全 文 ：52　 草　业　科　学 24卷 10期
10 /2007 PRAT ACULT URA L SCIENCE Vol. 24 , No. 10
多枝赖草高分子量核 DNA的有效制备
周玉雷1 ,徐粤宇2 ,赵茂林3 ,曹致中1 ,王志平4
(1.甘肃农业大学草业学院 ,甘肃 兰州 730070;2.首都师范大学生命科学学院 ,北京 100037;
3.北京市农林科学院农业生物技术研究中心 ,北京 100089;4.北京市土肥工作站 ,北京 100029)
摘要:以多枝赖草 Leymus multicaulis黄化苗幼嫩叶片为材料 , 在液氮中研磨成粉末 ,加入冰冷的细胞核抽
提缓冲液 ,经一系列钢制细胞筛过滤 , 离心分离细胞核 ,相差显微镜镜检后 , 用低熔点琼脂糖包埋 ,蛋白酶 K
原位裂解 ,经脉冲场电泳分离 , 用 1%低熔点琼脂糖回收获得了较纯净的分子量大于 2 Mb 的核 DNA ,
Southern杂交显示没有叶绿体和线粒体 DNA 的污染。利用该方法制备的高分子量核 DNA , 可用于后续可
转化人工染色体(T AC)文库的构建和基因组分析。
关键词:多枝赖草;高分子量核 DNA;脉冲场电泳
中图分类号:S543+. 9;Q781　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2007)10-0052-05
*　多枝赖草 Leymus mult icaulis(2n=4x=28 ,
XmXmNsNs)隶属赖草属 ,多年生 ,是我国新疆重
要天然牧草 , 被牧民认为是头等优良的饲用禾
草[ 1] 。它分布于盐渍化荒漠草甸 ,目前已被证实
具有突出的耐干旱 、耐盐碱 、耐黄矮病 、耐蚜虫 、耐
瘠薄 、耐污染等优异抗逆特性[ 2 , 3] ,可以为小麦遗
传改良提供丰富的基因资源[ 4] 。为了分离得到上
述优良基因 ,准备构建多枝赖草大片段基因组文
库 ,而高纯度 、高质量的大分子量(HMW) 核
DNA 的获得 ,又是对基因组进行分析和构建大片
段基因组文库的前提[ 5] 。前人通过低熔点琼脂糖
包埋完整细胞核和脉冲场凝胶电泳的方法已经获
得了高粱[ 5] Sorghum bicolor ,拟南芥 Arabidopsis
thaliana和水稻[ 6-8] Oryza sativa ,番茄[ 9] Lycop-
ersicon esculentum ,小麦[ 10] Trit icum aest ivum ,玉
米 Zea mays 、大豆 Glycina max 、苹果[ 10 , 11] Malus
pumila ,桃 Prunus persica var. 、李 Prunus sal ic-
ina var. 、杏 P. simonii 、樱桃 Cerasus conradinae
和柿[ 11] Diosp yros kaki var. , 小麦一簇毛麦
Haynald ia v il losa 6VS /6A L 易位系[ 12] ,抗黄矮
病小麦 - 中间偃麦草 Thinop yrum intermedium
易位系 Hw642[ 13] , 籼稻 O. sat iva subsp 明恢
63[ 14] ,桃[ 15] P. persica ,百脉根[ 16] Lotus cornicu-
latus 等植物的高分子量核 DNA 。为此参考前人
的方法 ,并加以适当优化来获得多枝赖草的高分
子量核 DNA ,用于基因组 DNA 的分析和可转化
人工染色体(TAC)基因组文库构建及筛选利用 。
1　材料与方法
1. 1 材料 　样品是大田试验小区中修剪留茬
1 ～ 3 cm 的经报纸覆盖黄化的多枝赖草再生苗的
幼嫩茎叶 ,用冰盒取回后 ,在液氮中研磨成粉状存
于 EP 管中 ,放 - 80 ℃冰箱中保存备用 。
1. 2 试验方法
1. 2. 1细胞核分离　根据 Liu等[ 8] 的程序分离细
胞核 ,并作部分优化:取 25 g 多枝赖草黄化苗的
幼嫩叶片粉末 ,加入到 250 mL 冰上预冷的核抽
提缓冲液[ 10 mmol /L Tris-HCI (pH 值 9. 5),10
mmo l /L EDTA(pH 值 8. 0), 100 mmol /L 氯化
钾 ,0. 5 mol /L 蔗糖 , 4. 0 mmol /L 亚精胺 , 1. 0
mmo l /L 精胺 , 0. 1%β-巯基乙醇] 的烧杯中 ,混
匀 ,冰浴 10 min 。然后依次过 30 、65 、180 、300目
经 75%酒精洗涤 、过紫外灭菌的钢制细胞筛 ,滤
液分装入冰上预冷的 50 mL 离心管 , 4 ℃, 2 000
g 离心 10 min ,弃上清液 。用 5 mL 核抽提缓冲
液悬浮沉淀 ,转入冰上预冷的 10 mL 离心管 ,同
样条件离心 10 min ,弃上清液。用 5 mL 不含 β-
* 收稿日期:2007-04-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370905和 30571135);
北京市自然科学基金资助项目(5032009)
作者简介:周玉雷(1976-),男(蒙古族),内蒙古赤峰人 , 在
读博士生 ,主要从事牧草遗传育种方向的研究。
E mai l:yuleizh ou@126. com
通讯作者:赵茂林　E m ail:Zhaomaolin@baafs. net . cn
曹致中　E m ail:caozz@gsau . edu. cn
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巯基乙醇的核抽提缓冲液悬浮沉淀 ,同样条件离
心 10 min ,弃上清液 ,重复此步骤 2次。加入 1. 0
mL 不含 β-巯基乙醇的核抽提缓冲液 ,用剪去枪
尖的移液枪轻轻悬浮细胞核 ,置冰上准备镜检 。
1. 2. 2完整细胞核的观察　取 5 μL 细胞核悬浮
液于 0. 25 mL EP 管中 ,加入 95 μL 不含 β-巯基
乙醇的核抽提缓冲液(即稀释 20倍)后轻柔混匀 ,
取 10 μL 滴到血球计数板上盖玻片的边缘 ,置于
40×相差显微镜下观察核的完整性并照相。
1. 2. 3 细胞核的低熔点琼脂糖胶块包埋及裂解　
用不含 β-巯基乙醇的核抽提缓冲液 80 ℃水浴配
制 5 mL 1. 4%的低熔点琼脂糖凝胶 ,将装有细胞
核悬浮液的离心管置于 45 ℃水浴中 5 min。向
细胞核悬浮液中加入等体积的预热到 45 ℃的
1. 4%的低熔点琼脂糖凝胶液 ,轻柔混匀后 ,迅速
用剪去枪尖的枪头将混合液加到冰上预冷的
plug mold中 ,每块胶块约含有 100μL 的混合液 ,
同时防止气泡产生。将 plug mold放在 4 ℃冰箱
凝固 1 h 。
取出每个小槽的凝胶块于 50 mL EP 管中 ,
加入 10倍体积含 0. 2 mg /mL 蛋白酶 K(用时加
入)的裂解液[ 1% sarkosy l(十二烷基肌胺酸钠),
0. 25 mo l /L EDTA(pH 值 8. 0)] 50 ℃杂交炉上
轻柔振荡 24 ～ 32 h ,12 h 更换 1次裂解液 。去除
裂解液 ,加入 5倍体积的 TE( pH 值 8. 0)溶液 ,
室温放置 1 h ,更换 TE ,冰上清洗 3次 ,每次 1 h ,
4 ℃, TE中保存 。
1. 2. 4裂解后琼脂糖胶块质量的脉冲场电泳检测
　试验使用 Bio-Rad 公司的 CHEF M apper脉冲
场电泳仪 。用 0. 5×TBE 配置 1%的琼脂糖凝
胶 ,胶块分 1和 1 /2块放入 0. 5×TBE中洗涤 30
min ,然后塞入加样孔中 , 并用融化的琼脂糖密
封。脉冲电泳参照 Yeast Chromosome PFG
Marker(NEB)的条件:温度 15 ℃,泵 70 ,第 1阶
段(block1):运行 15 h ,运行状态 1(state1)的电
压 6 V /cm ,角度 60°,脉冲时间 70 s;运行状态 2
(state2):电压6V /cm ,角度 - 60°,脉冲时间70 s;
第 2 阶段(blo ck2):运行 11 h , 运行状态 1
(state1)的电压 6 V /cm , 角度 60°, 脉冲时间
120 s ,运行状态 2(state2)的电压 6 V /cm ,角度
- 60°,脉冲时间 120 s 。
电泳结束后 ,用终浓度 0. 5 μg /mL 的溴化乙
锭(EB) 0. 5×TBE溶液浸染30 min ,凝胶成像仪
检测并拍照。
1. 2. 5 2 M b级以上 DNA 胶块的回收　用与上述
琼脂糖胶块质量检测相同的脉冲场电泳参数进行
l%的低熔点琼脂糖凝胶电泳 ,把要回收的 DNA
胶块(3 ～ 13道)用盖玻片切下暂放在 0. 5×TBE
中 ,将 1 、2 、14 、15道用浓度为 0. 5 μg /mL 的溴化
乙锭(EB)电泳缓冲液(0. 5×TBE)溶液浸染 35
min后凝胶成像 ,拍照后在紫外线下标记 1 、2 、
14 、15道上 2 M b的位置 ,取出后拼接复原成原来
的电泳全胶状态 ,对照标记位置将 3 ～ 13 道的 2
Mb 以上的 DNA 琼脂糖胶横切回收于 0. 5
mol /L pH 值为 8. 0的 EDTA 溶液中 ,保存于 4
℃冰箱。
1. 2. 6 2 M b 级以上 DNA 的细胞器污染程度的
Southern 杂交　用 Agarase 消化胶块裂解后和
脉冲电泳回收纯化的2 M b以上DNA的 LMP 凝
胶[ 14] ,将这 2种液体直接点在硝酸纤维素膜上 ,
裂解的 DNA 重复 1次 。以高粱叶绿体 psbA 基
因和玉米线粒体 atp6 和 atp9 基因为阳性对照 ,
并以此为混合探针 ,利用 DIG High Prime DNA
Labeling and Detection S tar ter Ki t II试剂盒进行
Southern杂交检测制备的 2 M b核 DNA 中细胞
器 DNA 的污染状况。
2　结果与分析
2. 1 试验材料　在生长季节 ,在多枝赖草田间
试验小区中 , 浇过透水后立即修剪 , 留茬 1 ～ 3
cm 。然后用报纸严密覆盖 ,经过 3 ～ 5 d就得到了
幼嫩的多枝赖草黄化再生苗叶片(图 1)。多次回
收即可满足后续试验 。
2. 2 细胞核的完整性　获得完整的细胞核是
制备高分子量核 DNA 的前提条件。从图 2可以
看出 ,通过这种方法可以获得大量较完整的多枝
赖草细胞核 ,供制备高分子量核 DNA 。
2. 3 裂解后琼脂糖胶块质量的脉冲场电泳
检测　胶块经脉冲场电泳(CHEF Mapper System
(BioRad))检测 ,结果(图3)表明:裂解后的琼脂
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图 1　多枝赖草黄化再生苗叶片
图 2　多枝赖草黄化苗的细胞核(×40)
糖胶块中多枝赖草核 DNA 分子量从大到小呈连
续分布 ,其中 2 Mb级以上的高分子量 DNA 占有
很高的比例 ,估测每胶块中含 30 ～ 45 μg 。小片
段主要分布在 0. 8 M b以下。
2. 4 2 Mbp 级以上高分子量核 DNA 胶块
的回收　为了构建高质量的多枝赖草核基因组
DNA文库 ,必须有纯净的高分子量核 DNA ,如图 4
所示 ,将 2 Mb以上到加样孔间的包含多枝赖草高
分子量核 DNA 的低熔点琼脂糖胶横切回收保存。
2. 5 2 Mb级以上 DNA 的细胞器污染程度
的检测　以高梁叶绿体 psbA 、玉米线粒体 a tp6
和 atp9 基因为混合探针 ,进行 Southern 杂交的
结果如图 5 ,胶块裂解后(脉冲电泳回收纯化前)
LMP 凝胶中的 DNA 有阳性信号 , 回收的 2 M b
以上的 DNA 没有阳性信号。说明通过脉冲电泳
进一步纯化 Mb 级 DNA ,可以有效地去除杂质
DNA 的污染 ,获得较纯的大分子量核 DNA 。
3　讨论
使用幼嫩材料利于获得高分子量核 DNA[ 10] 。
图 3　脉冲场电泳检测多枝赖草高分子量 DNA的大小
　注:1)酵母染色体 PFG 分子量标准(NEB)1. 5 μg;2)1
块胶块;3)1 /2 块胶块。
图 4　脉冲场电泳回收多枝赖草 2 Mb级
以上的高分子量核 DNA
　注:a)1 - 2、14 - 15 河道部分的电泳胶切下后 EB 染色
检测;b)从切下后没有 EB 染色的 3 - 13 河道部分的电泳
胶中回收会有 2 M b 级以上 DNA 的胶块。
图 5　叶绿体和线粒体 DNA污染程度的检测
根据实践经验 ,多枝赖草种子发芽慢 ,且叶片细
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小 ,室内发芽难以长出足够量的黄化幼嫩叶片供
DNA 提取;室外无性繁殖虽快 ,但田间正常生长
条件下的多枝赖草“幼嫩”叶片的木质化程度太
高 ,往往叶鞘居多 ,不利于高质量 DNA 提取。而
在生长季节 ,采用田间覆盖的方式只需 3 ～ 5 d即
可获得多枝赖草再生黄化苗 ,经多次回收就迅速
得到了足够实验使用的多枝赖草再生黄化苗的幼
嫩茎叶。
在细胞核分离的过程中 ,采用不锈钢质细胞
筛进行分级过滤 ,较使用 2 层纱布[ 11] 或 2 层纱布
和 1层 Miracloth[ 10] 以及 4 层纱布和 2 层 mira-
cloth
[ 17] 的方法更方便。由于细胞筛减少了对液
体的吸附作用 ,可减少细胞核损失。在离心过程
中较 LIU 等[ 6] 的方法增加 2 次不含 β-巯基乙醇
的核抽提缓冲液洗涤 ,利于纯化细胞核匀浆 ,从而
获得了较为完整和纯净的细胞核。从图 2可以看
出 ,细胞核中还有少量杂质 ,这些微量杂质在经过
裂解过程后 ,通过脉冲场电泳进一步去除。
脉冲场凝胶电泳具有较强的分辩能力[ 18] 可
以较好地区分不同分子量的 DNA ,同时还可进一
步排除多糖 、酚类等抑制物及叶绿体 、线粒体
DNA[ 11] ,从而获得较纯的高分子量核 DNA 。每
胶块(plug)中 2 Mb 级以上的高分子量核 DNA
的产量 ,高达 30 ～ 45 μg 。
细胞器 DNA 的污染会降低文库的实际容载
量 ,并造成染色体步移向错误方向进行[ 8 , 19] 。一
般用线粒体和叶绿体的 DNA 探针通过 Southern
杂交的方法对构建文库的 DNA 进行检测 。研究
以高梁叶绿体 psbA 、玉米线粒体 atp6和 atp9 基
因为混合探针对胶块裂解后的 LMP 凝胶中的
DNA 和脉冲电泳回收的 2 M b 以上 DNA 进行
S outhern杂交 ,结果证明了回收纯化的 2 Mb 以
上 DNA 没有细胞器 DNA 的污染。由此可以推
知 ,所建文库也排除了存在污染的可能性。
实验室通过这种经过优化的方法快速制备了
大量的高分子量核 DNA ,经进一步纯化后用于
DNA 的部分酶切 ,并构建了多枝赖草可转化人工
染色体(TAC)基因组文库(另文发表)。
4　小结
4. 1 通过覆盖黄化的方法快速获得了足够的多
枝赖草幼嫩叶片 ,加快了试验进程 。
4. 2 利用不锈钢制细胞筛进行过滤 , 方便快捷 ,
减少细胞核损失。
4. 3 通过脉冲场凝胶电泳回收 2 M b 级以上的多
枝赖草高分子量核 DNA 的方法 ,获得了较纯净
的 DNA 。
参考文献
[ 1] 　王世金 , 李健华. 小麦族植物作为牧草种质资源的
初步评价[ J] .草业科学 , 1993 , 10(1):60-69.
[ 2] 　赵茂林.普通小麦- 多枝赖草二体附加系的选育与
鉴定[ D] . 北京:中国农科院研究生院 , 1993.
[ 3] 　王惠宁 ,董淑敏 ,赵茂林. 赖草属植物的优良特性及
其研究与利用[ J] .北京农业科学 , 1997 ,(增刊):20-
25.
[ 4] 　葛荣朝 , 赵茂林 , 李国亮. 赖草属的优良基因导入
小麦的研究进展[ J] . 河北师范大学学报(自然科学
版), 2001 ,(4):512-516.
[ 5] 　Woo S S , Jiang J , GIU B S , et al . Construction and
characterization of a bacterial a rtificial chromosome
library o f So rghum bicolo r[ J] . Nuc1. Acids. Res. ,
1994 , 22:4922-4931.
[ 6] 　Liu Y G , Whittier R F . Rapid prepa ration of mega-
ba se plant DNA from nuclei in agar ose plug s and
micr obeads[ J] . Nucleic Acids Res. , 1994 , 22:2168-
2169.
[ 7] 　Zhang H B , Choi S , Woo S S , et al. Construction and
characterization o f tw o rice bacte rial a rtificial ch ro-
mosome libr aries f rom the parellts of a permanent
recombinant inbred mapping popula tion [ J] . Mo l.
Breed. , 1996 ,(2):11-24.
[ 8] 　邱芳 ,伏健民 ,王斌. 从植物细胞核分离大分子量核
DNA[ J] . 植物学报 , 1999 , 41(11):1204-1207.
[ 9] 　Zhang H B , Zhao X , Ding X , et al. P repa ration o f
megabase-size DNA f rom plant nuclei[ J] . P lant J. ,
1995 , 7:175-184.
[ 10] 　Liu Y G , Kiyo taka Nagaki , Masako Fujita , et al.
Development of an efficient maintenance and
56　 草　业　科　学(第 24卷 10期) 10 /2007
screening sy stem for lar geinsert g enomic DNA li-
brarie s o f hexaploid w heat in a transfo rmation.
compe tent ar tificial chromosome (TAC) vector
[ J] . The Plant Journal , 2000 , 23(5):687-695.
[ 11] 　王倩 , 曲雪萍. 一种有效制备果树高分子量 DNA
的方法[ J] . 高技术通讯 , 2000 , 10(4):1-3.
[ 12] 　方玉达 ,刘耀光 , 吴豪 ,等. 小麦一簇毛麦 6VS /6AL
易位系可转化人工染色体(TAC)文库的构建[ J] .
生物工程学报 , 2000 , 16(4):433-436.
[ 13] 　王晓萍 , 张增艳 ,张群宇 , 等.抗黄矮病小麦—中间
偃麦草易值系基因组可转化人工染色体文库的构
建及初步筛选[ J] . 遗传学报 , 2002 , 29(8):712-
718.
[ 14] 　Liu Y G , Liu H , Chen L , et al . Development o f new
transformation - competent ar tificial chromosome
vecto rs and rice genomic libr aries for efficient gene
cloning[ J] . Gene , 2002 , 282(1-2):247-255.
[ 15] 　L iang F S , Zhang K C , Yu Z W , et al. Constr uc-
tion , Cha racterization , and Screening o f a T rans-
forma tion-Compe tent A r tificial Chromosome L i-
brary of Peach[ J] . P lant M olecula r Bio log y Re-
po rter , 2004 , 22:37-48.
[ 16] 　郭熙志 , 刘耀光 , 罗达. 以可转化人工染色体
(TAC)载体为基础的百脉根基因组文库的构建及
筛选[ J] . 植物生理与分子生物学学报 , 2004 , 30
(2):234-238.
[ 17] 　殷剑美 , 张天真. 基于棉花 BAC 文库的大片段核
DNA 的提取方法[ J] . 分子植物育种 , 2004 , 2(3):
354-357.
[ 18] 　Schw artz D C , Cantor C R. Separation o f y east
chromosome - sized DNAs by pulsed-field g radient
gel electropho resis[ J] . Cell , 1984 , 37:76-75.
[ 19] 　Wang G L , Ho lsten T E , Song W Y , et al . Con-
structur e of a rice bacterial ar tificia l chromosome
library and identification of clones linked to the
Xa-21 disease resistance locus[ J] . P lant J. , 1995 ,
(7):525-533.
An efficient protocol for extraction of high molecular weight nuclear DNA from Leymusmult icaulis
ZHOU Yu-lei1 , XU Yue-yu2 , ZHAO M ao-li3 ,CAO Zhi-zhong1 , WANG Zhi-ping 4
(1. College of G rassland Science ,Gansu Ag ricultural University , Lanzhou 730070 ,China;
2. College of L ife Sciences ,Capi tal Normal University , Beijing 100037 , China;
3. Beijing Ag ricultural Bio techno logy Resea rch Center , Bei jing Academy o f
Ag riculture and Fo rest ry Sciences , Beijing 100089 ,China;
4. Beijing Soi l and Fertilize r Wo rking station , Beijing 100029 ,China)
Abstract:The etio lated seedling s of Leymus mult icaul is we re homogenized by g rinding in liquid ni t ro-
gen. The nuclei w ere iso lated by suspending the powder in ice-cold nuclei iso lation buf fe r , fil tering by
a se ries of steeliness cell g riddle on ice and centrifuging before pho to graphed under phase-contrast m i-
croscope and embedded in low melting point (LMP) agarose. Af te r digestion wi th proteinase K in si tu
and iso lation by pulsed-field gel elect ropho resis , pure HMW nuclear DNA over 2 M b w as isolated.
S outhern hybridization indicated the re w as no pro toplast and mitochondria DNA contaminat ion. The
HMW nuclear DNA prepared using this method w as suitable fo r t ransfo rmation artificial chromosome
(TAC) library and genome analy sis of L. mult icaulis
Key words:Leymus multicaulis;high molecular w eight nuclear DN A;pulsed-f ield gel elect ropho resis