全 文 ：檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
用乙醇-水体系作为提取溶媒，既保证了有效成分的
溶解度，又有利于样品吸热升温。试验中发现物料
粉碎程度对提取效率影响很大，粒径减小，药材与提
取溶剂接触的表面积增大，促进有效成分的溶出、
扩散。
［参考文献］
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土木香内酯和异土木香内酯的提取工艺［J］． 中国实
验方剂学杂志，2012，18(12) :36．
［责任编辑 仝燕］
［收稿日期］ 20121108(015)
［第一作者］ 金晨，在读硕士，从事天然药物活性成分研究，Tel:0791-88607657，E-mail:last59@ sina． com
［通讯作者］ * 张武岗，副教授，从事天然产物活性成分研究及中药质量标准研究，Tel:0791-87119650，E-mail:zwgchf98@ foxmail． com;
* 唐琍萍，主管药师，从事药事管理及中药质量标准研究，Tel:0791-86361304，E-mail:tanglipingnc@ sina． com
东北铁线莲中抗肿瘤活性成分的提取工艺优选
金晨1，2，翟兴英1，4，李翔1，2，张武岗1，2* ，唐琍萍3* ，张凌1，冯育林1，2，杨世林1，2
(1. 江西中医学院，南昌 330006;2. 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，南昌 330006;
3. 江西中医学院附属医院，南昌 330000;4. 北京中医药大学，北京 100102)
［摘要］ 目的:建立东北铁线莲中抗肿瘤活性成分 W2［3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃
葡萄糖-(1→4)-β-D-吡喃核糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷］的提取工艺。方法:以 W2
提取量为指标，采用 HPLC测定 W2 含量，通过正交试验和单因素试验考察提取溶媒、提取时间、料液比、提取次数对提取工艺
的影响，确定 W2 最佳提取工艺。结果:最佳提取工艺为 30%乙醇提取 2. 5 h，料液比 1∶ 12，提取 2 次。结论:优选的提取工艺
合理、稳定、可行，为东北铁线莲后续研究提供实验依据。
［关键词］ 东北铁线莲;提取工艺;齐墩果酸皂苷;正交试验;高效液相色谱法
［中图分类号］ R283． 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)08-0033-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013080033
Optimization of Extraction Process of Anti-tumor Active
Ingredient in Clematis manshurica Rupr
JIN Chen1，2，ZHAI Xing-ying1，4，LI Xiang1，2，ZHANG Wu-gang1，2* ，
TANG Li-ping3* ，ZHANG Ling1，FENG Yu-lin1，2，YANG Shi-lin1，2
(1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine (TCM) ，Nanchang 330006，China;
2. National Pharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation of Chinese
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 8
Apr．，2013
Herbal Medicine，Nanchang 330006，China;
3. Affiliated Hospital of Jiangxi University of TCM，Nanchang 330000，China;
4. Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China)
［Abstract］ Objective:To establish extraction technology for anti-tumor active ingredient of W2［3-O-α-
L-pyran rhamnose- (1→ 6)-β-D-glucopyranosyl- (1→ 4)-β-D-glucopyranosyl- (1→ 4)-β-D-ribopyranose-
(1→3)-α-L-pyran rhamnose- (1 → 2)-α-L-arabinopyranosyl oleanolic acid saponins］ from Clematis
manshurica Rupr． Method:With the content of W2 as index，which was determined by HPLC，effects of
extraction time， extraction solvent， liquid-solid ratio and extraction times on extraction technology were
investigated by single factor test and orthogonal test， then to determine optimum technology of W2. Result:
Optimum extraction process of W2 was as following:reflux extracted 2 times with 12 times the amount of 30%
ethanol，2. 5 hours per time． Conclusion:Optimized technology was reasonable，stable and feasible，which
could provide a experimental basis for the follow-up research of C． manshurica Rupr．
［Key words］ Clematis manshurica Rupr; extraction process; oleanolic acid saponins; orthogonal
experiment;HPLC
东北铁线莲具有祛风湿、通经络之效，作为威灵
仙的基原植物收载于 2010 年版《中国药典》，其主
要成分包括皂苷类、木脂素类、生物碱类、酚苷类、内
酯及有机酸等［1-5］。现代药理研究表明，其具有抗
肿瘤、抗菌消炎、降血糖、利胆、抗利尿、止痛等作
用［6-7］。前期研究发现，东北铁线莲提取物中 W2
［3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→ 6)-β-D-吡喃葡萄糖-
(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→ 4)-β-D-吡喃核糖-
(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖
齐墩果酸皂苷］对肝癌细胞 SMMC-7721 具有显著的
抑制作用。本实验以 W2 提取量为指标，采用正交
试验和单因素试验优选东北铁线莲的提取工艺，为
其大规模生产提供参考。
1 材料
Agilent 1100 系列手动高效液相色谱仪(美国安
捷伦) ，COSMOSIL C18 ODS 色谱柱(4. 6 mm × 250
mm，5 μm，日本半井) ，AUW-220D 型 1 /10 万分析
天平(日本岛津) ，BS124S型 1 /万电子分析天平(德
国赛多利斯) ，Millipore Simplicity 型超纯水器(美国
密理博) ，RT-02B型二两装粉碎机(台湾荣聪)。
W2 对照品(自制，经蒸发光散射检测器检测，
纯度≥95%) ，东北铁线莲(辽宁产，厦门仁泽堂代
理，经江西中医学院刘庆华副教授鉴定为毛茛科铁
线莲属植物东北铁线莲 Clematis manshurica Rupr．
的干燥根) ，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂
均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 碱水解工艺 在前期研究中已确定东北铁线
莲的碱水解工艺，即将提取液置于 65 ℃减压浓缩至
无醇味，调配成含生药量 0. 3 g·mL －1的预水解液，
每 10 g生药的预水解液加入 10 mol·L －1氢氧化钠 2
mL，于 85 ℃以上磁力搅拌加热反应 3 h，反应完毕
后调至 pH 6 ～ 7，即得。
2. 2 含量测定
2. 2. 1 对照品溶液的制备 称取已恒重的 W2 适
量，加甲醇配制成质量浓度分别为 0. 459，0. 324，
0. 259，0. 194，0. 188，0. 130，0. 065，0. 032 g·L －1的对
照品溶液。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 准确称取东北铁线莲
药材样品(根部经药材粉碎机粉碎后过 2 号筛，下
同)10 g，置具塞锥形瓶中，加 70%甲醇 100 mL，密
塞，超声提取(300 W，50 kHz)30 min，放冷，过滤，按
2. 1 项下方法处理，碱水解液稀释 10 倍后待测，
即得。
2. 2. 3 色谱条件与系统适用性试验 COSMOSIL
C18 ODS色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，柱温 25
℃，流速 1 mL·min －1，进样量 20 μL，流动相甲醇
(A)-水(B)梯度洗脱(0 ～ 15 min，70% A;15 ～ 30
min，85%A) ，理论塔板数按W2 计算大于 5 000。见
图 1。
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 线性关系考察 精密量取 2. 2. 1 项下系列
质量浓度对照品溶液，按 2. 2. 3 项下色谱条件测定，
以峰面积为纵坐标，W2 进样量为横坐标，得回归方
程 Y = 193. 09X － 103. 65(R2 = 0. 999) ，表明 W2 进
样量在 0. 648 ～ 9. 184 μg与峰面积线性关系较好。
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A．对照品;B．供试品;1. W2
图 1 东北铁线莲 HPLC
2. 3. 2 精密度试验 精密吸取对照品溶液(0. 259
g·L －1) ，按 2. 2. 3 项下方法检测，重复进样 6 次，结
果峰面积 RSD 0. 99%，表明仪器精密度较高。
2. 3. 3 稳定性试验 准确称取东北铁线莲样品适
量，按 2. 2. 2 项下方法制备供试品溶液，按 2. 2. 3 项
下方法检测，分别于 0，2，4，8，12，24 h 各进样 1 次，
结果峰面积 RSD 1. 50%，表明供试品溶液在 24 h内
较为稳定。
2. 3. 4 重复性试验 精密量取同一供试品溶液 6
份，按 2. 2. 3 项下方法检测，结果峰面积 RSD
1. 43%，表明该方法重复性良好。
2. 3. 5 加样回收试验 准确称取东北铁线莲样品
9 份，每份 2 g，等分为 3 组，每组依次加入 W2 对照
品 2. 2，4. 4，6. 6 mg，按 2. 2. 2 项下方法制备供试品
溶液，按 2. 2. 3 项下方法检测，结果平均回收率
99. 71%，RSD 1. 08%，表明该方法较为稳定可靠。
2. 4 单因素试验考察［8］
2. 4. 1 提取溶媒 准确称取东北铁线莲样品每份
10 g，分别用水和体积分数为 30%，50%，70%，95%
的乙醇溶液 100 mL加热回流提取 2 h，提取 1 次，过
滤，按 2. 1 项下方法碱水解，碱水解液稀释 10 倍，按
2. 2. 3 项下方法检测，结果 W2 提取量分别为 1. 77，
3. 32，3. 72，3. 64，1. 99 mg·g －1。故选取 50%乙醇。
2. 4. 2 提取时间 准确称取东北铁线莲样品 10 g，
分别用 50%乙醇 100 mL 加热回流提取 1，1. 5，2，
2. 5，3 h，其他操作同 2. 4. 1 项，结果W2 提取量分别
为 3. 15，3. 34，3. 35，3. 43，2. 81 mg·g －1。故确定提
取时间 2. 5 h。
2. 4. 3 料液比 准确称取东北铁线莲样品 5 份，每
份 10 g，分别用 50%乙醇 60，80，100，120，150 mL 加
热回流提取 2. 5 h，其他操作同 2. 4. 1 项，结果 W2
提取量分别为 2. 27，4. 75，3. 98，3. 90，3. 74 mg·g －1。
故选取料液比 1∶ 8。
2. 4. 4 提取次数 准确称取东北铁线莲样品 5 份，
每份 10 g，加 50%乙醇 80 mL加热回流提取 2. 5 h，
分别提取 1，2，3，4，5 次，其他操作同 2. 4. 1 项，结果
W2 提取量分别为 3. 34，0. 96，0. 30，0. 28，0. 28 mg·
g －1。故确定提取 2 次。
2. 5 正交试验优选 准确称取东北铁线莲样品 9
份，每份 10 g，以 W2 提取量为指标，选取乙醇体积
分数、提取时间及料液比为考察因素，按正交试验安
排进行提取，每份药材提取 2 次，因素水平见表 1，
试验安排及结果见表 2，方差分析见表 3。
表 1 东北铁线莲中抗肿瘤活性成分W2 提取
工艺正交试验因素水平
水平
A
乙醇体积分数 /%
B
提取时间 /h
C
料液比
1 70 2. 5 1∶ 12
2 50 2 1∶ 10
3 30 1. 5 1∶ 8
表 2 东北铁线莲中抗肿瘤活性成分W2 提取工艺正交试验安排
No． A B C D(空白)
W2 提取量
/mg·g － 1
1 1 1 1 1 4. 29
2 1 2 2 2 3. 62
3 1 3 3 3 2. 20
4 2 1 2 3 3. 36
5 2 2 3 1 2. 18
6 2 3 1 2 4. 29
7 3 1 3 2 3. 46
8 3 2 1 3 3. 10
9 3 3 2 1 3. 91
K1 3. 37 3. 70 3. 89 3. 46
K2 3. 28 2. 97 3. 63 3. 79
K3 3. 49 3. 47 2. 61 2. 89
R 0. 21 0. 73 1. 28 0. 90
表 3 W2 提取量方差分析
方差来源 SS f F P
A 0. 069 2 0. 056 ＞ 0. 05
B 0. 849 2 0. 691 ＞ 0. 05
C 2. 741 2 2. 232 ＞ 0. 05
D(误差) 1. 254 2
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金晨，等:东北铁线莲中抗肿瘤活性成分的提取工艺优选
由直观分析可知，各因素对提取工艺的影响顺
序为 C ＞ B ＞ A;方差分析显示各因素对提取工艺的
影响均无显著性差异;最佳提取工艺为 C1B1A3，即
加 12 倍量 30%乙醇回流提取 2. 5 h，提取 2 次。
2. 6 工艺验证 准确称取东北铁线莲样品 3 份，每
份 100 g，按优选的工艺进行提取，提取液过滤，于
65 ℃减压浓缩至无醇味，结果 W2 提取量分别为
5. 54，5. 64，5. 58 mg·g －1;出膏率 38. 88%，浸膏中
W2 纯度 1. 45%;说明优选的工艺较稳定且提取效
率较高。
3 讨论
目前，东北铁线莲提取物的含量测定多以齐墩
果酸为指标，以反映药材质量［9］，前期药理研究表
明，W2 为东北铁线莲中主要抗肿瘤成分，故本实验
以 W2 提取量为主要考察指标，可更有针对性的揭
示东北铁线莲的抗肿瘤活性和质量。东北铁线莲常
见的提取方法有微波提取［10］、超声提取［11］、加热回
流提取等，但前两者不太适应工业生产的要求，因此
本实验选择乙醇加热回流提取法，建立和优选了一
整套完备的提取方案，为东北铁线莲抗肿瘤活性物
质的工业生产提供实验依据。
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［责任编辑 仝燕
檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
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