0.114
7  3  1  3  2  3.862
8  3  2  1  3  7.923
9  3  3  2  1  4.621
K1 6.225  11.813 12.163  10.48 T=28.303
K2 5.672  9.966  8.756  4.286 CT=89.0066
K3 16.406  6.524  7.384  13.537
K1/3  2.075  3.938  4.054  2.919
K2/3  1.891  3.322  2.919  1.429
K3/3  5.469  2.175  2.461  4.512
R  3.578  1.763  1.593  3.083
   T为各值的总和,CT为总和的平方除以实验次数
1.2.3 结果方差分析 对正交试验结果进行方差分析,由滇
藁本药材粗粉中槲皮素含量的直观分析结果可知,各因素对
实验结果的影响程度为 A>D>B>C,所得最佳提取工艺为
A3B1C1D3。由方差分析可知,提取方法、加醇量、提取时间、
乙醇浓度对滇藁本药材粗粉的槲皮素含量和总固体物收率都
352012年第33卷第1期          云 南 中 医 中 药 杂 志
DOI:10.16254/j.cnki.53-1120/r.2012.01.033
有显著的影响,但提取时间影响最显著,确定最佳提取工艺为
A3B1C1D3。即加 8 倍 量 的 70% 乙 醇,热 回 流 提 取 3h。
F1-0.05(2,2)=19.0,F1-0.01(2,2)=99.0,F1-0.10(2,2)=9.00。
2 实验内容
2.1 对照品贮备液的制备 取干燥至恒重的对照品,精密称
定,置25mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对
照品储备液。
2.2 供试品溶液的制备 取样品约5mL,用20mL甲醇于
超声波浴中提取30min,过滤后滤液加入20mL 1.5mol/L
盐酸于水浴上回流水解3h,冷却后用甲醇定容至50mL量瓶
中,该样液过0.5μm膜,滤液进 HPLC分析。
2.3 测定波长的选择与色谱条件 色谱条件 固定相:Zorba/
sb-C18色谱柱(150.0mm ×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-
0.1%磷酸(50∶50);流速:1 0μL/min;检测波长:371nm;柱
温:20℃。分离度符合要求。测定波长的选择 使用 HPLC在
线扫描槲皮素的对照品紫外光谱图中(以流动相为溶剂),最大
吸收波长为371nm(见图1)。根据实验结果,为使成分的色谱
峰相匹配,本实验中选择371nm为测定波长。
图1 HPLC在线扫描槲皮素对照品紫外光谱图
2.4 系统适用性试验 分别吸取供试品及对照品溶液,注入
色谱仪,在上述色谱条件下进样,得 HPLC图谱(见图2(A、
B),分析得系统适用性实验结果。
图2(A) 槲皮素对照品的HPLC图谱
图2(B) 供试品的HPLC图谱
2.5 标准曲线及线性范围 线性关系考察 精密称取槲皮素
对照品2.9mg,置于25mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至
刻度,精密吸取1.0mL,置于10mL容量瓶中,加甲醇至刻
度,摇匀,即为槲皮素对照品贮备液;精密吸取以上贮备液,按
表1设计进样量进行 HPLC,测定色谱峰面积,以峰面积(A)
对对照品浓度(C)进行回归分析。测得槲皮素对照品的线性
回归方程为:y=32.151x+11.333,r=0.999 8。表明槲皮素
在0.046 4~0.162 4μg/mL范围内线性关系良好。
2.6 稳定性试验 在色谱条件下,取同一份滇藁本药材粗粉
的供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10h进样测定,结果槲皮素
峰面积值RSD=0.94%。表明在10h内样品溶液中的槲皮
素稳定。
2.7 精密度试验 精密吸取槲皮素对照品溶液10μL,连续
进样6次,测定峰面积值,计算 RSD=0.35%。
2.8 重复性试验 同一批号样品6份,按供试品溶液制备项
下方法制备并测定,结果槲皮素含量为的0.013 2%。
2.9 回收率试验 精密称取干燥至恒重的对照品适量,加入
溶剂制成回收率试验用对照品储备液。取已知槲皮素含量
(0.01585mg/mL)的样品6份,每份约0.65g,分别精密加入槲
皮素对照品溶液(0.0116mg/mL)1mL,按供试品溶液制备项下
方法制备并测定,结果平均回收率为96.44%,RSD为1.51%。
2.10 样品含量测定 取不同批号的样品数批,依测定条件,
制成供试品溶液,注入色谱仪,测定,记录并计算指标槲皮素
的含量。见表3。
表3 槲皮素含量测定
样品 峰面积 浓度/mg·mL-1
对照品 320.779 51  0.011 6
1  228.193 15  0.008 25
2  17.163 74  0.000 62
3  98.959 95  0.003 58
4  211.539 37  0.007 65
5  95.869 21  0.003 47
6  6.288 08  0.000 23
7  213.608 15  0.007 72
8  438.222 53  0.015 85
9  255.556 56  0.009 24
10  103.672 45  0.003 75
3 讨论
滇藁本药材粗粉中含多种黄酮类化合物,根据黄酮类化
合物在70%乙醇中具有良好溶解性的特点,我们在本实验中
选择70%乙醇作提取溶剂。
根据实验分析滇藁本药材粗粉中黄酮类化合物大多以糖
苷的形式存在,主要为槲皮素及苷、山柰素及苷等,直接测定
滇藁本药材粗粉中槲皮素的含量,发现其含量很低,并且直接
测定可能难以准确反映其中总黄酮的实际含量,因此本试验
采取酸水解后测定其槲皮素的含量,获得满意效果。
对于水解条件的选择,考察了不同盐酸浓度和酸水解时
间的影响。结果显示,用盐酸(1.5mol/L)-甲醇(1∶1)回流
3h,能使滇藁本药材粗粉中以槲皮素为苷元的黄酮苷水解完
全,盐酸的浓度不宜再高,酸性太强对进样阀和色谱柱的腐蚀
45 云 南 中 医 中 药 杂 志          2012年第33卷第1期

    
作用较大。色谱条件摸索时,发现流动相的pH 值对色谱峰
的峰形及分离度影响很大,比较甲醇与不同浓度的磷酸溶液
等多种溶剂系统,确定流动相为甲醇-0.1%磷酸(50∶50),
得到的色谱峰峰形尖锐,分离度高,且基线稳定。
参考文献:
[1]《滇南本草》整理组 .滇南本草[M].昆明:云南人民出版社,1978.
[2]江苏植物所 .新华本草纲要[M].上海:上海科技出版社,1988.
[3]HU Min,SKIBSTED L H.Antioxidative capacity of rhizome ex-
tract and rhizome knot extract of edible lotus (Nelumbo
nuficera)[J].Food Chem,2002,76:327~333.
[4]左爱华,韦群辉,曾元儿,等 .紫外可见分光光度法测定青刺尖总
黄酮含量[J].云南中医中药杂志,2008,(6):43~44.
(收稿日期:2011-11-02)
灯台树皮的鉴别研究
许文忠1,李 安2,田 琼2
(1.云南省耿马县人民医院药剂科,云南 耿马 677500;2.第四军医大学药学院药理教研室,陕西 西安 710038)
  摘 要:目的:建立灯台树的简便鉴定方法,为药材的安
全使用提供依据和保障。方法:采用硅胶G、硅胶GF254以及
分别以羧甲基纤维素钠和含4%的醋酸钠的羧甲基纤维素钠
为黏合剂的硅胶G板确定最恰当的薄层板,样品采取不同的
处理方法,在分离效果不同的展开剂系统中展开。结果:对照
药材溶液和供试品在同一硅胶G板上相应的位置显相同颜色
的斑点。结论:用薄层层析的方法可作为鉴别灯台树的方法
之一。
关键词:灯台树皮;薄层层析法;鉴别
中图分类号:R284.1 文献标识码:A
文章编号:1007-2349(2012)01-0055-03
灯台树(Alstonia scholaris)为夹竹桃科植物,主产云南的
西南部,以树皮、叶或嫩枝入药,是当地民间常用的植物药。
树皮含吲哚类生物碱:灯台碱(C22H29O4N2)、灯台定碱
(C2OH22O3N2)及非氮物质:灯台胶素、灯台蜡素(C30H48O2)、
灯台亭素(C32H5 3O2)等。其性味平、淡,有毒。具有退热作
用,对实验动物支气管炎有祛痰、平喘作用,并对动物肠道平
滑肌有解痉作用,可消炎、化痰止咳、止痛[1]。由于灯台树含
有多种生物药效成分[2~3],所以在民间历史上就一直用其根、
皮、叶来治疗头疼、伤风、肺炎、百日咳、慢性支气管炎,还可以
治外伤止血、接骨、消肿等[4]。市售的灯台树皮很难分辨真
伪,而灯台树碱的鉴定又难找到标准品,故笔者以灯台树叶对
照药材建立简便的鉴定方法,以辨真伪。参考文献报道,灯台
树含有较多的吲哚类生物碱,如灯台碱,灯台定碱,阿枯米辛
碱,阿枯米辛碱的氧化物等,除此之外还含有α-香树醇乙酸
酯、羽扇豆醇乙酸酯。还含有挥发油成分如柠檬醛、香叶醇、
柠檬烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯(linalylacetate)、α-蒎烯、异松油
烯、以及正-二十六烷、羽扇豆醇、β-香树脂、乌苏酸、软脂酸
等。本实验着重从吲哚类生物碱出发对本品进行定性研究。
1 材料与方法
1.1 实验材料 水为双蒸水,甲醇为色谱纯,苯、乙醇、丙酮、
丁酮、氯仿、异丙醇、乙酸乙酯均为分析纯。所获得的灯台树
皮由云南省耿马县采药人提供。经第四军医大学药物学家田
琼教授鉴定为夹竹桃科植物灯台树(Alstonia scholaris)的树
皮。灯台树叶对照药材购自成都市药检所。
1.2 实验方法
1.2.1 展开剂的选择 取本品粉末0.5g,加95%的乙醇
15mL,加热回流2h,放冷,转至超声波清洗机,超声20min,
滤过,滤液蒸干,加95%乙醇5mL溶解,作为供试品溶液。
另取对照药材0.5g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法
试验,吸取上述2种溶液各10μL,分别点于同一硅胶G薄层
板上,分别以不同的展开剂展开,取出,凉干,喷以10%硫酸乙
醇试液,在105℃下加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在
与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。
展开剂一:(乙酸乙酯-氯仿-甲醇=4∶4∶1)
展开剂二:(乙酸乙酯-乙醇-浓氨水=17∶2∶1)
展开剂三:(苯 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 异丙醇 - 浓氨
水=6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)
展开剂四:(乙酸乙酯-丁酮-甲酸=10∶6∶1)
展开剂五:(苯-甲醇=10∶7.5)
展开剂六:(丙酮-氯仿=5∶4)
展开剂七:(氯仿-甲醇=9∶1)
相互之间对比,分离效果依次按以下顺序增强:(乙酸乙
酯-氯仿-甲醇=4∶4∶1)<(乙酸乙酯-乙醇-浓氨水=
17∶2∶1)<(乙酸乙酯-丁酮-甲酸=10∶6∶1)<(丙酮-
氯仿=5∶4)<(苯-甲醇=10∶7.5)<(苯-乙酸乙酯-甲
醇-异丙醇-浓氨水=6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)<(氯仿-甲
醇=9∶1)。
1.2.2 薄层板的选择 分别称取本品粉末和对照药材各
0.5g,处理方法同前,照薄层色谱法(附录 VIB)试验,吸取供
试品溶液和对照药材溶液各10μL,点于不同的硅胶板上,以
(氯仿-甲醇=9:1)展开。凉干,喷以10%硫酸乙醇,检测。
薄层板一:以硅胶G为吸附剂,以0.5%的羧甲基纤维素
纳为粘合剂的硅胶板。展开剂:乙酸乙酯-氯仿-甲醇=4∶
4∶1,365nm下检测。
薄层板二:以氧化铝为吸附剂,采用干法铺板进行展开。
展开剂:乙酸乙酯-氯仿-甲醇=4∶4∶1,365nm下检测。
552012年第33卷第1期          云 南 中 医 中 药 杂 志
Yunnan Journal of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica
Vol.33.No.1 (General No.223) January,2012
Main Content
Study on Hemorheology of Recurrent Oral Ulcers Patients with Zhibai Dihuang Pils and Danshen Tablets
   ZHOU Ping………………………………………………………………………………………………………………………………………………
Clinical Effect of Gushukang Granules Combined with Alendronate Sodium on the Treatment of 35Osteoporosis Patients
   REN Xiao-juan……………………………………………………………………………………………………………………………………………
Extraction Process for Flavonoids in Yunnan Ligusticum
   DUAN Li-ping,LIU Ji-yan,LIU Xue-juan,et al……………………………………………………………………………………………………
Survival Impact of Taohongsiwu Decoction on the Random Flap on the Back of Rats
   LIU Wang-hua,ZENG Fei,ZHAO Hai-xia……………………………………………………………………………………………………………
Study on Hemorheology of Recurrent Oral Ulcers Patients with Zhibai Dihuang Pils and Danshen Tablets
ZHOU Ping
(School of Traditional Chinese Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing,401331)
Abstract:Objective:To study the hemorheological effect of recurrent oral ulcers patients(ROU)with Zhibai Dihuang pils and Danshen tablets
and to analyze the relation between its change and its effect.Methods:Hemorheological tests of 88ROU patients were respectively made before and
after the treatment and the results were compared and analyzed to observe the treatment effect.Results:After the treatment,the patients’whole
blood viscosity (high shear and low shear),plasma viscosity,platelet aggregation,erythrocyte aggregation index,fibrinogen,erythrocyte
sedimentation rate were very significantly decreased(P<0.05or P<0.01),but Hematocrit did not change significantly compared with the pre-
treatment(P>0.05).Conclusion:The integration of Zhibai Dihuang pils and Danshen tablets can significantly lower the blood rheology of the
ROU patients and increase the levels of many indicators of the blood rheology and improve their microcirculation to achieve the therapeutic effect.
Key words:recurrent oral ulcers;Zhibai Dihuang pils;Danshen tablets;rheology
Clinical Effect of Gushukang Granules Combined with Alendronate Sodium on the Treatment of 35Osteoporosis Patients
REN Xiao-juan
(Urumqi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Urumqi,Xinjiang,830000)
Abstract:Objective:To observe the effect of Gushukang granules combined with alendronate sodium (Fosamax)on the treatment of
osteoporosis patients with spleen and kidney deficiency and blood stasis.Methods:65patients were randomly divided into one treatment group and
one control group.35patients in the treatment group were treated with Gushukang granules combined alendronate sodium (Fosamax)while 30
patients in the control group were only treated with alendronate sodium.After 8-week treatment,the lumbar spine(L2-L4)and bone conditions
(BMD)of the patients in the two groups were detected by visual analog scales(VAS)for pain rating as wel as liver and kidney test.Results:The
lumbar spine(L2-L4)and the bone conditions(BMD)of the treatment group became better than that of the control group after the treatment(P
<0.05).VAS pain score of the treatment group was significantly lower than that of the control group(P<0.05).The liver and kidney function of
the treatment group and the control group showed no significant change.Conclusion:Gushukang granules combined with alendronate sodium can
significantly improve the lumbar spine(L2-L4)and the bone conditions(BMD)of the patients and reduced their pain and does not affect the liver
and kidney function,with good efficacy and safety
Key words:osteoporosis;Gushukang granules;alendronate sodium;bone density;VAS
Extraction Process for Flavonoids in Yunnan Ligusticum
DUAN Li-ping,LIU Ji-yan,LIU Xue-juan,et al.
(Key Laboratory of National Pharmaceutical Resource Chemistry of State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education,Yunnan University of
Nationalities,Kunming,Yunnan,650031)
Abstract:Objective:To study the best extraction process for flavonoids in Yunnan Ligusticum.Methods:Taking quercetin as reference
substance and the quercetin content determined by HPLC and its total solids yield as indicators,observations were made to study the extraction
method,the amount of increasing alcohol,the extraction time and the impact of ethanol concentration on the total extraction rate of the flavonoids
in Yunnan Ligusticum.Results:The amount of increasing alcohol,the extraction time and the ethanol concentration have a significant impact on the
quercetin content in Ligusticum medicine meal and the total solids yield whereas the extraction time have the most significant impact.The best
extraction process was that the ratio of herbs and 70%of ethanol was by 1:8(g/mL),with a back extraction 3hat 75℃.Conclusion:The best
extraction process for the flavonoids in Yunnan Ligusticum from the experiment provides a basis for further research.Key words:Yunnan
Ligusticum;flavonoids;orthogonal;HPLC
Survival Impact of Taohongsiwu Decoction on the Random Flap on the Back of Rats
LIU Wang-hua,ZENG Fei,ZHAO Hai-xia
(Nanchong Health School,Nanchong,Sichuan,637000)
Abstract:Objective:To investigate the survival impact of Taohongsiwu decoction on the random flap on the back of SD rats.Methods:40SD
rats were randomly divided into one Taohongsiwu decoction group and one control group.The backs of theses rats were made with 2cm ×8cm
random flap to detect the rate of flap survival and microvascular density(MVD)respectively.Results:The flap survival rate of Taohongsiwu
decoction group in 7dwas higher than that of the control group(P<0.05).More new blood vessels were seen within the flap of the Taohongsiwu
decoction group.The unit MVD under high-power field was higher than that of the control group(P<0.05).Conclusion:The oral administration
of Taohongsiwu decoction can promote the survival ratio of the random flap on the backs of the rats,and its mechanism may have relation with the
flap angiogenesis.
Key words:Taohongsiwu decoction;random flap;survival