全 文 ：文章编号　 1000-2049( 1999) -04-0007-04
新疆大赖草 DNA导入普通小麦获得大穗品系
张茂银 1　王子霞 1　海热古力 1　杨克锐 1　杨松杰 1　顾爱星 1
赵明安 2　刘云英 2　缪　军 2
( 1. 新疆农业科学院核技术生物技术研究所 ,农业部西北农作物细胞工程重点开放实验室 , 乌鲁木齐 830000;
2. 中国科学院新疆化学所 , 乌鲁木齐 830011)
摘　要　用花粉管通道法将新疆的大赖草 DN A导入普通小麦花培品系 761, 从转化的 D3和 D4代变异中筛选出大穗
(主穗长大于 14 cm)、 多穗 (主穗粒数大于 60粒 )品系 50个 ,并能稳定遗传和正常结实 ,各品系连续多年种植 ,在穗长、
穗粒数和粒重上表现突出。 经对供体、受体和转化后代进行酯酶同工酶和 RAPD分析 ,证明供体 DN A片段已进入受体
引起 DNA重组。
关键词　普通小麦 ; 大赖草 DN A; RAPD; 酯酶同工酶
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中图分类号 S 512. 1035. 3 文献标识码　 A
CREATING LARGE SPIKE WHEAT STRAINS BY INTRODUCING
LEYMUS RACEMOSUS ( LAM. ) DNA INTO COMMON WHEAT
ZHANG Mao-yin1　WANG Zi-xia1　Haireguli1　 YANG Ke-rui1　 YANG Song- jie1
GU Ai-xing
1　 ZHAOMin-an2　 LIU Yun-ying2　MIAO Jun2
( 1. I nst . of N uclear and Biotec. , X injiang Academy of Agric. Sci. , Wulumoqi 830000;
2. X injiang Chemical Inst. , Chinese Academy of Sci. , Wulumoqi 830011)
ABSTRACT　 Fifty stably inheritable and no rmally bearing strains with large spike ( main spike leng th mo re than 14 cm) , g rain
number of main spike more than 60 grains were selected fr om variatio ns of the transformed pedig ree D3 and D4 through the
introduction of Leymus nuclea r DNA into common spring whea t pollen line 761 by means of pollen tube. M eanwhile, the leng th
of main spike, grain number of main spike and weight of g rain were sig nificantly better than r eceptor through being planted for
several yea rs. The donor, recepto r and their pedig rees w ere analysed for their iso zyme of esterase and RAPD, which show ed that
the introduction of dono r DNA fragments into the recepto r caused DNA recombina tio n.
KEY WORDS　 common wheat; Leymus racemosus DNA; RAPD; iso zyme of eserase
将外源基因导入受体植物基因组中获得抗病虫、抗逆和品质好的转基因植物 ,是改良农作物的有效
方法。目前转基因 (组 )可分为两类 ,一类是转移目的基因 ,一类是导入外源 DNA, 特别是花粉管通道法
导入外源 DNA,因简便易行 ,成效显著 ,引起国内外学者关注。自周光宇提出染色体片段杂交假设〔1〕 ,并
作了实验证明〔 2, 3〕 ,之后大量的试验表明 ,通过花粉管通道法不仅能把目的基因导入受体〔4, 5〕 ,而且将外
源 DNA导入受体后 ,出现的变异类型广泛丰富 ,在一些作物中已选育到优良的稳定遗传的品系〔 6～ 8〕。小
麦的近源野生属种 ,和小麦有部分同源性 ,更易实现同源配对和片段杂交。通过花粉管通道法把小麦近
缘野生属种 DNA导入小麦 ,是继远缘杂交染色体工程之后 ,克服远缘杂交不亲和性 ,充分利用小麦近
缘野生属种的新方法。大赖草 (Leymus racemosus ( Lam. ) Tzvel)是在我国仅分布于新疆的小麦族大麦
亚族赖草属的近缘野生种〔 9〕 ( 2n= 28)。它抗旱、耐盐碱和瘠薄 ,对锈病、白粉、黄矮、赤霉和根腐等真菌和
收稿日期: 1999-08-24
江苏农业研究 J IAN GSU AGRICUL TUR AL R ESE ARCH 1999, 20( 4): 7～ 10
细菌病害高抗或免疫〔9～ 12〕 ,穗长 30 cm左右 ,穗粒数 300多粒 (人工栽培条件下 ) ,籽粒蛋白质含量
18. 6% , 说明大赖草在抗性、品质和产量性状方面都是改良小麦的优异种质材料。 1989年开展把大赖
草 DNA导入小麦的研究 ,经过近 10年努力已获得 50个大穗品系 ,其中 95S-524已进入省区试。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
　　供体为新疆大赖草 ,受体为花培品系 761(春麦 )。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　 DN A的提取
采用苯酚 氯仿 异戊醇 核糖核酸酶法提取供体叶片 DNA, 经紫外线检测 (岛津 Uv-265)和琼脂糖
凝胶电泳鉴定 , A260 /A280= 1. 87, A260 /A230= 2. 30, 片段长度大约 50 kb, 用超声波随机打断后 ,以 3. 5
μg /μL的浓度导入受体。
1. 2. 2　 DN A的导入
选取受体主穗 ,人工去雄套袋 ,第 3 d人工授入自身花粉并套袋 , 1～ 3 h后用刀片切去柱头 ,立即
在每个小花柱头切口处滴加 3. 5μg /μL的 DNA溶液 6μL, 然后套袋结实。
1. 2. 3　转化植株后代处理
按常规育种程序对所获转化后代植株进行选育 , D0、 D1、 D2、 D3、 D4代种子均单粒点播成株行 ,进行
田间选择和鉴定。 稳定品系进行品比试验和作为亲本与推广品种杂交。
1. 2. 4　检测分析
对供体、受体、转化后代品系与新春 6号杂交后代进行酯酶同工酶和 RAPD分析。
酯酶同工酶所用材料为 D6代稳定大穗品系、受体和供体的子叶和胚乳 ,具体方法见文献〔 13〕、
〔14〕。 RAPD分析用材料为 D7代大穗品系、大穗品系与新春 6号杂交 F2代的大穗、小穗极端分株及供
体、受体和新春 6号。美国 Operon公司引物 ,伯乐公司 PCR仪 ,具体方法根据试剂盒说明和文献〔15〕,
并略作修改。
2　结果与分析
2. 1　转化后代植株变异类型和范围
　　在 D0、 D1、 D2代植株中未发现变异。 1992年在 D3代 8 900个单株中 ,发现一变异株 ,其他单株和受
体植株在形态上无明显差异。变异株表现为茎粗 (主茎直径 0. 71 cm ) , 穗下节长 ( 33. 5 cm) , 穗大 (主穗
长 16 cm, 主穗粒数 65粒 ,受体穗长 9. 9 cm, 主穗粒数 60粒 ) ,叶片宽大 ,叶片长宽较受体增加 23.
95% (旗叶、倒 1叶、倒 2叶平均 )。并且在株高 (高 )、株型 (大 )、成熟期 (晚 )出现较大变异 ,籽粒变长变
大 ,从红粒变成白粒 ,叶片出现蜡质。 将所获种子 1993年春播于网室 ,收获 265个单株。
对 1993年获得的 D4代 265个单株 ,按常规选育程序种植和选择 ,发现在 D5代已基本稳定 ,后又经
重复选择 D7代获稳定大穗品系 50个 ,选择 1个大穗品系与新春 6号配制了杂交组合。从连续 5年考种
结果 (表 1)看 ,转化后代株系在主穗长、主穗粒数、主穗粒重和千粒重上分别比受体 ( 761)增加 5. 7 cm、
7. 4粒、 0. 7 g和 7. 9 g , 表明通过向小麦直接导入大赖草 DNA, 显著地改变了受体穗部和产量性状 ,
并且能稳定遗传和正常结实 ,且年度间变异也较小。
2. 2　酯酶同工酶结果分析
根据 PAGE电泳结果 ,大穗转化株 ( 8株 )和受体植株的子叶酯酶同工酶谱比较 (见封三图 1) , 大穗
转化株和受体无差异。 大穗转化株和供体、受体的胚乳酯酶同工酶电泳图谱有很大差异 (见封三图 2) ,
8 江苏农业研究　　第 20卷　
其中 3、 8号转化株 2条带受体和供体均无 ,说明供体 DNA片段导入受体整合到有关染色体上 ,发生了
重组 ,表达了新酶带。 同时 ,转化株系酶带宽 ,着色明显大于或深于受体 ,说明转基因小麦酶活性有较大
的增强 ,这与有关研究报道的过量表达一致〔8〕。
表 1　新疆大赖草 DN A转化普通小麦后代和受体 761农艺性状统计分析结果
Table 1　 Agronomical character stat istical analysis results of receptor and progenies
from common wheat transformed by the Leymus racemosus DNA
世　代
Gene-
ration
转化株系
和 受 体
Number of
t ransformed
lines and
receptor
每个株系和受
体的单株数
Number of
plant per
t rans fo rm ed lines
and receptor
株高
Plant
heigh t
/cm
有效分蘖数
Effectiv e
t ill ering
主穗长
Spik e
leng th
/cm
小穗数
Spikelet
n umber
主穗结实粒
Grain
n umber of
main
spik e
主穗粒重
Grain w eigh t
of main
spikelet
/g
千粒重
Weigh t of
thousand
grains
/g
D4
761
D5
761
D6
761
D7
761
D8
761
x①t
x②761
x t - x761
　 1
　 1
100
　 1
50
　 1
50
　 1
50
　 1
265
50
50
50
50
50
50
50
50
50
92. 4
72. 9
98. 3
84. 8
101. 1
77. 7
90. 7
82. 0
101. 5
75. 5
96. 8
78. 6
18. 2
5. 2
5. 1
3. 6
3. 8
4. 4
3. 8
4. 1
3. 4
4. 3
3. 6
4. 3
3. 9
0. 4
15. 1
9. 7
14. 9
8. 9
15. 8
9. 3
15. 2
9. 4
15. 2
10. 1
15. 2
9. 5
5. 7
22. 7
19. 5
21. 4
16. 2
21. 0
18. 1
22. 1
18. 5
23. 4
18. 4
22. 1
18. 1
4. 0
57. 1
60. 8
55. 6
40. 6
68. 9
5. 9
62. 1
68. 6
70. 0
55. 7
62. 7
55. 3
7. 4
2. 2
2. 1
2. 6
1. 3
3. 4
2. 4
2. 7
2. 3
3. 5
2. 8
2. 9
2. 2
0. 7
38. 4
34. 1
46. 8
32. 0
49. 3
40. 7
43. 5
41. 3
50. 0
40. 8
45. 6
37. 7
7. 9
① x t: 为 D4、 D5、 D6、 D7和 D8的总平均 ; ② x761: 为 761的 5年总平均。
① x t: The av erage of D4～ D8; ② x761: Th e average of 761 for years.
2. 3　 RAPD结果分析
扩增条件为: 50μL反应体积 ( 10 mmol /L Tris缓冲液 pH 8. 3, 50 mmo l /L KCl, 2 mmol /L
MgCl2 , 100μmol /L dN TP, 0. 2μmol /L引物 , 0. 5～ 1μg Tag酶 , 100 ng模板 DNA) 97℃ 5 min, 然
后 ( 94℃ 1 min, 37℃ 1min, 72℃ 2min) 40个循环 ,最后 72℃ 5min。扩增产物 10%聚丙烯酰胺凝胶
电泳 ,银氨染色。从 RAPD结合银氨染色技术对转化株和受体 761所作的多态性结果可见 (见封三图
3) (箭头所指即出现的特异扩增带 ) ,引物 O PT05有 4条差异带 ,引物 OPT04有 1条非常显著的重带差
异 , OPT03转化株和受体 761有 4条带不同 ,这都说明转化后代和受体之间出现了在 DNA水平上的
差异。 用随机物 O PDJ914扩增受体 761、转化株、父本转化株、 F2代大穗混合 DNA、 供体大赖草、 F2
代小穗混合 DNA和新春 6号 (见封三图 4) , 发现转化株、父本转化株和 F2代大穗混合 DNA 1条带 (暗
红带 )着色较亮 ,面积较大 ;大赖草、 F2代小穗混合 DNA和母本新春 6号也有 1条带 (暗红带 )着色较
暗 ,面积较小 ,而受体 761这条带无亮迹 ,这表明各样本在此带的数量 (拷贝数: 转化株、父本转化株>
F2代大穗混合 DNA> 大赖草> F2代小穗混合 DNA和母本新春 6号 )不一致 ,即模板 DNA数量上有
差异 (大赖草的暗红带克隆标记为探针与大穗转化株、父本大穗转化株和 F2代大穗混合 DN A的暗红
带杂交呈阳性 ,具同源性 ,待发表 )且可在父本转化株和 F2代跟踪。 认为大穗转化株是由于导入 DNA
同源重组引起的 ,可能这些暗红带与穗部 (性状 )有相关性 ,是否是控制穗部性状的 DNA需进一步研
究。
生物和分子生物学试验结果表明 ,能稳定遗传和表达的大穗转化后代 ,供体、受体和转化后代酯酶
同工酶酶谱和 RAPD的多态性有差异 ,导入外源 DNA与受体染色体进行了同源配对重组 ,出现了新酶
带和 DNA特异扩增带 ,符合周光宇提出的 DNA片段杂交的理论〔 1〕 ,有关研究也报道了类似结果〔 2, 7, 8〕。
可见导入植物近缘野生种 DNA, 较易实现外源 DNA转移和整合 ,且稳定快 ,周期短 ,效果好 ,该技术与
常规育种相结合 ,是利用植物近缘野生种质的有效方法。
9　第 4期　　张茂银等: 新疆大赖草 DN A导入普通小麦获得大穗品系
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关于举办“国际动、植物数量遗传与
育种学术研讨会”的通知
自本世纪初孟德尔遗传定律被重新发现以来 ,数量遗传学一直是遗传学的重要分支之一 ,并在动、
植物遗传育种中发挥了重要作用。近年来 ,随着分子生物学技术的发展 ,数量性状的遗传研究和育种应
用也取得了巨大进展。 在千年交替之际 ,为了回顾我国数量遗传学与育种领域所取得的重要成果 ,展望
新世纪动、植物数量遗传学的发展趋势和分子生物学技术给数量遗传学带来的机遇和挑战。由中国遗传
学会主办、扬州大学承办的“国际动、植物数量遗传与育种学术研讨会” ,定于 2000年 5月 8～ 10日在风
景秀丽的历史文化名城——江苏省扬州市召开。这是本学会在 21世纪举办的第 1次学术研讨会 ,也是
首次将从事动、植物数量遗传学与育种的同行们组织在一起 ,共同交流研究进展和探讨数量遗传学的相
关问题。大会由中国科学院院士、中国遗传学会副事理长吴常信教授任主席 ,邀请国内、外著名数量遗传
学家作专题报告。
请拟参加会议的同志提前准备论文 ,在 2000年 2月 25日之前将回执、论文寄来 ,大会将编辑出版
论文集。论文要求按《中国农业科学》版面格式 ,用 Word 97排版。每篇论文一般不超过 5项 ,并请以附
件方式通过 E-mail传送。
会期 3天 ,其中一天参观 ,会务费 350元 ,食宿自理。
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中国遗传学会
扬 州 大 学
10 江苏农业研究　　第 20卷