全 文 ：收稿日期:2003-12-18
基金项目:国家自然科学基金(39700099);北京市科技新星计划(855871100)资助
作者简介:郭光艳(1974-),女 ,河北邯郸人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事小麦遗传育种的研究工作 ,赵茂林为通讯作者。
小麦微卫星引物对多枝赖草基因组
DNA扩增的研究
郭光艳1 ,李瑞芬2 ,张敬原2 ,葛荣朝1 ,赵茂林2 ,黄占景1 ,沈银柱1
(1.河北师范大学生命科学学院 ,河北 石家庄　050016;2.北京市农林科学院 ,北京农业生物技术研究中心 ,北京　100089)
　　摘要:用 227 对小麦微卫星引物对多枝赖草基因组 DNA进行 PCR扩增 ,共有 81 对引物有扩增产物 ,占所用引物
的 35.7%。这 81 对小麦微卫星引物涉及 101 个微卫星位点 , 覆盖了小麦全部 7 个部分同源群。其中有 76 对引物可
在多枝赖草和中国春及丰抗 13 间扩增出多态性标记。这说明多枝赖草虽然和普通小麦亲缘关系较远 ,但小麦 SSR
引物还是可以在多枝赖草上应用的 ,这不仅拓宽了小麦微卫星引物的使用范围 , 更重要的是为使用小麦微卫星引物
对普通小麦与多枝赖草远缘杂交种质材料进行深入研究奠定了基础。
关键词:小麦微卫星引物;多枝赖草
中图分类号:S512.01　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2004)01-0001-04
Amplifying Products from Leymus multicaulis Using
Wheat Microsatellite Prime Pairs
GUO Guang-yan1 , LI Rui-fen2 , ZHANG Jing-yuan2 ,GE Rong-chao1 ,
ZHAO Mao-lin2 , ,HUANG Zhan-jing1 , SHEN Yin-zhu1
(1.College of Life Science ,Hebei No rmal Universi ty ,Shijiazhuang　050016 ,China;
2.Beijing Ag riculture Biotechnology Research Center ,Beijing Academy of Agricultural and
Forest ry Science ,Beijing 　100089 ,China)
Abstract:227 wheat microsatellite prime pairs were used to amplify products f rom Leymus mul ticaul is.81
prime pairs could amplify scorable product.Those primer pairs involved 101 loci ,dist ributing all seven homoeolo-
gous g roups of w heat.Among them , 76 (account fo r 93.8%)show ed polymorphisms among Leymus mult i-
caulis , and the common wheat varies Chinese Spring and Fengkang No 13.The results show wheat microsatellite
markers can be used in Leymus multicaulis.That no t only w iden the application range of w heat microsatellite
markers ,but also provide the base of researching Tri ticum aestivum-Leymus multicaulis germplasm accessions
w ith w heat microsatellite markers.
Key words:Wheat microsatellite markers;Leymus multicaulis
　　多枝赖草(Leymus multicaulis(Kar.et Kir.)
Tzvel.,2n=4X=28 , XmXmNsNs)是小麦族赖草属
小粒种子类型的一个种 ,广泛分布于欧亚地区 ,在我
国产于新疆。它具有十分发达的根状茎和极强的分
蘖能力[ 1] ,因此具有突出的耐瘠薄 、耐盐碱性[ 2] 、耐
寒性[ 3 , 4] 。同时还对大麦黄矮病毒(BYDV)PAV 和
SGV 株系免疫或高抗[ 1 ,5] 。
1986年 ,袁舟舟在董玉琛研究员的指导下首次
将多枝赖草与普通小麦中国春杂交成功[ 1] ,并进一
步得到了回交一代和回交二代种子。之后周荣华继
续得到了回交二代的自交后代 。1989 年 , Plourde
等也报道得到了普通小麦 Norin29与多枝赖草杂种
华北农学报·2004 , 19(1):1-4
BC3 材料 。1991 ～ 1993 年 ,赵茂林先生从中国春和
多枝赖草 BC2F3-5材料中首次选育出普通小麦———
多枝赖草 12种(缺少第 4 、第 5同源群)15个互不相
同的二体异附加系[ 6～ 8] 。其中 Line24是一个耐黄
矮病耐蚜虫的普通小麦 ———多枝赖草二体异附加
系[ 9] , Line7等高度耐盐[ 6] 。在这之后的几年中 ,赵
茂林等又采用单体异附加系花药培养法 ,以 Line24
为亲本 ,选出了 24个系 26个组合的 44个耐病虫新
种质[ 10 ,11] ;利用抗盐普通小麦-多枝赖草二体异附
加系培育耐盐新种质的工作也正在进行 。尽快对普
通小麦 ———多枝赖草新种质进行准确鉴定 ,才能在
育种中更好地利用这些种质资源 ,因此急需一种简
单而有效的方法 ,对这些新种质进行研究 ,为来源于
多枝赖草的有益基因定位奠定基础 。
1　材料和方法
1.1　材料
本文所用材料多枝赖草 、普通小麦品种中国春
和丰抗 13均由北京市农林科学院北京农业生物技
术研究中心草业生物技术研究室赵茂林副研究员提
供。
1.2　试验方法
按照 Röder等[ 12]发表的微卫星引物序列合成
引物。PCR扩增在 Perkin Elmer 9700 PCR仪上进
行 。反应体系 20μL:含 10 mmol/ L KCl ,8 mmol/L
(NH4)2SO4 , 10 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0), 1.75
mmol/ L MgCl2 , 0.2 mmol/ L dNTP , 1 U taq DNA
聚合酶 , 60 ng 的模板 DNA 和引物 F 、R 各 250
nmol/L ,ddH2O 补至 20 μL。反应条件为94 ℃预变
性 4 min;94 ℃1 min ,50 ℃、55 ℃、或 60 ℃1 min ,
72 ℃1 min循环 35次 ,72 ℃延伸 10 min。PCR扩
增产物于 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,银染检测 。
2　结果与分析
用 227对小麦微卫星标记引物对多枝赖草 、普
通小麦品种中国春和丰抗 13进行 PCR扩增 ,共有
81对引物可从多枝赖草核 DNA 中扩增出产物 ,占
所用引物的 35.7%。其扩增片段大小见表 1。这
81对小麦微卫星引物涉及 101 个微卫星位点 ,覆盖
了小麦全部 7个部分同源群 。其中有 76 对引物可
在多枝赖草和普通小麦品种中国春及丰抗 13间扩
增出多态性标记(引物 WMS120 、WMS219 和
WMS601的扩增结果见图 1)。这说明多枝赖草虽
然和普通小麦亲缘关系较远 ,但小麦 SSR引物还是
可以在多枝赖草上应用的 ,这不仅拓宽了小麦微卫
星引物的使用范围 ,更重要的是为使用小麦微卫星
引物对普通小麦-多枝赖草种质材料进行研究奠定
了基础 。
表 1　小麦微卫星引物从多枝赖草中扩增出特异片段大小
名称 染色体位点 退火温度(℃) 多枝赖草(bp) 名称 染色体位点 退火温度(℃) 多枝赖草(bp)
WMS004 4A 55 240 WMS006 4Bl 55 160
WMS032 3A 55 140 WMS043 7BS 60 125
WMS044 7D 60 145 WMS046 7Bs 60 150
WMS067 5Bl 60 75 WMS070 6B 60 275
WMS072 3Bs 55 280 WMS102 2Ds 60 150
WMS111 7Dl 55 175 WMS112 3Bl , 7Bl 55 370 , 250
WMS120 2Bl 60 205 WMS131 1Bl , 3Bl 60 162 , 110
WMS133 6Bs 60 310 WMS135 1Al 60 125
WMS148 2Bs 60 170 WMS149 4Bl 55 350
WMS156 5A l 60 290 , 270 WMS157 2Dl 60 240
WMS161 3Ds 60 140 WMS162 3Al 60 180
WMS164 1A l 55 105 , 95 WMS165 4As , 4Bl , 4Dl 60 210
WMS179 5A l 55 270 WMS181 3Bl 50 120
WMS190 5Ds 60 175 WMS205 5As , 5Ds 60 160 , 150 , 135 , 120
WMS219 6Bl 60 145～ 130 WMS232 1Dl 55 240 , 150
WMS234 5Bs 55 200 , 178 WMS249 2A , 2Ds 55 180 , 160
WMS257 2Bs 60 190 WMS264 3Bs 60 160 , 145
WMS265 2A l 55 235～ 195 WMS268 1Bl 55 180 , 175
2　 华　北　农　学　报 19卷
续表
名称 染色体位点 退火温度(℃) 多枝赖草(bp) 名称 染色体位点 退火温度(℃) 多枝赖草(bp)
WMS269 5Dl 60 85 , 80 WMS271 5Dl 60 175
WMS273 1Bs 55 270 WMS284 3Bl 60 500
WMS293 5As 55 185 WMS295 7Ds 60 305
WMS301 2Dl 55 175 WMS304 5As 55 180
WMS311 2Al , 2Dl 60 120 , 105 WMS314 3Dl 55 135
WMS319 2Bl 55 370 WMS328 2A 55 155
WMS350 7As , 7Ds 55 415 , 315 WMS359 2As 55 185
WMS361 6Bs 60 120 WMS369 3As 60 170
WMS374 2Bs 60 200 , 197 WMS382 2A l , 2Bl , 2Dl 60 90 , 85
WMS389 3Bs 60 95 WMS391 3Al 55 135 , 125
WMS400 7Bs 60 190 WMS403 1Bl 55 310 , 255 , 175
WMS425 2A 60 380 WMS448 2A 60 230
WMS469 6Ds 60 190～ 155 WMS473 2A 55 350
WMS494 6A 60 235 WMS497 1A l , 2As , 3D 55 280
WMS501 2Bl 60 410 WMS508 6Bs 50 500 , 400 , 290
WMS515 2A , 2Ds 60 90 WMS518 6Bs 55 205 , 190
WMS544 5Bs 55 145～ 130 WMS550 1Bs 55 217
WMS573 7As , 7Bs 50 168 WMS601 4As 60 120
WMS608 2Dl 60 145 , 140 , 135 , 130 WMS614 2As 60 410
WMS630 2Bs 60 90 , 85 WMS639 5A l , 5Bl , 5Dl 55 80
WMS642 1Dl 60 145 WMS644 6Bs , 7Bl 60 123
WMS654 5Dl 55 95 , 85 WMS666 1Al , 3Al , 5A l , 7As 60 75
WMS674 3A 60 130
　注:s指短臂 , l指长臂
1.多枝赖草;2.Line24;3.中国春;4.丰抗 13
图 1　小麦微卫星引物对多枝赖草和小麦材料的扩增
3　讨论
微卫星标记由于在小麦中多态性高 、重复性高
而且是一种共显性标记 ,近年来在小麦研究中被广
泛应用。但小麦微卫星引物在多枝赖草这种亲缘关
系比较远的近缘种中能否应用 ,还未见报道 。利用
小麦微卫星引物能否从多枝赖草扩增出产物 ,还没
有人进行过研究。
至今已证明小麦微卫星引物可在野生二粒小
麦[ 13] 、山羊草属拟斯卑尔脱组[ 14] 、方穗山羊草[ 15] 、
Aegilops markgraf i i[ 16] 、黑麦 、大麦[ 17] 和披碱草[ 18]
等小麦近缘种中应用。但从它们与普通小麦的亲缘
关系看 ,野生二粒小麦(AABB)是普通小麦 A 基因
组和 B基因组的供体 ,山羊草属斯卑尔脱组和方穗
山羊草分别是普通小麦 B基因组和 D基因组的供
体 ,它们和普通小麦有很近的亲缘关系;Aegilops
markgraf ii 、黑麦 、大麦与普通小麦的亲缘关系也比
多枝赖草近 ,所以本论文的研究更加拓展了小麦微
卫星引物的应用范围。
在试验中发现 ,有一些引物在多枝赖草上未能
扩增出产物 。这种现象在用小麦 SSR引物扩增其
它近缘种甚至其他小麦品种时也发生过[ 13 ,17 , 19 ,20] 。
一方面可能是由于近缘种中 SSR引物结合位点发
1期 郭光艳等:小麦微卫星引物对多枝赖草基因组 DNA 扩增的研究 3　
生序列改变(如点突变 ,缺失或插入),这两个物种在
微卫星 DNA 两翼的保守序列不完全相同造成的 ,
另一方面也可能是由于 SSR还是一种新兴的分子
标记技术 ,现在的微卫星标记图谱还不够饱和 。因
此很有必要继续发展新的 SSR标记 ,建立更加饱和
的图谱。
参考文献:
[ 1] 　袁舟舟.小麦近缘植物赖草属(Leymus Hochst.)几个
种的研究[ D] .中国农业科学院研究生院学位论文 ,
1986.
[ 2] 　仲干远.新疆小麦近缘植物的考察和研究[ D].中国
农业科学院研究生院学位论文 , 1984.
[ 3] 　耿以礼.中国主要植物图说(禾本科)[ M] .北京:科学
出版社 , 1959.
[ 4] 　Tzvelev N N.T riticeae Dum[ A] .In:Poaceae USSR
[ M] .Leningrad:Nauka Publishing House, 1976.105-
206.
[ 5] 　Plourde A , Comeau A , Fedak G , et al.Intergeneric hy-
brids of Triticum aestivum X Leymus multicaulis [ J].
Genome , 1989 , 32:282-287.
[ 6] 　赵茂林.普通小麦-多枝赖草二体附加系的选育与鉴
定[ D] .中国农科院研究生院博士学位论文 , 1993.
[ 7] 　Zhao M L , Zhou R H , Jia J Z , et al .Isolation and Identifi-
cation of Wheat-Leymus Multicaulis Addition Lines by
Using 5 o f Biochemical Markers [ A ] .In:Pro.8th
Int.Wheat Genetics symposium[ C] .北京:中国农业科
技出版社 , 1993.827-832.
[ 8] 　赵茂林 , 周荣华 , 董玉琛.普通小麦-多枝赖草二体附
加系的创建及其细胞遗传学研究[ A] .第三届全国青
年作物遗传育种学术会论文集[ C] .南京:1994.82-
85.
[ 9] 　赵茂林 , 周荣华 ,董玉琛.普通小麦-多枝赖草二体附
加系的抗黄矮病性鉴定[ A] .首届全国生物技术在植
物病虫害研究与防治中的应用学术研讨会论文摘要汇
编[ C].北京:1994.103.
[ 10] 　赵茂林 ,杨海涛 , 梁宏霞.单体异附加系花药培养变
异法选育抗病虫小麦新种质[ J] .云南大学学报(自
然科学版), 1999 ,(增刊):61.
[ 11] 　Zhao Mao-lin , Li Rui-fen , Yang Hai-tao , et al.Anther
Culture of Monosomic Alien Addition Line fo r P roduc-
ing Wheat Alien T ransloca tion Lines Resistant to Dis-
eases and Aphids[ A] .第一届全国植物基因组学大会
论文摘要[ C].大连:2000.
[ 12] 　Röder M S , Korzun V , Wendehake K , et al.A mi-
crosatellite map of w heat[ J] .Genetics , 1998 , 149(4):
2007-2023.
[ 13] 　Fahima T , Röder M S , Grama A , et al.Micro saellite
DNA polymo rphism divergence in T riticum dicoccoides
accessions highly resistant to yellow rust[ J].Theo r Ap-
pl Genet , 1998 , 96(2):187-195.
[ 14] 　李树龙.用 SSR和 RFLP 分子标记分析小麦 B 基因
组起源[ D] .中国农科院研究生院硕士学位论文 ,
2000.
[ 15] 　Lelley T , Stachel M , Grausg ruber H , et al.Analysis of
rela tionships between Aegilops tauschii and the D
genome of w heat utilizing microsatellites[ J] .Genome ,
2000 , 43(4):661-668.
[ 16] 　Peil A , Korzun V , Schubert V , et al .The application of
whea t microsatellites to identify disomic T riticum aes-
tivum-Aegilops markgrafii addition lines[ J] .Theor Appl
Genet , 1998 , 96:138-146.
[ 17] 　Röder M S , Plaschke J , Konig S U , et al .Abundance ,
variability and chromosomal location of microsatellites in
wheat[ J] .Mol Gen Genet , 1995 , 246:327-333.
[ 18] 　Sun G L , Salomon B , Bo thmer R V.Analusis of te-
traploid Elymus species using wheat microsatellite
markers and RAPD markers[ J] .Genome, 1997 , 40:
806-814.
[ 19] 　Devos K M , Bryan G J , Collins A J , et al.Amplication of
two microsatellite sequences in w heat storage protein as
molecular markers[ J] .Theor Appl Genet , 1995 , 90:247
-252.
[ 20] 　Plaschke J , Ganal M W , Röder M S.De tection of genetic
div ersity in closely related bread w heat using microsatel-
lite markers[ J] .Theo r Appl Genet , 1995 , 91:1001 -
1007.
4　 华　北　农　学　报 19卷