全 文 ：收稿日期:2008-04-10
基金项目:国家自然科学基金(30370905 , 30571135);北京市自然科学基金(5032009)
作者简介:张　艳(1983-),女 ,山东潍坊人 ,在读硕士 ,主要从事分子与细胞遗传学方面的研究。
通讯作者:赵茂林(1965-),男 ,山西原平人 ,研究员 ,研究生导师 ,主要从事植物分子细胞遗传学与育种学方面的研究。
载有抗逆性基因的多枝赖草染色体连锁群
的特定 TAC克隆的鉴定
张　艳1 , 2 ,赵茂林2 ,孙　淼1 , 2 ,徐粤宇3
(1.首都师范大学 生命科学学院 ,北京　100037;2.北京市农林科学院农业生物技术
研究中心 ,北京　100097;3.湖南工程学院 ,湖南 湘潭　411104)
　　摘要:分别以耐黄矮病耐蚜虫小赖麦附加系 Line24、耐盐耐旱小赖麦附加系 Line15、耐盐小赖麦易位附加系 Line14
为材料 , 以它们各自所附加的含有相应抗逆基因的多枝赖草染色体(简称为抗逆染色体)的 6个特定 SSR分子标记为
探针 ,通过两轮菌落杂交法筛选多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库 ,最终得到经过验证的阳性克隆 77 个 ,
它们分别对应于 3个(易位)附加系中所附加抗逆染色体(臂)连锁群的 6 个特定 SSR标记 , 每一标记所对应的 TAC 克
隆数目变化在5 ～ 19个 , 平均约 13个。进一步从来自 Line24 的抗逆染色体连锁群的同一个探针筛选到的阳性克隆中
抽查2 个TAC 克隆15J18和 09I02 , 通过双色荧光原位杂交技术(Double-color FISH)进行初步定位 ,直观地证明了文库筛
选结果的准确性。为各条抗逆染色体的识别鉴定和相关抗逆基因的精细定位奠定了基础。
关键词:多枝赖草;TAC 克隆;二体(易位)附加系;抗逆性;双色荧光原位杂交
中图分类号:Q781;Q243;S812.8　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2008)05-0006-07
Identification of the Transformation-competent Artificial Chromosome(TAC)
Clones Specific to the Linkage Group of Chromosomes Containing
Stress-tolerant Genes of Leymus multicaulis
ZHANG Yan1 ,2 ,ZHAO Mao-lin2 , SUN Miao1, 2 ,XU Yue-yu3
(1.Capital Normal University ,Beijing　100037 ,China;2.Beijing Academy of Agriculture and Forestry
Science ,Beijing　100097 ,China;3.Hunan Institute of Engineering ,Xiangtan　411104 ,China)
Abstract:Leymus multicaulis(2n=4X=28 ,XmXmNsNs)is one of benefit native grass species in Xinjiang ,which
has many excellent traits such as immune or highly resistant to BYDV(Barley yellow dwarf virus), and highly tolerant to
salt ,drought , leanness , pollution , aphids and so on.So it is very important to isolate and clone genes controlling these
traits in Leymus multicaulis.In this research , the transformation-competent artificial chromosome(TAC)genomic libraries
of Leymus multicaulis were screened through the method of colony blot hybridization in two steps with the probes of spe-
cific SSR molecular markers from stress-tolerance chromosomes ,which contained stress-tolerant genes of Leymus multi-
caulis respectively added to wheat alien disomic addition line.Line 24 , tolerant to BYDV and aphids;Line 15 , tolerant to
salt and drought , and wheat alien disomic translocation-addition line;Line 14 , tolerant to salt.As a result , a total of 77
positive clones respectively specific to six SSR markers from three stress-tolerance chromosome linkage groups were identi-
fied.The accuracy of the screening results was verified visually by physical localization of two TAC clones 15J18 and
09I02 from the positive clones specific to a SSR marker of the same linkage group using double-color fluorescent in situ
hybridization(Double-color FISH).The research results will play a pivotal role in identifying individual stress-tolerance
chromosome of Leymus multicaulis and constructing high-resolution physical map.
Key words:Leymus multicaulis;TAC clones;Disomic alien(translocation)addition line;Stress-tolerance;Double-
color fluorescent in situ hybridization
华北农学报·2008 , 23(5):6-12
　　多枝赖草(Leymus multicaulis)(2n =4x =28=
14II ,XmNs)是禾本科小麦族大麦亚族赖草属小粒种
子类型的一个种 ,目前已被证实具有突出的耐干旱 、
耐盐碱 、耐黄矮病 、耐蚜虫 、耐瘠薄 、耐污染等优异抗
逆特性[ 1] 。这些抗逆特性都是目前种植的大多数农
作物如小麦等本身缺乏的 ,是在当今世界人口增长 、
可耕(牧)地减少 、环境恶化形势下急需改良的特性 。
因此 ,获得这些具有优异抗逆特性的功能基因 ,明确
它们的抗逆作用机理 ,对于农业 、畜牧业和草坪业中
植物的抗逆遗传育种极为重要 。
关于将多枝赖草应用于小麦的研究国外报道很
少 ,Plourde 等[ 2] 1989年首次报道获得了多枝赖草与
小麦间的远缘杂种及其回交一代和二代 ,并发现多
枝赖草对黄矮病毒 PAV 株系的抗性能够传递给杂
种后代 , 以后再无相关报道。国内董玉琛等[ 3] 于
1985年首先成功地进行了多枝赖草与小麦(2n=6x
=42=21II ,AABBDD)远缘杂交;赵茂林等[ 4-6] 首次
从中选育出普通小麦-多枝赖草 12 种(缺少第 4 , 5
同源群)15个互不相同的二体异附加系(简称小赖
麦附加系),初步鉴定出高度耐黄矮病耐蚜虫以及耐
盐的几种小赖麦附加系 ,并在 2001年通过基因组原
位杂交技术明确小赖麦附加系 Line24 与小麦杂交
形成的小麦-多枝赖草单体异附加材料中 ,减数分裂
期的细胞中含有完整的一条外源多枝赖草染色体
(图 3-A)[ 7] ;采用生物学和血清学(ELISA)相结合的
鉴定方法证明了多枝赖草对我国大麦黄矮病毒
(BYDV)PAV和GAV 株系免疫或高抗 ,小赖麦附加
系Line24高耐这 2种株系[ 8] ;采用 SSR技术确定了
微卫星引物对wms133 、wms190 、wms314 、wms400扩增
出的特异带可以作为 Line24中多枝赖草染色体的
特定SSR分子标记[ 9] 。利用含0.4%(m/m)NaCl的
人工模拟盐池鉴定出一个高度耐盐的小赖麦附加系
Line15 ,通过荧光原位杂交技术表明其细胞中附加
有一对完整的多枝赖草染色体(图 3-B)[ 10] , 采用
SSR技术确定了微卫星引物对 wms674 、wms400 、
wms382 、wms501扩增出的特异带可以作为 Line15中
多枝赖草染色体的特定 SSR分子标记。还鉴定出
Line14是一个耐盐的易位断裂发生在着丝点处的小
麦-多枝赖草臂间易位附加系(图 3-C),并利用 SSR
技术确定了微卫星引物对 wms156扩增出的特异带
可以作为 Line14 中多枝赖草染色体臂的特定 SSR
分子标记[ 11] 。对所有附加系进行模拟旱池的耐旱
鉴定试验 ,发现 Line14 和 Line15都耐旱 ,在定期缺
水后 ,浇水恢复迅速;Line15的耐旱性更加显著 ,在
种植后全生育期不灌溉的情况下 ,产量与正常灌溉
的相差不大。2006 年首次构建了多枝赖草基因组
可转化人工染色体(TAC)文库[ 12] ,该文库以 pYL-
TAC17和 pYLTAC747H 为载体 ,平均插入片段长度
约 50 kb ,总克隆数为 40多万个 ,至少覆盖了 3 ～ 5
倍多枝赖草基因组 ,为多枝赖草抗性基因的克隆与
物理作图奠定了基础。
在上述研究基础上 ,分别以耐黄矮病耐蚜虫小
赖麦附加系 Line24 、耐盐耐旱小赖麦附加系 Line15 、
耐盐小赖麦易位附加系 Line14 中所附加的含有各
自相应抗逆基因的多枝赖草染色体(简称为抗逆染
色体)的特定 SSR分子标记为探针 ,通过菌落原位
杂交法筛选多枝赖草基因组 TAC 文库 ,以获得分属
于不同附加系中所附加的抗逆染色体(臂)连锁群中
的阳性克隆 ,并利用双色荧光原位杂交(Double-color
FISH)技术对所筛选阳性克隆的可靠性进行鉴定。
1　材料和方法
1.1　材料
小赖麦附加系 Line24和 Line15(中国春/多枝赖
草//中国春///丰抗13),小赖麦易位附加系 Line 14
(中国春/多枝赖草//中国春///丰抗 10)是赵茂林
于 1991-1993 年在中国农业科学院董玉琛院士指
导下所创制和繁殖保存;其有关抗性亲本多枝赖草
和普通小麦亲本中国春 、丰抗 10和丰抗 13 ,由赵茂
林研究员保存提供 。除多枝赖草是多年生田间宿根
生长外 ,其余材料均于秋末播种前切取根尖固定供
有丝分裂期染色体制片 ,播种出苗后拔节前的分蘖
嫩叶供提取 DNA ,植株孕穗期花药供减数分裂期染
色体制片 。
多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库
由赵茂林研究员的实验室构建保存 ,本研究选用备
份于 14块 384孔板的 5 376个单克隆 ,其中以 pYL-
TAC17 和 pYLTAC747H 为载体的各有 2 496 和
2 880个 。
1.2　方法
1.2.1　筛选文库的高密度克隆膜的制备 　借助
GeneTAC
TM
G3将 14块 384孔板的 5 376个单克隆按
4×4 的排列方式 ,每一克隆重复 3 次接种于 3 张
8 cm×12 cm的硝酸纤维素膜(Whatman)上。将接种
面向上置于含 25μg/mL卡那霉素 、5%的蔗糖和 0.3
mmol/L IPTG的 LB平板上 ,菌斑长至 0.5 ～ 1 mm 约
14 h。膜的菌落面向上小心置于用 10%SDS溶液浸
透了的滤纸(Whatman 3 mm)上 4 min ,同样方法依次
用变性液(1.5 mol/L NaCl , 0.5 mol/L NaOH)5 min ,
中和 液 (1.5 mol/L NaCl , 0.5 mol/L Tris-HCl ,
5期 张　艳等:载有抗逆性基因的多枝赖草染色体连锁群的特定TAC克隆的鉴定 7　
1 mmol/L EDTA)5min 2次 ,含0.1%SDS的 2×SSC 5
min ,2×SSC 5 min ,0.4 mol/L NaOH 20 min处理后 ,
在滤纸晾干 ,放 CL-1000 UV crosslinker 机中能量为
1 200×100 μJ/cm2紫外线下交联 4 min ,每张膜单放
一个盒中漂冼 ,菌面向下轻微振荡 ,依次再经 5×
SSC 、0.1%SDS 中 20 min 2 次 , 2×SSC 中 10 min 2
次 ,室温下风干 。制备好的高密度克隆膜可直接用
于杂交分析或-20℃干燥保存。
1.2.2　筛选文库的探针制备　选用小赖麦附加系
Line24 的 2 个 SSR 分子标记引物对 wms133 和
wms190[ 9] , Line15 的 2 个 SSR 分子标记引物对
wms400和 wms674[ 10] ,小赖麦易位附加系 Line14的
SSR分子标记引物对 wms156[ 11] ,对相应的小赖麦附
加系及其抗性亲本多枝赖草和非抗性亲本小麦品种
(中国春 、丰抗 10和丰抗 13)进行 PCR 扩增 ,扩增所
需的模板 DNA 从叶片中提取[ 13] 。SSR反应主要参
照 Röder 等[ 14] , PCR 反应体系含 2 μL 10 ×PCR
Buffer ,0.2μL 25 mmol/LMgCl2 ,2μL 2mmol/L dNTP ,
2.5 μL 2μmol/L 引物 ,0.4μL 2.5U/μL Taq酶 ,50 ～
100 ng DNA 模板 ,加 ddH2O到 20 μL。扩增程序为:
94℃预变性 4或 5min ,再按每个循环94℃1 min ,55
或60℃1min ,72℃1或2 min扩增 30或 35个循环 ,
最后 72℃延伸 10 min 。PCR扩增在 PTC-100-16MS
原位 PCR仪(MJ Research)上进行 。
扩增产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测:20 μL
PCR反应产物中加入 6μL 变性载样缓冲液(98%无
离子甲酰胺 ,10 mmol/L EDTA(pH 8.0),0.25%溴酚
蓝),94℃变性 5 min ,立即冰浴冷却备用 ,样品上样
量为 5μL ,95W 恒功率电泳(2 h左右),银染 。胶板
晾干后回收差异片段二次 PCR扩增。
二次扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测后 ,回
收各 SSR扩增特征片段 ,分别按照 DIG-High Prime
DNA Labeling and Detection Starter Kit II(Roche)说明
书程序采用随机引物标记法进行 Digoxigenin-dUTP
标记 ,制备成杂交筛选探针。
1.2.3　阳性 TAC 克隆的筛选验证　采用两轮菌落
杂交法对 TAC文库进行筛选 。首先各探针分别与 2
份高密度克隆膜按照 DIG-High Prime DNA Labeling
and Detection Starter Kit II(Roche)说明书程序进行第
一轮杂交 ,将每个探针在 2次杂交结果中都显示为
阳性和仅显示 1次阳性的克隆点进行分别统计 ,从
中选取都显示为阳性和仅显示 1次阳性但杂交信号
最强的克隆 ,按探针不同每一克隆重复 2次手工接
种于硝酸纤维素膜上 ,利用第 1轮杂交回收的探针
对手工点膜进行第 2轮杂交筛选验证。
1.2.4　染色体制片与双色荧光原位杂交(Double-
color FISH)　染色体制片程序参考葛荣朝等[ 10]的方
法。从任意一个探针筛选文库所获得的阳性克隆
中 ,选取 2 个 TAC 克隆用碱裂解法提取质粒 DNA
后 ,采用缺口平移法分别用 Biotin-1l-dUTP(Bio-nick
translation mix , Enzo.Roche)和 Digoxingenin-11-dUTP
(dig-nick translation mix , Enzo.Roche)参照试剂盒说
明书进行标记 ,制备成 FISH探针。
双色荧光原位杂交参阅 Liu等[ 15]的程序 ,稍有
修改。不同材料的杂交液成分不同(表 1),每张染
色体制片加杂交液 40μL ,加塑料盖片后 ,放入 PTC-
100-16MS 原位 PCR仪(MJ Research),变温处理过夜
(75℃5 min ,60℃2 min ,55℃2 min ,50℃30 s ,45℃1
min ,42℃2 min , 40℃ 5 min , 38℃ 5 min ,37℃18 h)。
检测时每张制片滴加 5%BSA 配制的 2μg/mL Anti-
dig 溶液和 2 μg/mL avidin-rhodanmine 溶液各 50 μL ,
加塑料盖片 ,置于原位 PCR仪 37℃, 1 h 或更长时
间 , 最后滴加 DAPI II (Abbott Molecular Inc.)20
μL/片 ,封片 。
表 1　3 种试验材料的杂交液成分
Tab.1　The hybridization solutions of three different materials
多枝赖草
Leymus
multicaulis
小赖麦附加系
Line24
中国春
Chinese
spring
100%去离子甲酰胺/μL 100% deionized formainide 20 20 20
80%硫酸葡聚糖/μL 80% sodium dextran sulphate 5 5 5
20×SSC/μL 4 4 4
10%SDS/μL 1 1 1
鲑鱼精 DNA/μg Salmon sperm DNA 5 5 5
小麦封阻 DNA/μg Wheat blocking DNA - 1 1
多枝赖草 Cot-1 DNA/μg Leymus multicaulis blocking Cot-1 DNA 1 1 -
标记的 TAC克隆探针/ ng Labeled TAC DNA 各 50 各 50 各 50
2　结果与分析
2.1　筛选文库探针的获得
用3条抗逆染色体的 5对特定SSR分子标记引
物分别对相应的小赖麦(易位)附加系及其抗性亲本
多枝赖草和非抗性亲本小麦品种中国春 、丰抗 10 、
丰抗 13进行 PCR扩增 ,鉴定出各小赖麦(易位)附
加系和多枝赖草都能够扩增的 6个特异性条带(谱
8　 华　北　农　学　报 23卷
带图同文献[ 9-11]),即SSR分子标记wms133-310
bp ,wms190-175 bp ,wms165-150 bp ,wms165-170
bp ,wms400-123 bp和 wms674-125 bp(表 2),回收
后进行二次扩增(图 1),经随机引物标记法标记后
作为筛选文库的探针。
表 2　筛选以单克隆形式保存的多枝赖草基因组 TAC文库所确定的阳性克隆
Tab.2　Positive clones identified by screening clones of the Leymus multicaulis TAC libraries stored individually
探针
Probes
来源
Source
抗逆相关性
Stress
resistance
筛选阳性克隆数
Number
of hits
阳性克隆
Positive clones
pYLTAC17载体
Vector of pYLTAC17
pYLTAC747H载体
Vector of pYLTAC747H
wms133-310 bp Line24 耐黄矮病耐蚜虫 19 03M11 ,03M14 , 03N21 , 03O08 , 02L04, 06H09 , 09I02 , 09J06 ,
05G08 , 15H19 ,15K16 , 20B19 , 20L20
20C05, 20C08, 20C09, 20D17 ,
34D03b , 15J18
wms190-175 bp Line24 耐黄矮病耐蚜虫 5 03D06 , 05G02 06J18 , 06B12 , 06B13
wms156-150 bp Line14 耐盐 10 23L04a , 34I09c 31O06c ,02N01 , 04I05 , 06H06 ,
09E04 , 09M07 , 31M07a ,20M12c
wms156-170 bp Line14 耐盐 12 03D06 , 20D16 , 23L04a , 34I09c 02K01 , 06B12 , 06K04 ,09B09 ,
09M12 , 31O06c , 20M12c , 31M07a
wms400-123 bp Line15 耐盐耐旱 12 26B14, 34D03b 06G22 , 04J09a , 20I04 , 20N02 ,
23M12 , 31N01, 02H10a , 02M04a ,
31L06, 34K03
wms674-125 bp Line15 耐盐耐旱 19 15E13, 20E18, 20G06 , 20H10 , 04J09a , 04L11 , 06C15 , 06G22,
20H11 , 34I09c 20M12c , 20P16 , 31H06 ,31O05 ,
31O06c ,31O07 , 34K12, 02H10a ,
02M04a
总计Total 77 30 47
　注:a.由分布于同一连锁群内的不同探针所筛选到的相同克隆;b.由分布于不同连锁群内的探针筛选的相同克隆;c.由分布于不同连锁群和
同一连锁群内的不同探针筛选到的相同克隆。
　Note:a.Clones hit by different probes from the same linkage group;b.Clones hit by probes from the different linkage groups;c.Clones hit by different probes
both from the same linkage group and different linkage groups.
A:1.Marker;2.wms190-175 bp;3.wms133-310 bp;
B:1.wms165-170 bp;2.wms165-150 bp;3.wms674-125 bp;
4.wms400-123 bp;5.Marker.
图 1　回收特异性条带二次扩增结果
Fig.1　The amplified products of specific-fragments
extracted from gel
2.2　抗逆染色体连锁群的特定 TAC克隆的筛选
本研究中首先将保存于 14块 384孔板的 5 376
个单克隆按4×4的排列方式 ,每一克隆重复 3次接
种于 3张 8 cm×12 cm的硝酸纤维素膜上。由于杂
交信号强度会随着杂交与洗涤次数的增加而逐渐降
低[ 16] ,考虑到本试验中需要进行杂交的探针有 6
个 ,我们制备了 4份高密度克隆膜。为了使杂交结
果全面而准确 ,在进行第一轮原位杂交时 ,6个标记
探针分别与2份高密度克隆膜进行了原位杂交(图
2-A),将每个探针在 2次杂交结果中都显示为阳性
A.第 1轮 ,图中箭头标示的是探针wms133-310 bp(表 2)筛选到的一
个阳性克隆(来自于 5号板的 20B19);B.第 2轮 ,箭头指示的是探针
wms133-310 bp(表 2)筛选到的一个阳性克隆(来自于 9 号板的
09J06), 2次重复均呈阳性。
A.Partial result s of the first step colony hybridization, a positive clone(20B19
from plate #5)hybridized to the probe wms133-310 bp(Tab.2)i s shown;
B.Partial results of the second step colony hybridization , a positive clone
(09J06 f rom plate #9)hybridized to the probe wms133-310 bp(Tab.2)is
shown ,which is also positive in duplicate.
图 2　两轮菌落杂交的部分结果
Fig.2　Partial results of two-step colony hybridizations
5期 张　艳等:载有抗逆性基因的多枝赖草染色体连锁群的特定TAC克隆的鉴定 9　
和仅显示一次阳性的克隆点进行分别统计。从第 1
轮杂交结果中选取都显示为阳性和仅显示一次阳性
但杂交信号最强的克隆 ,按探针不同每一克隆重复
2次手工接种于 6 张硝酸纤维素膜上 ,利用第 1轮
杂交回收的探针对手工点膜进行第 2 轮杂交筛选
(图2-B),最终得到经过验证的阳性克隆 77个 ,它们
分别对应于3个(易位)附加系中所附加抗逆染色体
(臂)连锁群的 6 个特定 SSR标记(表 2),每一标记
所对应的 TAC 克隆数目为 5 ～ 19个 ,平均约 13个 。
对表 2进一步分析可以发现 , 77 个阳性克隆
中 ,有 88.31%(68/77)的克隆各自被唯一的一个探
针筛选到;而剩余 11.69%(9/77)的克隆 ,则同时为
分布于不同连锁群间或同一连锁群内的不同探针筛
选到 ,可以归纳成 3类:①同时为分布于同一连锁群
内的不同探针所筛选到 ,如 04J09 、02H10 和 02M04
为分布于连锁群 Line15 的 wms400 -123 bp 和
wms674-125 bp两个探针所共同筛选到 , 23L04 和
31M07为分布于连锁群Line14的wms156-150 bp和
wms156-170 bp两个探针所共同筛选到;②同时为
分布于不同连锁群间的探针所共同筛选到 , 如
34D03为分布于连锁群 Line24(wms133-310 bp)和
连锁群 line15(wms400-123 bp)的两个探针所共同
筛选到;③同时为分布于不同连锁群间和同一连锁
群内的不同探针同时共同筛选到 ,如 20M12 , 31O06
和 34I09为分布于连锁群 Line14(wms156-150 bp和
wms156-170 bp)和连锁群 Line15(wms674-125 bp)
间的 3个探针所共同筛选到。
根据多枝赖草基因组 TAC 文库构建时所用的
两种 TAC 载体分别统计 ,发现最终得到的 77 个阳
性克隆中 ,以pYLTAC17和 pYLTAC747H 为载体的阳
性克隆各有30 , 47个 ,与筛选文库时 2种载体各自
的单克隆总数 2 496 ,2 880个的比例基本相当 。
A.小赖麦附加系 Line24与小麦杂交形成的小麦-多枝赖草单体异附加系减数分裂中期 I分裂相 FISH结果[ 7] ,黄色染色体为附加的一条外源多
枝赖草染色体;B.小赖麦附加系Line15有丝分裂中期分裂相 FISH结果[ 10] ,黄色染色体为附加的一对外源多枝赖草染色体;C.小赖麦易位附加
系 Line14有丝分裂中期分裂相 FISH 结果[ 11] ,黄色部分为易位附加的一对外源多枝赖草染色体臂;D.小赖麦附加系 Line24有丝分裂中期相差
显微镜下普通细胞学分析图片;E.TAC克隆 15J18(红色)和 09I02(绿色)对小赖麦附加系 Line24有丝分裂中期分裂相 FISH 结果;F.TAC克隆
15J18(红色)和 09I02(绿色)对多枝赖草减数分裂中期 I分裂相 FISH结果。箭头所指为杂交信号点。
A.The FISH result at meiosis metaphase I of wheat-Leymus multicaulis monosomic addit ion lines formed by cross between Line24 and wheat[ 7] , a single chromo-
some of Leymus multicaulis shows yellow;B.The FISH result at mitosis metaphase of Line15[ 10] , a pair of chromosomes of Leymus multicaulis show yellow;C.The
FISH result at mitosis metaphase of Line14[11] , a pair of chromosome arms of Leymus multicaulis show yellow;D.The cytological figure at mitosis metaphase of
Line24 under phasecontrast microscope;E.The FISH result at mitosis metaphase of Line24 with the probes of Leymus mult icaulis TAC clones 15J18(red)and
09I02(green);F.The FISH result at meiosis metaphaseI of Leymus multicaulis with the probes of Leymus multicaulis TAC clones 15J18(red)and 09I02(green).
Arrows indicate the hybridization signals.
图 3　小赖麦(易位)附加系 Line24、Line15 和 Line14 的荧光原位杂交(FISH)图以及 TAC
克隆 15J18(红色)和 09I02(绿色)对小赖麦附加系 Line24和多枝赖草的双色荧光原位杂交图
Fig.3　The FISH results of Line24 , Line15 and Line14 , and the double-color FISH results of Leymus
multicaulis and Line24 with the probe of Leymus multicaulis TAC clones 15J18(red)and 09I02(green)
2.3　TAC克隆 15J18 和 09I02在多枝赖草和小赖
麦附加系 Line24染色体上的定位
从连锁群 Line24的 wms133-310 bp标记为探
针筛选到的全部 19个阳性克隆中 ,任意选取分别以
pYLTAC17 ,pYLTAC747H 为载体的克隆各 1 个 ,即
15J18 ,09I02 ,按照宋琳琳[ 17]的方法扩大培养提取质
粒 DNA , 分别以 Biotin-1l-dUTP(红)和 Digoxingenin-
11-dUTP(绿)进行缺口平移法标记 ,同时与小赖麦附
加系 Line24 、多枝赖草以及小麦亲本的细胞分裂期
染色体制片进行双色荧光原位杂交(Double-color
10　 华　北　农　学　报 23卷
FISH)。结果(图 3-E , F)显示 , 在小赖麦附加系
Line24与多枝赖草的有丝分裂和减数分裂中期分裂
相中 ,均有 2条染色体的近着丝粒处显示出杂交信
号点 ,且红色信号点和绿色信号点距离很近 ,部分重
叠处显示为黄色信号点 ,从而直观地表明 TAC 克隆
15J18(红)和 09I02(绿)确实是对应于同一个 SSR标
记的2个克隆;与此同时 ,小麦亲本中国春和丰抗
13的分裂相上却没有任何杂交信号点 ,说明小赖麦
附加系 Line24中所显示杂交信号的 2条染色体(图
3-E)与多枝赖草中显示杂交信号的 1对染色体(图
3-F)确实是同一对多枝赖草染色体 ,特定对应于
wms133-310 bp的TAC克隆 15J18(红)和 09I02(绿)
就位于附加在 Line24的该对多枝赖草染色体连锁
群上。此结果直观地验证了文库筛选结果的准确
性 ,肯定了该文库的前期构建和筛选工作 ,并为各条
抗逆染色体的识别鉴定和相关抗逆基因的精细定位
奠定了基础。
3　讨论
对基因组文库进行筛选 ,目前基本有两种策略。
大多数研究者所采用的策略 ,是每次只针对某种目标
基因 ,用与其密切相关的探针对文库进行筛选。目前
利用TAC 载体已成功构建的拟南芥[ 18] 、普通小麦中
国春(AABBDD)[ 19] 、小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系[ 20] 、
抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系 HW642[ 21] 、百脉
根[ 22] 、番茄[ 23] 、桃[ 24]等的基因组文库 ,其筛选过程
均采用这种策略 。
另一种筛选策略 ,则是首先针对整个基因组中
的所有连锁群而进行系统筛选。如 Feng Jiuhuan
等[ 25]在建好向日葵(X=17)的 BAC 和 BIBAC基因
组文库后就根据分布于全部 19个连锁群(超出的 2
个有疑问)上的 RFLP 标记设计了 36个重叠寡核苷
酸(Overlapping oligonucleotides ,Overgos)探针 ,对所建
文库进行系统筛选获得了对应于其中 33个探针的
特定分布于各连锁群上的 195个阳性克隆 ,为向日
葵基因组的全面研究提供了基本资源。
本研究综合考虑这两种筛选策略 ,针对多枝赖
草(X=14)全部 14个连锁群中载有 4种抗逆基因的
3对抗逆染色体连锁群 ,同时以耐黄矮病耐蚜虫小
赖麦附加系 Line24 、耐盐耐旱小赖麦附加系 Line15 、
耐盐小赖麦易位附加系 Line14中附加的多枝赖草
染色体上分别涉及 3个抗逆基因的 6个 SSR分子标
记为探针 ,对 TAC文库进行筛选 ,最终在同一批试
验中获得了分属于 3个抗逆染色体连锁群的 77个
阳性克隆 ,既保证抗逆性重点 ,又提高了文库筛选的
效率 ,为明确不同抗逆基因之间的相互关系 ,揭示多
枝赖草适应逆境的分子细胞遗传学机制奠定了基
础。
从筛选结果发现 ,77个阳性克隆中 ,有 88.31%
(68/77)的克隆各自被唯一的一个探针筛选到;而剩
余 11.69%(9/77)的克隆 ,则同时为分布于不同连锁
群间或同一连锁群内的不同探针筛选到。这一结果
与 Romanov[ 26]和 Feng[ 25]的研究结果相似 ,他们认为
这些共有的克隆可能代表了基因组中的重复区域或
者只是杂交筛选操作过程中的偶然失误。我们在赞
同这种分析的同时 ,还猜想在本研究中的这些共有
克隆或许正是相关抗逆基因的集中分布所在 ,是研
究不同抗逆基因之间相互关系的重要克隆 ,这有待
今后研究中重点关注与加以验证 。
致谢:衷心感谢中科院遗传发育所景健康老师为本研究
供高密度克隆膜的制备提供检测设备和大力指导 , 中国农业
科学院作物科学研究所张学勇研究员为本研究中的 FISH 试
验提供检测设备和宝贵经验 , 衷心感谢中国农业科学院作物
科学研究所陆昆同学在 FISH 实验检测过程中提供的帮助。
参考文献:
[ 1] 　葛荣朝 ,赵茂林 , 李国亮.赖草属的优良基因导入小麦
的研究进展[ J] .河北师范大学学报:自然科学版 ,
2001 , 25(4):512-516.
[ 2] 　Plourde A , Comeau A , Fedak G , et al .Intergeneric hybrids of
Triticum aestivum × Leymus multicaulis[ J] .Genome , 1989 ,
32(2):282-287.
[ 3] 　董玉琛 ,郑殿升.中国小麦遗传资源[ M] .北京:中国农
业出版社 , 2000:149-206.
[ 4] 　赵茂林.普通小麦-多枝赖草二体附加系的选育与鉴定
[ D] .北京:中国农业科学院 , 1993.
[ 5] 　赵茂林 ,周荣华 , 董玉琛.普通小麦-多枝赖草二体附加
系的创建及其细胞遗传学研究[ C] //何中虎.第三届全
国青年作物遗传育种学术会论文集.北京:中国农业科
技出版社 , 1994:82-85.
[ 6] 　Zhao M L, Zhou R H , Jia J Z , et al.Isolation and identifica-
tion of wheat-Leymus multicaulis addition lines by use of bio-
chemical markers[ C] // Proceeding of 8th International Wheat
Genetics Symposium.Beijing:China Agricultural Scitech
Press , 1995:827-32.
[ 7] 　赵茂林 , 李瑞芬 , 梁宏霞 ,等.小麦-多枝赖草单体异附
加材料减数分裂期外源染色体的行为研究[ J] .自然科
学进展 , 2001 , 11(9):945-949.
[ 8] 　刘　艳 ,钱幼亭 ,赵茂林 , 等.多枝赖草及其转育后代对
大麦黄矮病毒 PAV和 GAV 株系的抗性研究[ J] .植物
病理学报 , 2002 , 32(3):247-251.
[ 9] 　郭光艳 , 李瑞芬 , 张敬原 ,等.利用 SSR鉴定普通小麦-
多枝赖草二体异附加系 Line24中外源染色体同源群的
5期 张　艳等:载有抗逆性基因的多枝赖草染色体连锁群的特定TAC克隆的鉴定 11　
归属[ J] .华北农学报 , 2004 , 19(4):14-17.
[ 10] 　葛荣朝 ,张敬原 , 赵宝存 , 等.一个耐盐小麦-多枝赖草
二体异附加系外源染色体的鉴定[ J] .中国农业科学 ,
2006 , 39(1):193-198.
[ 11] 　张敬原 ,赵茂林 , 葛荣朝 , 等.普通小麦-多枝赖草耐盐
易位系的鉴定[ C] //中国的遗传学研究-中国遗传学
会第七次全国代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编.
北京:中国遗传学会编 , 2003:91-92.
[ 12] 　徐粤宇 ,周玉雷 , 宋琳琳 , 等.多枝赖草基因组可转化
人工染色体(TAC)文库的构建和鉴定[ J] .中国科学:C
辑 , 2008 , 38(4):1-9.
[ 13] 　Röder M S , Korzun V ,Wendehake K , et al.A microsatellite
map of wheat[ J] .Genetics , 1998 , 149:2007-2023.
[ 14] 　Röder M S , Plaschke J , König S U, et al.Variability and
chromosomal location of microsatellites in wheat[ J] .Molec-
ular and General Genetics.1995 , 246:327-333.
[ 15] 　Liu Zhao , Yue Wei , Dong Yu-shen , et al.Identification and
preliminary analysis of several centromere-associated bacteri-
al artificial chromosome clones from a diploid wheat library
[ J] .Journal of Integrative Plant Biology , 2006 , 48(3):348
-358.
[ 16] 　J 萨姆布鲁克 , 黄培堂译.分子克隆实验指南[ M] .3
版.北京:科学出版社 , 2002:508.
[ 17] 　宋琳琳.可转化人工染色体(TAC)文库载体 DNA 制备
的研究[ D] .北京:首都师范大学 , 2006:24-27.
[ 18] 　LIU Yao-guang , Shirano Y , Fukaki H , et al.Complementa-
tion of plant mutants with large genomic DNA fragments by a
transformation- competent artificial chromosome vector accel-
erates positional cloning[ J] .Proc Natl Acad Sci USA(Plant
Biology), 1999 , 96:6535-6540.
[ 19] 　LIU Yao-Guang , Nagaki K , Fujita M , et al .Development of
an efficient maintenance and screening sy stem for large-in-
sert genomic DNA libraries of hexaploid wheat in a transfor-
mation- competent artificial chromosome(TAC)vetor [ J] .
Plant J , 2000 , 23(5):687-695.
[ 20] 　秦跟基 ,陈佩度 , 刘耀光 , 等.用克隆池 PCR法筛选小
麦-簇毛麦易位系 6VS/ 6AL基因组 TAC 文库获得抗病
基因候选克隆[ J] .生物工程学报 , 2002 , 18(3):313-
317.
[ 21] 　王晓萍 , 张增艳 , 张群宇 , 等.抗黄矮病小麦—中间偃
麦草易位系基因组可转化人工染色体文库的构建及
初步筛选[ J] .遗传学报 , 2002 , 29(8):712-718.
[ 22] 　郭熙志 ,刘耀光 ,罗　达.以可转化人工染色体(TAC)
载体为基础的百脉根基因组文库的构建及筛选[ J] .
植物生理与分子生物学学报 , 2004 , 30(2):234-238.
[ 23] 　Qu S , Coaker G , Francis D , et al .Development of a new
transformation-competent artificial chromosome(TAC)vector
and construction of tomato and rice TAC libraries[ J] .
Molecular Breeding , 2003 , 12:297-308.
[ 24] 　Liang F S , Zhang K C , Yu Z W , et al.Construction , charac-
terization , and screening of a Transformation-Competent Arti-
ficial Chromosome library of peach[ J] .Plant Molecular Biol-
ogy , 2004 , 22(3):37-48.
[ 25] 　Feng Jiu-huan , Vick , Brady A , Lee Mi-Kyung , et al.Con-
struction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and i-
dentification of linkage group-specific clones by overgo hy-
bridization[ J] .Theoretical and Applied Genetics , 2006 , 113
(1):23-32.
[ 26] 　Romanov M N , Price J A , Dodgson J B.Integration of animal
linkage and BAC contig maps using overgo hybridization[ J] .
Cytogenet Genome Res , 2003 , 101:277-281.
12　 华　北　农　学　报 23卷