全 文 ：第 32 卷第 1 期
2013 年 2 月
中 国 野 生 植 物 资 源
Chinese Wild Plant Resources
Vol． 32 No． 1
Feb． 2013
收稿日期:2012 － 06 － 21
基金项目:“十一五”国家科技重大专项———重大新药创制项目(2009ZX09103 － 371) ;国家自然科学基金(30772770) ;2010 年
度江苏省“青蓝工程”中青年学术带头人资助项目
作者简介:史记(1987 －) ，女，在读硕士研究生，从事中药分析研究。
* 通讯作者:刘丽芳(1969 －) ，女，博士，教授，主要从事中药活性成分和动物药研究。Tel:(025)86185136，E － mail:liulifang69
@ 126． com
doi:10． 3969 / j． issn． 1006 － 9690． 2013． 01． 013
不同采收期东北铁线莲药材中灵仙新苷的含量变化研究
史 记，管 越，周 洋，董彩霞，姚 岚，刘丽芳*
(中国药科大学 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，江苏 南京 210009)
摘 要 目的:考察不同采收期东北铁线莲药材中灵仙新苷( Clematichinenoside AR) 含量，研究其动态含量变化和
最佳采收期。方法: 采用色谱柱 Diamonsil C18 ( 250 mm ×4． 6 mm，5 μm) 柱，流动相: 乙腈 －水溶液梯度洗脱程序，流
速 1． 0 mL /min，检测波长 203 nm，柱温: 30 ℃。结果:灵仙新苷以 8 月下旬到 9 月中旬的含量最高。结论:东北铁
线莲药材的最佳采收期为 8 月下旬到 9 月中旬。
关键词 东北铁线莲;灵仙新苷; HPLC;最佳采收期
中图分类号:R932 文献标识码:A 文章编号:1006 － 9690(2013)01 － 0048 － 04
Dynamic Content Variation of Clematichinenoside AR
in the Roots of Clematis manshurica Rupr．
Shi Ji，Guan Yue，Zhou Yang，Dong Caixia，Yao Lan，Liu Lifang*
(State Key Laboratory of Natural Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)
Abstract Objective:To study the rules of dynamic variation of the content of Clematichinenoside AR in
the roots of Clematis manshurica Rupr． collected in different periods，and investigate the best harvest
time． Methods:The samples were separated on a Diamonsil C18(250 mm ×4． 6 mm，5 μm)column with
the mobile phase of acetonitrile － water (gradient elution)． The flow rate was 1． 0 mL /min． The detec-
tion wavelength was set at 203 nm． The column temperature was 30 ℃ ． Results:The content of Clema-
tichinenoside AR got its maximum yield from late August to mid September． Conclusion:The best harvest
time of the roots of Clematis manshurica Rupr． is from late August to mid September．
Key words Clematis manshurica Rupr．;clematichinenoside AR;HPLC;the best harvest time
东北铁线莲(Clematis manshurica Rupr．)为毛
茛科铁线莲属多年生草本植物，其干燥根和根茎是
2010 版中国药典收载药材威灵仙的 3 个主要来源
之一(另 2 个来源为威灵仙 Clematis chinensis Os-
beck．、棉团铁线莲 C． hexapetala Pall． 的根和根
茎)。别名东北威灵仙、辣蓼铁线莲、山辣椒秧子，
一般用根部入药，地上茎也可以食用。生于山野林
边、田埂及路旁。分布于我国东北、山西、山东、河
北、内蒙古东部;朝鲜、俄罗斯远东地区也有分布。
它是习用传统中药，味辛咸、性温，具有祛风除湿、通
络止痛的功效。主要用于治疗风湿痹痛、关节不利
等证。现代研究表明东北铁线莲中含多种皂苷类成
分［1 － 4］，已报道的药理实验结果揭示皂苷类成分是
该药材发挥抗炎镇痛活性的主要有效成分［5 － 7］。灵
仙新苷(Clematichinenoside AR，以下简称 AR，分子
量为 1806，化学结构式见图 1。)是威灵仙药材中提
取的一种主要皂苷类成分，我们前期的药理研究结
果表明，灵仙新苷对弗氏佐剂引起的大鼠免疫性炎
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第 1 期 史记，等:不同采收期东北铁线莲药材中灵仙新苷的含量变化研究
症的继发病变具有显著的治疗作用［8］。目前已有
的报道中，AR仅在毛茛科铁线莲属植物中发现，其
含量高低对于威灵仙药材的质量评价具有十分重要
的意义。
图 1 灵仙新苷(AR)的化学结构式
为合理开发东北铁线莲，确定其质量的优劣和
最佳采收期，我们采用 HPLC 法测定了不同时期采
收药材中 AR的含量，以研究其在东北铁线莲根中
含量的动态变化规律，为该药材的质量控制和进一
步开发利用提供科学的依据。
1 材料与仪器
1． 1 材料
采自吉林省舒兰市亮甲山乡，经中国药科大学
刘丽芳教授鉴定为东北铁线莲的根及根茎。药材从
5 月末采集到 10 月中旬，共计取样 13 次，所有样品
去泥粉碎，过 40 目筛备用。
1． 2 仪器
Agilent1200 液相色谱仪(美国) ;Diamonsil C18
色谱柱(250 mm × 4． 6 mm，5 μm，美国迪马公司) ，
AUY120 型电子分析天平(日本 Shimadzu公司) ，KH
－250DB 超声清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公
司) ;RE52CS － 1 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器
厂) ，数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司，HH
－4) ;灵仙新苷(clematichinenoside，AR)对照品(自
制，纯度 ＞ 98%，HPLC 法) ;纯净水(娃哈哈纯净
水) ;乙腈(Merck 公司，色谱纯) ;甲醇(分析纯，南
京化学有限公司)。
2 实验方法
2． 1 对照品溶液的制备
取 AR 对照品约 10． 0 mg，精密称定后用 30%
乙腈溶解并定容至 10 mL，制成每毫升含 1． 026
mgAR的溶液。
2． 2 样品溶液的制备
将东北铁线莲药材粉碎，过 40 目筛，取约 0． 5
g，精密称定，置 100 mL锥形瓶中，加入 50%甲醇 20
mL，加热回流提取 2 次，每次 1． 5 h，过滤，合并滤液
减压浓缩至干，冷却至室温，用 30%乙腈溶液转移
至 10 mL容量瓶中，定容，混匀，过 0． 45 μm 微孔滤
膜，即得供试品溶液。
2． 3 样品溶液提取方法的考察
2． 3． 1 提取方法的优选设计
经考察 50%甲醇提取优于水和乙醇提取，加热
回流的方法优于超声和冷浸，为系统考察各种因素
对提取结果的影响，采取正交实验，考察溶剂倍量、
提取时间、提取次数 3 个因素，测定 AR 的含量，按
四因素三水平进行 L9(3
4)正交实验。各因素水平
见表 1，实验结果和方差见表 2、表 3。
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中 国 野 生 植 物 资 源 第 32 卷
表 1 东北铁线莲甲醇提取正交实验因素水平表
因素 溶剂用量(倍) 提取时间 提取次数(次)
水平 A B C
1 20 20 min 1
2 40 2 h 2
3 60 1． 5 h 3
表 2 正交设计及结果
序列
溶剂倍量
A
提取时间
B
提取次数
C
空白列
D
东北铁线莲
AR含量 /%
1 1 1 1 1 1． 51
2 1 2 2 2 2． 01
3 1 3 3 3 1． 79
4 2 1 2 3 1． 90
5 2 2 3 1 1． 88
6 2 3 1 2 2． 12
7 3 1 3 2 1． 80
8 3 2 1 3 1． 68
9 3 3 2 1 1． 97
K1 1． 67 1． 70 1． 77 1． 67
K2 1． 97 1． 75 1． 86 1． 97
K3 1． 79 1． 96 1． 79 1． 79
R 0． 30 0． 26 0． 08 0． 30
表 3 提取方法考察方差分析表
因素 偏差平方和 自由度 F值 F临界值 显著性
A 0． 13 2 26． 25 19 P ＜ 0． 05
B 0． 11 2 21． 87 19 P ＜ 0． 05
C 0． 01 2 2． 27 19 P ＞ 0． 05
由表 2、表 3可以看出影响东北铁线莲 AR提取的
主次因素为 A ＞ B ＞ C，A 和 B 两因素均有显著性差
异，从均值 K可以看出最佳提取方案为 A2B3C2。即
20 mL的 50%甲醇，加热回流提取 2 次，每次 1． 5 h。
2． 3． 2 验证实验
按正交实验确定的最佳提取条件，即 100 mL的
50%甲醇，加热回流提取 2 次，每次 1． 5 h，平行三组
放大 5 倍的量进行验证，测定 AR含量为 2． 1%和正
交实验结果中的较优组 2． 12%含量相似，且 RSD =
1． 53%，表明此正交实验得出的最优组合符合实际。
此外，在其他条件不变的情况下追加提取时间为 2 h
的情况，得 AR 含量为 2． 01%，并未高于提取时间
1． 5 h每次，进一步验证了实验结果。
2． 4 测定方法
色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(250 mm × 4． 6
mm，5 μm)柱;流动相:乙腈(A)－水溶液(B) ，梯
度洗脱程序(见表 4) ;流速:1． 0 mL /min;检测波长:
203 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。
表 4 梯度洗脱程序
时间(min) A(%，v /v) B(%，v /v)
0 ～ 5 30 70
5 ～ 12 30→35 70→65
12 ～ 17 35→60 65→40
图 2 AR对照品色谱图
图 3 样品色谱图
2． 5 标准曲线
吸取对照品溶液 1． 25，2． 5，5，7． 5，10 mL，分别
置于 10 mL量瓶中，加 30%乙腈稀释至刻度，摇匀，
分别配成 0． 13，0． 26，0． 51，0． 77，1． 026 mg /mL 的
系列对照品溶液;分别精密吸取上述不同浓度对照
品溶液 20 μL注入色谱仪，按照上述色谱条件测定，
以峰面积(A)为纵坐标，AR 浓度(C)为横坐标，绘
制标准曲线，计算得回归方程为 A = 3 381． 6C －
50． 752，r = 0． 9992，表明 AR 浓度在 0． 13 ～ 1． 026
mg /mL内与峰面积呈良好的线性关系。
2． 6 精密度考察
精密吸取 AR的对照品溶液 20 μL，按上述色谱
条件进行测定，重复进样 6 次，测定峰面积。结果显
示该方法的精密度良好(RSD =0． 67%，n = 6)。
2． 7 重复性考察
取同一批东北铁线莲样品，平行称定 6 份，按照
2． 2 操作，每份精密吸取 20 μL，同法测定，计算，结
果显示 6 份样品中 AR 的平均含量为 4． 47%，RSD
=0． 77%(n = 6) ，表明该方法重复性较好。
2． 8 稳定性考察
取同一供试品溶液分别在 0，0． 5，5，7． 5，10 h
内同法测定，计算，结果表明 RSD为 0． 81%，表明样
品在 10 h内稳定。
2． 9 回收率考察
取已知含量的东北铁线莲药材粉末适量，精密
称定 6 份，分别精密加入 AR对照品适量，同法制备
样品溶液，进样 20 μL，以外标法计算含量，结果显
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第 1 期 史记，等:不同采收期东北铁线莲药材中灵仙新苷的含量变化研究
示，在本实验条件下，AR的平均回收率为 102． 9%，
RSD =1． 6%(n = 6) ，表明该法的准确度较好。
3 实验结果
3． 1 不同采收期样品中 AR的含量变化
取不同时期采收的样品，按上述方法制备样品
溶液，同法进行测定，用外标一点法计算药材中 AR
的含量。测定结果见表 5，图 4。
表 5 不同采收期样品中 AR的含量
编号 采收时间 AR(%)
1 11． 05． 20 2． 8
2 11． 07． 20 1． 56
3 11． 08． 04 2． 02
4 11． 08． 11 2． 08
5 11． 08． 18 2． 59
6 11． 08． 25 3． 41
7 11． 09． 01 3． 96
8 11． 09． 08 4． 24
9 11． 09． 15 3． 51
10 11． 09． 22 1． 73
11 11． 09． 29 1． 59
12 11． 10． 06 1． 52
13 11． 10． 13 1． 28
图 4 不同采收期样品中 AR含量
4 讨 论
从表 5 和图 4 可知，AR 含量变化为 5 月末较
高，7 月末较低然后逐渐递增，直至 9 月初达到顶
点，然后缓慢下降。AR 为三萜皂苷，是次生代谢产
物，它在东北铁线莲根内的积累可能与日照、温度、
水分、土壤状况等多种环境因素有关。有关报道表
明［9］，适度遮荫有利于东北铁线莲生长发育，有利
于三萜皂苷的积累，但光照太弱则会影响还原糖的
生成，进而影响皂苷的生成。5 月末和 8 月末到 9
月中旬的日照均处于适中的强度，利于 AR的积累。
吉林地区最热的是 7 月，降水集中在 6 至 8 月。适
度干旱能刺激植物中次生代谢产物的积累，三萜皂
苷的含量也会上升，和结果中的降水量不多的 8 月
末到 9 月中旬 AR含量高相符。适度的高温利于植
物中三萜皂苷的合成，所以温度适宜的 5 月底、8 月
底到 9 月中旬 AR 含量均较高。此外，东北铁线莲
的花期是 6 ～ 8 月，7 月最盛，果期是 7 ～ 9 月，可推
测 AR可能在开花时含量较低，而结果时含量较高。
另外，我们在实验中还发现，AR 主要存在于东
北铁线莲根的皮部中(高达 7． 2%) ，木部中未检测
到 AR。这个现象也为 5 月底、8 月底到 9 月中旬药
材中 AR含量相对较高的实验结果提供了佐证，我
们推测可能是由于在这 2 个时间段内，由于日照、温
度、降水等环境因素的影响，有利于东北铁线莲根皮
部的次生代谢产物的形成，故在此期间，药材中该成
分的含量相对较高。
东北铁线莲最佳采收期可以参考 AR含量较高
的 8 月下旬到 9 月中旬(8． 25 ～ 9． 15)为宜，这对保
证药材质量具有重要的意义。
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