全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(3): 389398 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31571650)和西北农林科技大学唐仲英育种基金资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31571650) and the Tang Zhong-Ying Breeding Fund of the
Northwest A&F University.
* 通讯作者(Corresponding author): 陈新宏, E-mail: cxh2089@126.com, Tel: 029-87082854
第一作者联系方式: E-mail: helingzhi123@126.com, Tel: 18285549260
Received(收稿日期): 2015-07-22; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(网络出版日期): 2015-12-18.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151218.0915.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00389
大赖草 6-SFT 基因的克隆及其转基因烟草抗旱和抗寒性分析
贺晓岚 1 王建伟 2 李文旭 3 陈真真 1 赵继新 1 武 军 1 王中华 1
陈新宏 1,*
1 西北农林科技大学农学院 / 陕西省植物遗传工程育种重点实验室, 陕西杨凌 712100; 2 凯里学院环境与生命科学学院, 贵州凯里
556011; 3 河南省农业科学院小麦研究所, 河南郑州 450002
摘 要: 果聚糖合成酶(6-SFT)在植物抵御逆境胁迫中起重要作用。利用 RACE 结合 RT-PCR 技术从大赖草(Leymus
racemosus, 2n = 4x = 28, NsNsXmXm)中克隆到 6-SFT基因, 其完整开放阅读框为 1863 bp。该基因被命名为 Lr-6-SFT
(GenBank 登录号 KT387273), 编码 620 个氨基酸, 其推导氨基酸序列含有保守的果糖基转移酶结构域。氨基酸序列
比对及进化树分析表明, 大赖草 6-SFT 与华山新麦草、普通小麦、西尔斯山羊草和大麦 6-SFT 具有高度相似性。采
用基因重组技术构建 p1300-35SN-Lr-6-SFT 表达载体, 利用农杆菌介导法将该载体转入烟草品种 W38 中。对经过抗
性筛选、PCR和 RT-PCR验证的转基因植株进行抗旱和抗寒性鉴定, 发现转基因植株与对照相比, 抗旱和抗寒性明显
增强; 在逆境胁迫条件下, 转基因植株的果聚糖、可溶性糖、脯氨酸含量都显著高于对照, 而丙二醛的含量显著低于
对照。本研究表明, Lr-6-SFT基因是典型的 GH32家族成员, 其表达能够提高烟草对干旱和寒冷胁迫的抗性。
关键词: 6-SFT基因; 干旱; 寒冷; 大赖草; 生理指标; 转基因烟草
Cloning of 6-SFT Gene from Leymus racemosus and Analysis of Tolerance to
Drought and Cold Stresses in Transgenic Tobacco
HE Xiao-Lan1, WANG Jian-Wei2, LI Wen-Xu3, CHEN Zhen-Zhen1, ZHAO Ji-Xin1, WU Jun1, WANG
Zhong-Hua1, and CHEN Xin-Hong1,*
1 Shaanxi Provincial Key Laboratory of Plant Genetic Engineering Breeding / College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100,
China; 2 College of Environment and Life Science, Kaili University, Kaili 556011, China; 3 Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural
Sciences, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The fructan biosynthesis enzyme (6-SFT) plays an important role in plant in response to abiotic stresses. In this study, a
full-length cDNA encoding sucrose:fructan-6-fructosyltransferase, designated as Lr-6-SFT (GenBank accession No. KT387273),
was cloned from Leymus racemosus (2n = 4x = 28, NsNsXmXm) using reverse transcriptase PCR (RT-PCR) and rapid-
amplification of cDNA ends (RACE) techniques. The full-length open reading frame comprises 1863 bp and encodes 620 amino
acids. The predicted protein structure of the gene contains a conserved fructosyltransferase domain. Multiple sequence alignment
and phylogenetic analysis showed that the Lr-6-SFT protein shared high similarity with 6-SFT proteins from Psathyrostachys
huashanica, Triticum aestivum, Aegilops searsii, and Hordeum vulgare subsp. vulgare. The Lr-6-SFT gene was transferred into
tobacco (Nicotiana tabacum L. cv. W38) via Agrobacterium-mediated transformation. The screened plants were tested by PCR
and RT-PCR, and the transgenic tobacco plants exhibited much higher tolerance to drought and cold compared with the
non-transgenic plants. Under drought and cold stresses, the Lr-6-SFT expressions were associated with the increased accumulation
of stored carbohydrate and proline and the decreased malondialdehyde storage. These results suggest that Lr-6-SFT is a typical
member of the glycoside hydrolase 32 (GH32) family and may be linked to enhanced tolerance to drought and cold stresses.
Keywords: 6-SFT gene; Drought; Freezing; Leymus racemosus; Physiological indices; Transgenic tobacco
390 作 物 学 报 第 42卷


果聚糖是以果糖为基本单位, 由蔗糖与一个或
多个果糖基连接而成的聚合物 [1], 广泛分布在各种
生物有机体中。果聚糖是 15%的被子植物和冷季型
牧草的主要储存性碳水化合物[2]。积累果聚糖的植
物主要分布在干旱和寒冷地区, 在热带或水生环境
中分布较少[2]。在植物体内果聚糖主要积累在液泡
中[3]。果聚糖不仅是重要的储存性碳水化合物, 也是
一种重要的渗透调节物质。此外, 果聚糖含量的增
加能防止膜相变 , 进而起到稳定膜系统的作用 [4],
在植物适应干旱、低温和高盐等非生物逆境过程中
起着重要的作用[5]。在高等植物中, 以蔗糖为底物进
行果聚糖的合成, 有 4 种不同的果糖基转移酶参与
果聚糖的合成 [6], 其中 sucrose:fructan 6-fructosyl-
transferase (6-SFT)是合成果聚糖的关键酶 [7]。自
1995 年 Sprenger 等[7]首次从大麦中发现并克隆到
6-SFT 基因以来, 已经从多种植物中分离克隆该基
因, 并且对其进行遗传转化和功能验证研究, 如冰
草[8]、小麦[9]、猫尾草[10]、雀麦草[11]、华山新麦草[12]
等。虽然 6-SFT 基因在进化上比较活跃 [13], 但是,
SDPNG、FRDP和 WECIDF活性结构域是高度保守
的[11]。大量研究表明, 6-SFT能够增强植物对干旱[5]
和寒冷[11,14]等逆境胁迫的耐受能力; 在非果聚糖植物
中, 6-SFT基因的表达使得转基因植株积累果聚糖[5,15]。
在转 6-SFT 基因的植株中, 随着果聚糖含量的增加,
可溶性糖含量也增加了[5,16-17]。Knipp 和 Honermeier[18]
研究发现, 转果聚糖酶基因的植株中, 果聚糖的积
累对脯氨酸的含量具有多向性效应。还有研究证明,
转 6-SFT 基因的植株中果聚糖的积累增强了转基因
植株抗氧化胁迫的能力, 转基因植株丙二醛含量显
著低于对照植株[15]。在逆境胁迫条件下, 可溶性糖
和脯氨酸等渗透调节物质的积累有利于增强植物对
非生物逆境胁迫的抵抗能力[19-20]。因此, 植物体内
果聚糖含量的增加对其抗旱抗寒性的提高具有重要
意义。
果聚糖的聚合度具有物种特异性[21]。在冷季型
草中, 果聚糖低聚物的数量[22]和结构[23]差异很大。
6-SFT基因在进化上比较活跃, 因此, 从不同物种中
分离获取该基因的序列信息有助于分析它们之间的
分子关系, 并有助于阐明不同物种同源基因之间的
进化关系 [8]; 同时 , 将这些基因导入植物中可能会
提高植物的抗逆性。大赖草(Leymus racemosus, 2n =
4x = 28, NsNsXmXm)又称巨大冰麦草, 大穗滨麦草,
属于禾本科小麦族赖草属, 为多年生草本植物, 具
有大穗、多花、抗旱、抗寒、耐盐和抗多种病害等
优良性状[24]。该物种分布广泛, 从中亚到东欧都有
分布, 在海岸、沙丘和沙漠中最为常见。前人已成
功地将来源于细菌[25]、真菌[26]及植物[7]的果聚糖合
成酶关键基因转入非果聚糖植物中, 对果聚糖的代谢
及积累效应进行研究, 并且开展了抗旱[25]、抗寒[15]、
抗盐 [5]及抗氧化胁迫 [15]的研究。但是, 有关大赖草
6-SFT 基因在干旱和寒冷胁迫抗性中的作用及其转
基因植株在逆境胁迫下的生理生化反应的研究尚未
见报道。本研究从大赖草中克隆 6-SFT 基因, 转化
烟草, 通过干旱和寒冷胁迫处理, 旨在了解 Lr-6-SFT
在干旱和寒冷胁迫下的作用, 以证明转基因烟草是
否通过表达 6-SFT基因而增强其抗旱和抗寒性。
1 材料与方法
1.1 大赖草果聚糖合成酶基因 Lr-6-SFT的克隆
1.1.1 cDNA 中间保守区的克隆和序列测定 大
赖草(Leymus racemosus, 2n = 4x = 28, NsNsXmXm)
种植于西北农林科技大学试验地(陕西杨凌), 利用
总 RNA 提取试剂盒 RNeasy Plant Minikit (Qiagen,
Germany)提取大赖草叶片总 RNA。使用 SuperScript
III Reverse Transcriptase cDNA 第 1 链合成试剂盒
(Invitrogen)合成 cDNA 第 1 链。参照小麦、西尔斯
山羊草、大麦、冰草、雀麦、梯牧草、偏生早熟禾、
草地早熟禾、毒麦和黑麦草 10种植物的 6-SFT蛋白
氨基酸保守区序列设计 1对简并引物, 选用 LA Taq
(TaKaRa)扩增大赖草 6-SFT 基因的 cDNA 中间保守
区。简并引物序列 , DPsen 为 5′-AAYGARATGYT
NCARTGG-3′, DPantisen 为 5′-NCCRTCNARNACN
GGNAC-3′, N=AcgT; Y=CT; R=Ag。反应程序为
94C预变性 3 min; 94C变性 30 s, 55C退火 30 s,
72C延伸 2 min, 35个循环; 72C延伸 10 min。PCR
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化目的片段 ,
目的片段与 pMD19-T载体(大连 TaKaRa)连接, 转化
至大肠杆菌 E. coli DH5α感受态细胞, 将菌落 PCR
和质粒单双酶切鉴定正确的 5 个重组质粒送生工生
物工程(上海)有限公司测序。
1.1.2 Lr-6-SFT 基因 3端和 5端序列的克隆 按
照 3-Full RACE Core Set Ver.2.0 试剂盒和 5-Full
RACE Kit 试剂盒(TaKaRa)说明书分别克隆大赖草
Lr-6-SFT 基因 cDNA 的 3端和 5′端序列, 特异引物
序列为 GSOP3-Lr3: 5′-TGAGGCTGATGTGGGCTA
T-3′, GSIP3-Lr3: 5′-CCTCGTCCTCGCTGCTGG
TA-3′; GSOP5-Lr3: 5′-GGTGACCAGATGACGGG
ATT-3′, GSIP5-Lr3: 5′-TGCACTGGACCTCAACAG
第 3期 贺晓岚等: 大赖草 6-SFT基因的克隆及其转基因烟草抗旱和抗寒性分析 391


C-3′。大赖草叶片总 RNA提取和 PCR产物的克隆、
测序方法如前所述。
1.2 Lr-6-SFT 基因 cDNA 编码区的获得及其编
码产物序列分析
根据 5和 3-RACE 的结果, 并参考小麦 6-SFT
基因 cDNA 序列设计克隆 Lr-6-SFT 基因的引物, 其
序列为 Lr-6-SFT-F: 5-TCACAATCTACCAAACTC
TCTTA-3; Lr-6-SFT-R: 5-CACTCTCCCAAACAAC
AATA-3, 通过 PCR 法扩增 Lr-6-SFT 基因编码区序
列, 并测序验证。
采用National Center for Biotechnology Information
(NCBI)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的在线工具
DNAMAN 4.0、MegAlign 软件和多序列比对程序
ClustalX2进行 cDNA序列 BLAST分析。采用 ExPasy
proteomics server (http://www.expasy.ch/tools/
dna.html)氨基酸翻译工具及 Conserved Domains 数
据库分析氨基酸序列的保守区域 ; 使用 NCBI 的
ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.
html)分析基因开放阅读框(ORF), 借助 ClustalX2 和
MEGA5.0软件构建系统进化树。
1.3 以农杆菌介导法转化烟草
1.3.1 表达载体的构建及转基因植株的培育 将
Lr-6-SFT 基因的完整编码区序列插入植物表达载体
p1300-35SN的Hind III–BamH I位点, 构建植物表达
载体 p1300-35SN-Lr-6-SFT (图 1), 通过测序确保
Lr-6-SFT 在载体中的插入方向及完整性。将重组质
粒 p1300-35SN-Lr-6-SFT 通过冻融法[27]转入农杆菌
GV3101(本实验室保存), 再利用叶盘法[28]转化烟草
W38, 最后将经过 10 mg L–1潮霉素筛选的抗性植株
移入温室培养。
1.3.2 转基因植株PCR扩增分析 采用CTAB法[29]
提取推定的转基因烟草叶片的基因组 DNA, 以其为
模板, 以 Lr-6-SFT-F (5-TCACAATCTACCAAAC
TCTCTTA-3)和 Lr-6-SFT-R (5-CACTCTCCCAAAC
AACAATA-3)为引物, 通过 PCR扩增法鉴定目的基
因在转基因植株基因组中的整合情况。PCR 反应条
件为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 60℃退火 30 s,
72℃延伸 2 min, 35个循环, 72℃延伸 10 min, 扩增
产物长度约 2175 bp, 经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.3.3 转基因植株 RT-PCR 分析 为了分析
Lr-6-SFT 基因在 RNA 水平的表达情况, 本研究对
PCR阳性转基因植株进行 Lr-6-SFT转录水平分析。
烟草总 RNA 的提取及 cDNA 第 1 链的合成方法同
1.1.1。以测试烟草的 cDNA 为模板 , 首先以烟草
actin 基因特异引物 (ActF: 5-TGGCATCATACCTT
TTACAA-3和 ActR: 5-TCCGGGCATCTGAACCTC
T-3)对各样本进行扩增, 根据扩增结果调整模板浓
度, 以使模板 cDNA 均一化。反应程序为 95℃预变
性 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环;
72℃延伸 10 min。然后用 Lr-6-SFT基因的特异引物
(Rp6-SFT-F: 5-CCGCTGTTGAGGTCCAGT-3, Rp6-
SFT-R: 5-TCTTCGCCGGATCATAGAA-3)进行半定
量 RT-PCR分析。Lr6-SFT基因检测的 RT-PCR反应
条件为 95℃预变性 3 min; 94℃ 45 s, 55℃ 35 s, 72
℃ 30 s, 35个循环; 72℃延伸 10 min, 重复 3次。
1.4 转基因烟草植株的表型分析
1.4.1 抗旱和抗冷性鉴定 参考 Bie 等[5]的方法
鉴定转基因植株的抗旱和抗冷性, 方法略有改动。
选用五、六叶期、大小及长势一致的烟草转基因植
株及对照(转空载体的植株)进行胁迫处理, 其中旱
胁迫处理为胁迫 35 d 后(最嫩叶片有明显萎蔫症状)
进行复水处理, 1周后观察其恢复生长情况; 冷胁迫
处理为 10℃、14 h光照/10 h黑暗、光照强度 25 µmol
m–2 s–1条件处理 10 d, 然后20℃处理 30 min, 室温
条件下培养 9 d, 观察植株生长状态。
1.4.2 相关生理指标测定 选择 RT-PCR 鉴定表
达量相对较高的 T0代转基因烟草植株, 采集逆境胁
迫前及干旱胁迫(20 d)或冷胁迫(10℃ 10 d, –20℃ 5
min)后 T0代转基因植株和对照植株叶片, 用蒽酮比
色法测定可溶性糖含量[30], 茚三酮法测定脯氨酸含
量[31], 植物丙二醛测定试剂盒(南京建成生物工程研
究所)测定丙二醛含量, 及 Plant Fructan Colorimetric
Assay Kit (GenMed Scientifics Inc., USA)测定果聚糖
含量。对每个处理的每个生理指标重复测定 4次。

图 1 植物表达载体 p1300-35SN-Lr-6-SFT 示意图
Fig. 1 Structure of transformation vector p1300-35SN-Lr-6-SFT used in the study
RB: T-DNA右边界; 35S: CaMV 35S poly A; p35S2: 含双增强子的 CaMV 35S启动子; p35S1: CaMV 35S启动子; Tnos: 终止子;
LB: T-DNA左边界。
RB: right border of T-DNA; 35S: CaMV 35S poly A; p35S2: CaMV 35S promoter with double enhancer sequences; p35S1: CaMV 35S
promoter; Tnos: nopaline synthase terminator; LB: left border of T-DNA.
392 作 物 学 报 第 42卷


1.4.3 统计分析 用 SAS V8.1 软件统计分析测
定数据, t 检验法比较均数(P<0.05), Originpro 2015
软件作图。
2 结果与分析
2.1 Lr-6-SFT基因的获得和序列分析
采用简并引物 PCR扩增和 RACE获得全长大赖
草 6-SFT基因, 其完整开放阅读框为 1863 bp, 编码
620 个氨基酸, 含有 6 个 N 端糖基化位点(Asn-Xaa-
Ser/Thr), 等电点为 5.11, 分子量预测为 68.6 kD。在
GenBank上进行 Blast检索, 发现该序列与普通小麦
的 6-SFT 基因序列相似性高达 92%。将该基因的推
导氨基酸序列与其他植物的同源序列比对显示 ,
Lr-6-SFT 存在 3个高度保守的结构域, 与其他植物
的 6-SFT一样, 在蔗糖结合框 S/NDPNG包含一个活
跃的天冬氨酸(D)残基, 在 WECID 保守区包含一个
谷氨酸(E)残基, 在 FRDP框包含一个天门冬氨酸(D)
残基(图 2)。Lr-6-SFT与华山新麦草、普通小麦、西
尔斯山羊草、大麦的 6-SFT 序列相似性很高, 在进
化树上聚为一类(图 3)。比较 Lr-6-SFT基因与华山新
麦草的 6-SFT, 发现序列相似性高达 97%, 大赖草的
6-SFT 除了插入 12 个连续的 CCGCCGCCGACG 核
苷酸外, 还存在一些单碱基变异, 但是这些变异均
属同义突变, 突变后仍然编码相同的氨基酸。在氨
基酸水平上, Lr-6-SFT 仅比华山新麦草 6-SFT 在 N
端多 4 个连续的 AAAD 氨基酸。因此, 克隆获得的
序列为推定的 6-SFT基因, 被命名为 Lr-6-SFT, 基因
登录号为 KT387273。
2.2 转 Lr-6-SFT烟草植株的获得与鉴定
通过农杆菌转化法获得转基因烟草 T0 代植株,
经潮霉素筛选后, 首先利用 Lr-6-SFT-F/Lr-6-SFT-R
引物对进行 PCR 验证, 共获得 PCR 阳性植株 49 株
(图 4-a), 再用 Rp6-SFT-F/Rp6-SFT-R 引物对进行
RT-PCR验证, 获得 43株阳性植株。RT-PCR分析结
果显示, Lr-6-SFT在转基因烟草中均能正常表达, 而
在对照植株中未检测到转录信号(图 4-b)。
2.3 转基因烟草逆境胁迫前后表型分析
在正常条件下 , 转 Lr-6-SFT 基因的烟草植株
和对照植株 35 d 后的生长状态无明显差异 (图
5-a)。在干旱胁迫 35 d 后 , 对照植株全部干枯 , 而
转基因植株顶部的叶片仍然保持绿色(图 5-b); 复
水后 , 对照植株未能复活 , 而转基因植株在 14 d
后陆续有新叶长出。在冷胁迫(10℃ 10 d, –20℃
30 min)后 , 对照植株全部枯萎 , 而转基因植株只
有下部的叶片枯萎 , 顶部叶片仍然保持正常生长
势(图 5-c); 转移至室温下恢复培养 7 d后 , 转基因
植株表现出较低程度的生长发育迟缓 , 而对照植
株全部死亡。
2.4 转基因烟草逆境胁迫前后生理指标分析
在正常生长条件下, 转基因 T0植株的果聚糖含
量显著高于对照植株, 转基因植株的果聚糖含量为
6.87~9.57 mg g–1, 而在对照植株中没有检测到果聚
糖; 转基因植株可溶性糖、脯氨酸的含量均略高于
对照植株, 丙二醛的含量略低于对照植株, 差异不
显著(图 6)。
干旱胁迫 20 d后, 转基因植株的果聚糖含量显
著增加, 为 14.97~19.23 mg g–1, 是胁迫前的 2.0~2.3
倍, 而在对照植株中没有检测到果聚糖; 转基因植
株的可溶性糖、脯氨酸含量分别为 0.20%~0.23%和
26.97~28.67 μg g–1, 均显著高于对照植株; 转基因
植株的丙二醛含量仅为 11.14~16.12 nmol g–1, 显著
低于对照植株的 29.66~30.17 nmol g–1(图 6)。
与干旱胁迫处理相似, 冷胁迫处理后的转基因
植株, 果聚糖含量增加到胁迫前的 1.9~2.4 倍, 而在
对照植株中没有检测到果聚糖; 转基因植株的可溶
性糖和脯氨酸含量也均显著高于对照植株, 丙二醛
含量却显著低于对照植株(图 6)。
总之, 干旱和冷胁迫后, 转基因植株中丙二醛
的含量略有提高, 而对照植株中丙二醛的含量显著
增加。在胁迫条件下, 转基因植株中的碳水化合物
和脯氨酸含量都显著高于对照植株。
3 讨论
3.1 Lr-6-SFT 基因的 cDNA 及其推导氨基酸序
列的特征分析
本研究克隆得到了大赖草叶片 6-SFT 基因全长
序列, 将其命名为 Lr-6-SFT。蛋白质结构分析表明,
Lr-6-SFT属于植物糖基水解酶家族 32。Lr-6-SFT核
苷酸序列所编码的氨基酸序列包含 SDPNG、RDP
和 WECVD 保守结构域及 DDER 模体 , 这表明
Lr-6-SFT 蛋白属于 S 型的 FT [32]。系统进化树分析
结果显示, Lr-6-SFT 编码的氨基酸序列与华山新麦
草、小麦、大麦、西尔斯山羊草的同源序列亲缘关
系较近, 尤其与华山新麦草的亲缘关系最近(图 3)。
多序列比对结果显示, N-端的氨基酸序列差异较大,
功能区域较保守, 不同物种间 6-SFT的相似性较高。
推测 6-SFT 作为果聚糖合成路径的关键酶基因在进
化过程中必须保持较高的遗传稳定性。
第 3期 贺晓岚等: 大赖草 6-SFT基因的克隆及其转基因烟草抗旱和抗寒性分析 393



(图 2)
394 作 物 学 报 第 42卷



图 2 推定的大赖草 6-SFT 和其他物种 6-SFT 蛋白序列联配分析
Fig. 2 Alignment of amino acid sequences of 6-SFTs from Leymus racemosus and other plant species
方框显示序列保守区;星号(*)表示相同残基; 冒号(:)表示保守替换; 点号(.)表示半保守替换。比对物种为大赖草(Lr)、普通小麦(Ta)、
西尔斯山羊草(As)、大麦(BA)、冰草(Ac)、金雀花(Bp)、猫尾草(PH)、偏生早熟禾(Ps)、草地早熟禾(Pp)、毒麦(Lt)、华山新麦草(Ph)
和多年生黑麦草(Lp)。
Conserved regions are boxed. Asterisks (*), colons (:), and periods (.) show the identical residues, conserved substitutions, and semiconserved
substitutions, respectively. The 6-SFT sequences were obtained from Leymus racemosus (Lr), Triticum aestivum (Ta), Aegilops searsii (As),
Hordeum vulgare subsp. vulgare (BA), Agropyron cristatum (Ac), Bromus pictus (Bp), Phleum pratense (PH), Poa secunda (Ps), Poa
pratensis (Pp), Lolium temulentum (Lt), Psathyrostachys huashanica (Ph), and Lolium perenne (Lp).
第 3期 贺晓岚等: 大赖草 6-SFT基因的克隆及其转基因烟草抗旱和抗寒性分析 395



图 3 推定的大赖草的 6-SFT 蛋白与其他物种 6-SFT 蛋白的系统进化树分析
Fig. 3 Phylogenic tree of 6-SFTs proteins from Leymus racemosus and other plant species
各节点处数值表示 Bootstrap值(迭代 1000次)。比对物种为大赖草(Lr)、普通小麦(Ta)、西尔斯山羊草(As)、大麦(BA)、冰草(Ac)、
金雀花(Bp)、猫尾草(PH)、偏生早熟禾(Ps)、草地早熟禾(Pp)、毒麦(Lt)、华山新麦草(Ph)和多年生黑麦草(Lp)。
The bootstrap percentages (>50%) indicate next to the branches (based on 1000 replicates). The 6-SFT sequences were obtained from Leymus
racemosus (Lr), Triticum aestivum (Ta), Aegilops searsii (As), Hordeum vulgare subsp. vulgare (BA), Agropyron cristatum (Ac), Bromus
pictus (Bp), Phleum pratense (PH), Poa secunda (Ps), Poa pratensis (Pp), Lolium temulentum (Lt), Psathyrostachys huashanica (Ph), and
Lolium perenne (Lp).

图 4 转 Lr-6-SFT 基因烟草分子检测结果
Fig. 4 PCR assay of Lr-6-SFT transgenic tobacco plants
a: 随机挑选的 8株转基因烟草植株的 PCR检测, 其中M为DL10000 DNA marker, P为阳性对照(质粒), NT为转空载体的阴性对照, 1~8
为推定的转基因植株。b: T0代烟草转基因植株的 RT-PCR检测, 以 Actin为内参, 其中 NT为转空载体的阴性对照, 其他泳道为转基因
植株。
Panel a show the PCR profile of Lr-6-SFT gene in eight individual tobacco plants. M: DL10000 DNA marker; P: positive control (plasmid);
NT: negative control (non-transgenic plants); 1–8: putative transgenic plants. Panel b show the RT-PCR result of primary T0 transgenic
tobacco plants using Actin primers as the internal control. Lane NT is the negative control (non-transgenic plants) and other lanes are the
transgenic plants.
396 作 物 学 报 第 42卷



图 5 转 Lr-6-SFT 基因烟草逆境胁迫处理结果
Fig. 5 Phenotypes of tobacco plants transformed with the
Leymus racemosus Lr-6-SFT gene under stresses
a: 温室培养 35 d的烟草植株; b: 干旱胁迫处理 35 d后的烟草植
株; c: 冷胁迫(10℃ 10 d, –20℃ 35 min)处理后转移至温室培养
7 d的烟草植株。NT为对照(转空质粒), 其他为转基因植株。
a: Tobacco plants grown in greenhouse; b: Tobacco plants
performance at 35 days after drought stress; c: Tobacco plants
recovered under room temperature for seven days after cold stress
(10℃ for 10 days and –20℃ for 35 min). NT indicates the
non-transgenic tobacco plant and others are Lr-6-SFT transgenic
plants.
Lr-6-SFT基因的 cDNA序列长度与岳爱琴等[33]
克隆的 6份普通小麦和 10份二倍体小麦的 cDNA序
列长度一致, 但与 Gao 等[34]从小麦族中分离到的多
个 6-SFT 基因及其 Ns 基因组的供体华山新麦草
6-SFT 基因[12]的 cDNA 序列长度不同。序列比对结
果显示, Lr-6-SFT除了 12 bp的插入突变外, 还与华
山新麦草的 6-SFT 存在多处单碱基变异。因此, 推
测大赖草的 6-SFT 基因来自 Xm 基因组。Del Viso
等[11]报道在雀麦属中 6-SFT基因至少存在 2个拷贝。
大赖草属于异源四倍体物种, 存在Ns和Xm基因组,
我们推测其 6-SFT 基因可能至少存在 2 个拷贝, 但
这一推测还需进一步验证。
3.2 Lr-6-SFT 表达对转基因烟草果聚糖含量和
抗逆性的影响
在本研究中, 转 Lr-6-SFT 烟草植株表现出明显
高于对照植株的抗旱和抗寒能力, 转基因植株叶片
的平均果聚糖含量为 6.87~9.56 mg g–1, 转 Lr-6-SFT
基因植株在逆境胁迫后, 果聚糖含量显著增加。这
些结果与前人报道的结果相似。Bie等[5]发现转 3个
小麦果聚糖合成酶基因 (Ta6-SFT、Ta1-SST 和

图 6 转 Lr-6-SFT 基因烟草及对照植株在干旱和冷胁迫前后的果聚糖(a)、可溶性糖(b)、脯氨酸(c)和丙二醛含量(d)的变化
Fig. 6 Changes of fructan (a), soluble sugar (b), proline (c), and MDA (d) contents in non-transgenic and Lr-6-SFT transgenic
tobacco plants before and after drought or cold stress treatments
NT: 转空载体对照; L1~L8: T0代转基因植株。*表示同一处理条件下, 转基因植株与 NT达显著差异(P<0.05)。
NT: non-transgenic plant; L1–L8: transgenic T0 plants; * indicates significant difference between the transgenic plant and NT under the same
growing condition (P<0.05).
第 3期 贺晓岚等: 大赖草 6-SFT基因的克隆及其转基因烟草抗旱和抗寒性分析 397


Ta1-FFT)单基因的烟草植株的逆境抗性提高了, 并
且转基因植株中果聚糖含量为 6.1~10.2 mg g–1; 李
淑洁等[35]报道, CaMV35S 和 rd29A 启动子驱动的
Ta-6-SFT 基因转化烟草, 转基因植株果聚糖含量在
逆境胁迫条件下显著升高。果聚糖在转基因烟草中
的积累表明外源果聚糖合成途径已引入转基因植株
中, 这可能也是导致转基因植株抗旱和抗寒性提高
的原因。果聚糖的含量受温度、pH、离子强度、底
物质量浓度等影响[36]。因此, 在逆境胁迫条件下转
基因植株果聚糖含量显著增加, 这可能是逆境条件
下植物的底物质量浓度增加所致。
无论在逆境胁迫前或逆境胁迫后, 转 Lr-6-SFT
基因阳性植株叶片的平均可溶性糖含量均高于对照
植株 , 这与 Tamura等 [17,37]的研究结果相一致。转
Lr-6-SFT 基因的阳性转基因植株可溶性糖含量提高
的原因可能是由于在逆境胁迫条件下, 部分果聚糖
水解释放出蔗糖、果糖和葡萄糖, 作为液泡的渗透缓
冲剂和低温保护剂, 插入细胞质膜防止其渗漏[38]。
在胁迫条件下, 转 Lr-6-SFT 烟草植株的脯氨酸
含量显著高于对照植株。Knipp 和 Honermeier[18]也
曾报道, 转果聚糖合成酶基因的马铃薯在水分胁迫
条件下, 植株中脯氨酸含量提高, 但是果聚糖聚合
度较高的转基因植株中脯氨酸含量较低。这表明可
溶性碳水化合物代谢的改变可能会影响水分胁迫
诱导的脯氨酸积累, 但是可溶性碳水化合物代谢和
脯氨酸积累之间的关系是复杂的, 尚需深入探讨其
机制。
丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物, 与细胞
内各种成分发生强烈反应, 导致酶和膜系统严重损
伤, 细胞结构生理完整性破坏。因此, 其含量与植物
抗逆性显著负相关[39]。与 Li 等[15]的研究结果一致,
本试验也发现在逆境胁迫后, 转基因植株丙二醛的
含量比对照植株低; 在干旱和冷胁迫后, 转基因植
株丙二醛的含量只是略有增加, 而对照植株的丙二
醛含量显著增加。这表明 Lr-6-SFT基因合成的果聚
糖在烟草的抗旱和抗寒过程中发挥重要作用。
本研究表明, Lr-6-SFT 基因的表达及果聚糖在
转基因烟草植株中的积累, 使转基因植株中可溶性
糖和脯氨酸含量增加。果聚糖、可溶性糖、脯氨酸
是植物细胞内重要的渗透调节物质, 它们能够增加
细胞质浓度, 降低细胞的冰点, 防止细胞过度脱水,
减少环境胁迫对细胞造成的氧化胁迫损伤[19-20]。然
而, 积累果聚糖的转基因烟草如何调控植株的生理
响应, 有待进一步研究。
4 结论
克隆到大赖草果聚糖合成酶关键基因 Lr-6-
SFT。该基因属于糖基水解酶第 32 家族, 能够显著
提高转基因烟草的抗旱和抗寒性。本研究结果丰富
了作物逆境胁迫抗性基因资源, 对改良作物抗逆性
有参考价值。
References
[1] Van Arkel J, Sévenier R, Hakkert J C, Bouwmeester H J, Koops
A J, van der Meer I M. Tailor-made fructan synthesis in plants: a
review. Carbohydr Polym, 2013, 93: 48–56
[2] Hendry G A, Wallace R K. The origin, distribution, and
evolutionary significance of fructans. In: Suzuki M, Chatterton N
J, eds. Science and Technology of Fructans, Boca Raton, Florida,
USA: The Chemical Rubber Company Press, 1993. pp 119–139
[3] Wiemken A, Frehner M, Keller F, Wagner W. Fructan metabolism,
enzymology and compartmentation: current topics in plant
biochemistry and physiology. In: Proceedings of the Plant
Biochemistry and Physiology Symposium. Columbia, USA:
University of Missouri, 1986. pp 17–37
[4] Hincha D K, Livingston D R, Premakumar R, Zuther E, Obel N,
Cacela C, Heyer A G. Fructans from oat and rye: composition and
effects on membrane stability during drying. Bioch Biophys Acta,
2007, 1768: 1611–1619
[5] Bie X M, Wang K, She M Y, Du L, Zhang S X, Li J R, Gao X,
Lin Z S, Ye X G. Combinational transformation of three wheat
genes encoding fructan biosynthesis enzymes confers increased
fructan content and tolerance to abiotic stresses in tobacco. Plant
Cell Rep, 2012, 31: 2229–2238
[6] Ritsema T, Joling J, Smeekens S. Patterns of fructan synthesized
by onion fructan:fructan 6G-fructosyltransferase expressed in
tobacco BY2 cells: is fructan:fructan 1-fructosyltransferase
needed in onion? New Phytol, 2003, 160: 61–67
[7] Sprenger N, Bortlik K, Brandt A, Boller T, Wiemken A.
Purification, cloning, and functional expression of sucrose:fructan
6-fructosyltransferase, a key enzyme of fructan synthesis in barley.
Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92: 11652–11656
[8] Wei J Z, Chatterton N J. Fructan biosynthesis and
fructosyltransferase evolution: expression of the 6-SFT
(sucrose:fructan 6-fructosyltransferase) gene in crested wheatgrass
(Agropyron cristatum). J Plant Physiol, 2001, 158: 1203–1213
[9] Kawakami A, Yoshida M. Molecular characterization of
sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase and sucrose:fructan
6-fructosyltransferase associated with fructan accumulation in
winter wheat during cold hardening. Biosci Biotech Biochem,
2002, 66: 2297–2305
[10] Tamura K I, Kawakami A, Sanada Y, Tase K, Komatsu T, Yoshida
M. Cloning and functional analysis of a fructosyltransferase
cDNA for synthesis of highly polymerized levans in timothy
(Phleum pratense L.). J Exp Bot, 2009, 60: 893–905
[11] Del Viso F, Puebla A F, Fusari C M, Casabuono A C, Couto A S,
Pontis H G, Hopp H E, Heinz R A. Molecular characterization of
a putative sucrose:fructan 6-fructosyltransferase (6-SFT) of the
398 作 物 学 报 第 42卷


cold-resistant Patagonian grass Bromus pictus associated with
fructan accumulation under low temperatures. Plant & Cell
Physiol, 2009, 50: 489–503
[12] He X L, Chen Z Z, Wang J W, Li W X, Zhao J X, Wu J, Wang Z
H, Chen X H. A sucrose:fructan-6-fructosyltransferase (6-SFT)
gene from Psathyrostachys huashanica confers abiotic stress
tolerance in tobacco. Gene, 2015, 570: 239–247
[13] 高翔. 小麦族植物果聚糖合成酶基因克隆及功能验证. 中国
农业科学院博士学位论文, 北京, 2010
Gao X. Cloning and Functional Analysis of Genes Encoding
Fructan Biosynthesis Enzymes in Triticeae Plants. PhD
Dissertation of Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing, China, 2010 (in Chinese with English abstract)
[14] Del Viso F, Casabuono A C, Couto A S, Hopp H E, Puebla A F,
Heinz R A. Functional characterization of a sucrose:fructan
6-fructosyltransferase of the cold-resistant grass Bromus pictus by
heterelogous expression in Pichia pastoris and Nicotiana
tabacum and its involvement in freezing tolerance. J Plant
Physiol, 2011, 168: 493–499
[15] Li H J, Yang A F, Zhang X C, Gao F, Zhang J R. Improving
freezing tolerance of transgenic tobacco expressing sucrose:
sucrose 1-fructosyltransferase gene from Lactuca sativa. Plant
Cell Tissue Organ Cult, 2007, 89: 37–48
[16] Wei J Z, Jerry Chatterton N, Larson S R. Expression of sucrose:
fructan 6-fructosyltransferase (6-SFT) and myoinositol 1-phosphate
synthase (MIPS) genes in barley (Hordeum vulgare) leaves. J
Plant Physiol, 2001, 158: 635-643
[17] Tamura K, Sanada Y, Tase K, Kawakami A, Yoshida M, Yamada
T. Comparative study of transgenic Brachypodium distachyon
expressing sucrose: fructan 6-fructosyltransferases from wheat
and timothy grass with different enzymatic properties. Planta,
2014, 239: 783–792
[18] Knipp G, Honermeier B. Effect of water stress on proline
accumulation of genetically modified potatoes (Solanum tuberosum
L.) generating fructans. J Plant Physiol, 2006, 163: 392–397
[19] Ruelland E, Vaultier M, Zachowski A, Hurry V. Chapter 2 cold
signalling and cold acclimation in plants. Adv Bot Res, 2009, 49:
35–150
[20] Szabados L, Savouré A. Proline: a multifunctional amino acid.
Trends Plant Sci, 2010, 15: 89–97
[21] Schroeven L, Lammens W, Kawakami A, Yoshida M, Van Laere
A, Van den Ende W. Creating S-type characteristics in the F-type
enzyme fructan:fructan 1-fructosyltransferase of Triticum
aestivum L. J Exp Bot, 2009, 60: 3687–3696
[22] Chatterton N J, Harrison P A, Bennett J H, Asay K H. Carbohydrate
partitioning in 185 accessions of Gramineae grown under warm and
cool temperatures. J Plant Physiol, 1989, 134: 169–179
[23] Chatterton N J, Harrison P A, Thornley W R, Bennett J H.
Structure of fructan oligomers in cheatgrass (Bromus tectorum L.).
New Phytol, 1993, 124: 389–396
[24] Mcguire P E, Dvorak J. High salt-tolerance potential in
wheatgrasses. Crop Sci, 1981, 21: 702–705
[25] Pilon-Smits E, Ebskamp M, Paul M J, Jeuken M, Weisbeek P J,
Smeekens S. Improved performance of transgenic fructan-
accumulating tobacco under drought stress. Plant Physiol, 1995,
107: 125–130
[26] Heyer A G, Wendenburg R. Gene cloning and functional
characterization by heterologous expression of the
fructosyltransferase of Aspergillus sydowi IAM 2544. Appl Environ
Microbiol, 2001, 67: 363–370
[27] Chen H, Nelson R S, Sherwood J L. Enhanced recovery of
transformants of Agrobacterium tumefaciens after freeze-thaw
transformation and drug selection. Biotechniques, 1994, 16: 664–668
[28] Schuler M A, Zielinski R E. Transformation of leaf discs with
Agrobacterium. In: Gelvin S B, Schilperoort R A, Verma D P S,
eds. Methods in Plant Molecular Biology. San Diego: Academic
Press, 1989. pp 145–156
[29] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning (Third
Edn). New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
[30] Fales F W. The assimilation and degradation of carbohydrates by
yeast cells. J Biol Chem, 1951, 193: 113–124
[31] Bates L S, Waldren R P, Teare I D. Rapid determination of free
proline for water-stress studies. Plant Soil, 1973, 39: 205–207
[32] Lasseur B, Schroeven L, Lammens W, Le Roy K, Spangenberg G,
Manduzio H, Vergauwen R, Lothier J, Prud’ Homme M P, Van
den Ende W. Transforming a fructan:fructan 6G-fructosyltrans-
ferase from perennial ryegrass into a sucrose:sucrose 1-fructosy-
ltransferase. Plant Physiol, 2009, 149: 327–339
[33] 岳爱琴, 李昂, 毛新国, 昌小平, 李润植, 贾继增, 景蕊莲. 小
麦果聚糖合成酶基因 6-SFT-A 单核苷酸多态性分析及其定位.
中国农业科学, 2011, 44: 2216–2224
Yue A Q, Li A, Mao X G, Chang X P, Li R Z, Jia J Z, Jing R L.
Single nucleotide polymorphism and mapping of 6-SFT-A gene
responsible for fructan biosynthesis in common wheat. Sci Agric
Sin, 2011, 44: 2216–2224 (in Chinese with English abstract)
[34] Gao X, She M Y, Yin G X, Yu Y, Qiao W H, Du L P, Ye X G.
Cloning and characterization of genes coding for fructan
biosynthesis enzymes (FBEs) in triticeae plants. Agric Sci China,
2010, 9: 313–324
[35] 李淑洁, 李静雯, 张正英. Ta6-SFT 在烟草中的逆境诱导型表
达及抗旱性. 作物学报, 2014, 40: 994–1001
Li S J, Li J W, Zhang Z Y. Expression of Ta6-SFT gene in
tobacco induced by drought stress. Acta Agron Sin, 2014, 40:
994–1001 (in Chinese with English abstract)
[36] 文明, 卜利伟, 罗紫韵, 王佳伟, 董芬, 黄雪松. 大蒜蔗糖: 蔗
糖 1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征. 中国农业科学, 2015,
48: 334–342
Wen M, Bu L W, Luo Z Y, Wang J W, Dong F, Huang X S.
Characteristics of sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase in garlic. Sci
Agric Sin, 2015, 48: 334–342 (in Chinese with English abstract)
[37] Tamura K, Sanada Y, Tase K, Yoshida M. Fructan metabolism
and expression of genes coding fructan metabolic enzymes
during cold acclimation and overwintering in timothy (Phleum
pratense). J Plant Physiol, 2014, 171: 951–958
[38] 许欢欢, 康健, 梁明祥. 植物果聚糖的代谢途径及其在植物抗
逆中的功能研究进展. 植物学报, 2014, 49: 209–220
Xu H H, Kang J, Liang M X. Research advances in the
metabolism of fructan in plant stress resistance. Chin Bull Bot,
2014, 49: 209–220 (in Chinese with English abstract)
[39] Venkateswarlu B, Shanker A K, Shanker C, Maheswari M.
Crop Stress and its Management: Perspectives and Strategies.
Springer Netherlands, 2012