全 文 ：　遗 传 学 报　Ac ta Gene tica S in ica, August 2005, 32 (8):811～ 817 ISSN 0379 -4172
收稿日期:2004 - 05 -13;修回日期:2004 -09 -17
基金项目:国家重点基础研究发展规划项目 (973计划 )(编号:G19980102) [ Supported by Key P ro ject of Ch inese Nationa l Programs for
Fundamen tal Research and Development(G19980102)]
作者简介:毛新国(1971 -),男,博士 ,研究方向:小麦功能基因组学。 E-mail:maoxg2001@ s ina. com
①　通讯作者。 jzjia@ma i.l caas. ne.t cn
Construction o f a Full-length cDNA Library ofAeg ilops spelto ides
Tausch w ith Optmi ized Cap-trapperMethod
MAO X in-Guo, KONG X iu-Y ing, ZHAO Guang-Yao, JIA Ji-Zeng①
(Key Labora tory of C rop Germ plasm ＆B iotechno logy / the M in is try o fAgriculture , Ins titute ofC rop
Germ plasm Resources, Ch inese Academ y ofAgricu ltura lSc iences, Beijing 100081, Ch ina)
Abstract:To d iscove r new genes in a th roughpu tm anner, the cap-trapper m e thod pub lished prev ious ly was
op tmi ized fo r ra is ing the e ffic iency in the construction of fu ll-leng th cDNA lib ra ry. Us ing the op tmi ized p ro toco l, we
successfu lly constructed a fu ll-leng th cDNA lib ra ry o fAeg ilops spelto ides , w h ich con ta ined 3. 0×106 c lones and
m ore than 99% o f p laques w ere recom b inan t phages. Sequence ana lys is resu lts ind ica ted tha tmore than 89%
o f the c lones w ere fu ll-leng th.
K ey words: fu ll-leng th cDNA lib ra ry;Cap-trappe rm ethod;Ae. spe lto ides
利用改进的 Cap-trapper法构建拟斯卑尔脱山羊草
(Ae. speltoides Tausch)全长 cDNA文库
毛新国 , 孔秀英 , 赵光耀 , 贾继增①
(中国农业科学院作物品种资源研究所 , 农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室 , 北京　100081)
摘　要:Cap-trappe r法是目前全长 cDNA文库构建的重要方法之一。在引进 、消化 、吸收的基础上 ,通过设计引
物 , 同位素检测 ,对末端转移反应条件控制等方面做了一些切实可行的改进 ,形成了一套简单易行的技术体系。利
用改进的 Cap-trapper方法 ,成功构建了小麦 B基因组的可能供体种拟斯卑尔脱山羊草 (Ae. spe lto ides)的全长
cDNA文库。经综合评价 ,文库的全长比例达到 89. 6%,重组率为 99%, 库容量超过 3. 0×106 cfu。
关键词:全长 cDNA文库;Cap-trappe r法;拟斯卑尔脱山羊草
中图分类号:Q943　　　文献标识码:A　　　文章编号:0379-4172(2005)08-0811-07
　　cDNA文库构建是在基因组水平上研究某一生
物特定器官 、特定组织或特定的发育时期基因表达
的前提和基础 。传统方法构建的 cDNA文库由于
方法自身因素的制约 ,得到的基本上是不完整的
cDNA片段 ,不利于后期基因结构和功能的分析 。
为了弥补普通 cDNA文库的缺陷 ,科学家们采取不
同的策略 ,直接构建全长 cDNA文库 。全长 cDNA
文库的优点显而易见 ,绝大多数克隆不仅包含完整
的阅读框架 ,还拥有 5′和 3′端的非编码区 (UTR),
这不仅大大加速了后期测序和生物信息学分析 ,还
有利于进行蛋白质表达和功能研究[ 1] 。另外 ,全长
cDNA文库是高效 、大规模获得基因序列信息的一
条有效途径 ,尤其是对基因组庞大 、近期内不可能进
行全基因组测序的生物来说更是进行功能基因组研
究的一条重要途径 。然而 ,全长 cDNA文库构建困
难重重:首先 ,获取完整的 mRNA比较困难;其次 ,
全长 cDNA也不易得到;第三 ,有效区分全长和截
短的基因也非常棘手;第四 ,由于基因序列长短不
同 ,克隆生长快慢也不一致 ,所以很容易导致小片段
基因的富集。而基于普通 cDNA文库中的基因片
段获取全长基因的方法 (如 RACE技术 )在整个基
因组范围内大规模 、高通量地发掘新基因是难以想
像的。
目前 ,构建全长 cDNA文库的方法主要有以下
几种:SMART法 [ 2 ] , O ligo-capping法[ 3, 4] , CAP ture
法 [ 5] , Cap-jumping法[ 6]以及 Cap-trapper法 [ 1, 7 ～ 9]
等 。所有的这些方法都着眼于真核生物 mRNA 5′
端的帽子结构 ,但又各有各的独到之处。总的来说 ,
每种方法也都存在着一定的缺陷 ,它们有的涉及
PCR扩增 ,这样不但改变了文库中克隆的代表性 ,
而且直接影响对难扩增基因的克隆;有的以质粒为
载体 ,不利于克隆大片段的基因;有的实验流程长 ,
步骤繁琐。
我们在综合分析了各方面的因素之后 ,最后选
取 Cap-trapper法用来构建全长 cDNA文库 [ 10] 。
该方法虽然流程比较长 ,但不涉及 PCR扩增 ,利于
发掘稀有表达基因 ,同时它以噬菌体为载体 ,可以克
隆较大的 cDNA片段;另外 ,该方法构建的 cDNA
文库中全长比例相对比较高。
Cap-trapper法最早是由 Carn inc i等[ 7] 提出
的 ,经过不断改进 ,现在已经日臻完善 。日本理化研
究所的科学家们用这种方法已经构建了拟南芥
(A. tha liana )[ 11] 、小鼠 (M. musculus)[ 12 ] 、果蝇
(D. melanogaster)[ 13 ] 、水稻 (O. sa tiva )[ 14]等模式
生物的全长 cDNA文库 ,并得到了大量有价值的信
息 ,为推动功能基因组研究做出了重大贡献 。由于
该方法步骤繁琐 ,流程长 ,技术要求高 ,至今国内尚
未见到使用这种方法构建全长 cDNA文库的报道 。
我们在引进 、消化 、吸收的基础上 ,结合国内的实际
情况 ,对 Cap-trapper法的一些具体实验方法做了
一定的改进 ,现已经形成了一套简单易行的操作体
系 ,在此将该体系介绍给国内的同行 ,希望通过交流
更好地推动我国该项研究的进展。
小麦 (T riticum aes tivum L. )为异源六倍体作
物 ,含 A、B、D 3个基因组 , 其基因组庞大 (1.6 ×
10
10
bp),重复序列高 (>75%),与模式植物相比 ,
定位和克隆基因都比较困难。分别构建 A、B、D单
个基因组材料的 cDNA文库 ,不仅可以开展基因组
间的比较研究 ,而且也可以进行 B基因组起源探
索 ,所以我们选取小麦 B基因组的可能供体种———
拟斯卑尔脱山羊草 (Ae. spe lto ides)(SS)来构建全
长 cDNA文库 ,以简化由于普通小麦基因组复杂所
带来的困难。
1　材料和方法
1. 1　材　料
采集生长到两叶一心时期的拟斯卑尔脱山羊草
(Ae. spe lto ides)幼叶 ,迅速置于液氮中速冻 ,然后
转移到 -80℃的超低温冰箱中保存 。
1. 2　方　法
1. 2. 1　总 RNA提取及 mRNA纯化
将收集的样品在液氮中研磨成粉末 ,用 Inv ito-
gen公司的 Trizo l提取总 RNA。用 Ambion公司的
oligo-(dT)纤维素分离 、纯化 mRNA。
1. 2. 2　第一链 cDNA合成
取 10 μg mRNA与 5. 0 μL(5 μg /μL)引物Ⅰ混
合 , 65℃变性 10 m in。待变性结束后 ,分别加入下
列成分:5 ×第一链 buffer 34. 5 μL, 0. 1 mol /L的
DTT 11. 6μL, 3. 0 μL dTTP、dATP和 dGTP混合物
(各为 33. 3 mmol /L)(P romega), 10 mmo l /L
dm
5
CTP (MB I) 10 μL, 24. 3 μL饱和海藻糖 (S ig-
ma), 4. 9 mol /L的山梨糖醇 (F luka) [ 1, 15～ 17] 58. 1
μL, 3. 0 μL RNasin (P romega),混匀后于 PCR仪
上运行反转录程序 。当温度升到 40℃时 ,加入 20
μL Superscrip tⅡ ( Inv itrogen),迅速混匀 ,取 45 μL
转移到事先已经加有 0.5 μL [ α-32 p] dGTP(Amer-
sham B iosc iences)离心管中 ,快速混匀 ,短暂离心
后继续反转录。为了得到更多的全长 cDNA,我们
每隔 20 m in补加一次反转录酶。另外 ,在反应进行
到 40 m in时 ,加入 0. 5μL引物 Ⅱ(5μg /μL)到反转
录体系中。反转录程序如下:45℃ 5 m in;降温至
35℃;35℃ 3 m in;50℃ 5 m in;56℃ 1 h;4℃保温。
引物 Ⅰ及引物 Ⅱ的序列见表 1。
812 遗传学报　Acta Gene tica S in ica　Vo .l 32　No. 8　2005
表 1　第一链 cDNA合成引物序列
Table 1　Primers for the firs t s trand cDNA syn thes is
引物
Prmi er
引物序列
Prmi er sequence(5′→3′)
Prmi erⅠ Prmi er1 dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16R
Prmi er2 dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16CR
Prmi er3 dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16CCR
Prmi er4 dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16CTR
Prmi erⅡ dAGATTGTGGTCTCCTCGAGT16CY
　　反应结束后 ,从同位素管中取 1.0 μL反转录产
物 ,将其稀释到 25.0 μL,测定放射性强度 (N1 ),然
后转移到事先处理好的 M icrosp in S-300 HR(Am-
ersham B iosc iences)葡聚糖柱中 , 750 r /m in离心
2 m in,收集滤过液 ,检测放射性强度 (N 2 ),计算掺
入率 P(P =N 2 /N 1),推算 cDNA的产量。向反转
录产物中加入 EDTA(终浓度 10 mmol /L)以终止
反应 ,接着进行蛋白酶 K消化 ,然后用 CTAB-UREA
溶液沉淀 cDNA /RNA[ CTAB-UREA溶液配方:1%
CTAB (S igma), 4 mol /L UREA (S igma), 50
mmol /L T ris-HC l(pH 7. 0), 1 mmol /L EDTA(pH
8. 0)] ,再将沉淀溶解于 7 mo l/L的 GuC l中 ,最后
用 2. 5倍体积的无水乙醇沉淀 cDNA /RNA。
1. 2. 3　高碘酸钠氧化
15 000 r /m in离心收集沉淀的 cDNA /RNA,乙
醇清洗后晾干 ,并将其溶解在 46 μL ddH2O中 。向
反应管中加入 1 mol /L的 NaAc(pH 4.5)3.3 μL、
100 mmol /L的 NaIO4溶液 (S igma)5.5 μL,混匀 ,
于冰上避光放置 45 m in。待反应完成后 ,加入 1.0
μL 80%的甘油 ,混匀 ,终止反应。然后加入 0.5 μL
10%SDS, 5 mol /L NaC l 1.0 μL, 61 μL异丙醇 ,
-20℃放置过夜。
1. 2. 4　生物素标记
离心收集经高碘酸钠氧化的 cDNA /RNA,清
洗 ,晾干后重新溶解在 50 μL ddH2O中 , 加入 10
mmol /L新鲜配制的 B iotin hydraz ide(Vector La-
boratory)溶液 160 μL, 混匀 , 于 23℃温育 12 ～
16 h。标记结束后 ,加入 1 mol /L的柠檬酸钠 (pH
6.1)(S igma)75 μL, 750 μL无水乙醇 ,混匀 ,于
-20℃或 -70℃放置 30 ～ 60 m in。
1. 2. 5　RNaseⅠ消化
经高碘酸钠作用后 , mRNA 5′和 3′端末位碱基
核糖上相邻的二醇基团被氧化成二醛 ,它们都可以
与生物素作用。后期利用链酶亲和素包被的磁珠分
离全长 cDNA时 , mRNA 5′和 3′端的生物素也都可
以与磁珠结合 ,因此无法将全长和截短的 cDNA区
分开 。为了得到 5′端完整的 cDNA,必须特异地把
3′端标记的生物素除去 ,这样才能消除其对单链捕
获的干扰 。真核生物 mRNA 3′端 poly(A)长度一
般为 100 ～ 250 bp,在第一链 cDNA合成时 ,我们将
引物中 poly(T)的长度限制在 16个碱基左右 ,所以
cDNA /RNA复合物中 mRNA的 3′端以单链的形式
突出来 ,这样就可以用 RNaseⅠ将单链 mRNA切
除(RNaseⅠ可以非特异切割单链 mRNA)。
离心收集生物素标记的 cDNA /RNA,晾干后溶
解在 70 μL 0. 1 ×TE中 ,加入 20 μL 10 ×react ion
buffer, 5. 0 μL RNaseⅠ (10μg /μL)(Promega),混
匀 , 37℃温育 30 m in。反应结束后 ,于冰上终止反
应 ,经蛋白酶 K消化 ,酚 /氯仿萃取 ,后萃取等处理
后 ,调节上清中 NaC l的浓度至 0. 3 ～ 0. 4 mol /L,加
入 2倍体积的无水乙醇 ,于 -20℃沉淀过夜 。
1. 2. 6　全长 cDNA捕获及单链 cDNA释放
收集 cDNA /RNA,清洗晾干后溶解在 300 μL
1×W /B buffer。为减少非特异吸附造成的损失 ,需
用无 DNA污染的 tRNA对链酶亲和素包被的磁珠
进行封阻。取 500 μL Dynalbeads M-280(Dynal
B io tech)到硅化处理的 2. 0 mL离心管中 ,用磁铁
吸附 1 ～ 2 m in,除上清 ,重新悬浮磁珠于等体积的
1×W /B buffer中 ,加入 100 μg无 DNA的 tRNA,
于冰上放置 30 m in,不时混匀。封阻结束后 ,用 1 ×
W /B buffer清洗磁珠 1次 ,备用。将溶解的 cDNA /
RNA转移到盛有磁珠的离心管中 ,补足体积到 1
mL,室温下轻轻振荡 15 ～ 20 m in,用 1×W /B buff-
er清洗 2 ～ 3次。
加入 100 μL NaOH-EDTA 溶液 (NaOH 50
mmo l/L, EDTA 5 mmol /L),室温下放置 5 m in,不
时轻弹混匀 ,用磁铁吸附磁珠 1 ～ 2 m in,转移洗脱
液于一个新的硅化离心管中 。为得到尽可能多的单
链 cDNA,可以重复洗脱 3 ～ 4次 。洗脱结束后 ,迅
速加入 50 μL T ris-Cl(pH 7. 0),混匀 ,加入 2. 0 μL
RNaseⅠ , 37℃温育 10 m in。重复蛋白酶 K消化 ,
酚 /氯仿萃取 ,后萃取等步骤 ,然后加入 0. 08体积 5
mol /L的 NaC l, 2倍体积的无水乙醇 , - 20℃沉淀
单链 cDNA。
1. 2. 7　末端转移酶加尾
离心收集单链 cDNA,乙醇清洗 ,晾干后 ,重新溶
解于 30.5μL 0.1×TE中 , 65℃变性 2m in,加入 1.0
μL dGTP(100 mmol /L), 12.5 μL 0. 1% BSA, 5.0
813MAO X in-Guo et a l. :Construc tion o f a Fu ll-leng th cDNA L ibrary o fAeg ilops speltoides…
μL 10×TDT buffer, 1.0 μL TDT(15 μ/μL)(TaKa-
Ra), 37℃温育 9 m in。反应结束后 ,迅速转移到冰
上 ,加入 0.5 μL EDTA(0.5 mol /L),终止反应。酚 /
氯仿 /异戊醇 (25∶24∶1)抽提后 ,加入 5 mol /L的
NaC l至终浓度为 0.3 ～ 0.4 mol /L,再加入 2倍体积
的无水乙醇 ,混匀 ,于 -20 ℃沉淀 30 ～ 60 m in。
1. 2. 8　第二链 cDNA的合成
收集单链 cDNA ,重新溶解于 37 μL ddH2O中 ,
加入 6 μL 10 ×LA-PCR buffer (含 Mg2+), 12 μL
dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP均为 2.5 mmol /
L)(TaKaRa), 0. 5 μL LA-Taq酶 (5 U /μL)(TaKa-
Ra), 2.0 μL第二链引物 (20μg /μL),混匀 。取 5.0
μL转移到已经加有 0.5μL[ α-32 p] dGTP的离心管
中 ,混匀 ,按以下程序合成第二链:65℃ 5 m in后;
每秒钟降温 0. 1℃,降到 45℃为止;40℃ 10 m in;
68℃ 20 m in;重复步骤 3两次;最后在 72℃延伸 10
m in, 4℃保温。反应结束后 ,首先检测第二链 cDNA
产量 ,然后重复蛋白酶 K消化 , 酚 /氯仿萃取等步
骤 ,最后将 cDNA置于乙醇中沉淀过夜。
1. 2. 9　BsaⅠ酶切及片段分级
BsaⅠ属于二类限制性内切酶 ,它的酶切位点
正好处于识别位点下游的第一个碱基处 ,而且酶切
没有碱基特异性 ,但对识别位点的胞嘧啶甲基化敏
感 。经 BsaⅠ酶切的 DNA将产生 4个碱基突出的
黏性末端。根据这些特性 ,我们在引物设计时引入
了 BsaⅠ 、EcoRⅠ和 XhoⅠ位点 ,其中第一链引物
中为 BsaⅠ和 XhoⅠ位点 ,第二链引物中为 BsaⅠ
和 EcoR Ⅰ位点。通过采取这些措施 , 我们仅用
BsaⅠ对 cDNA进行单一酶切 ,就可以实现 cDNA
的定向克隆 。
将收集的双链 cDNA重新溶解于 40 μL ddH2O
中 ,加入 5.0 μL 10 ×buffer 3, 5. 0 μLBsaⅠ (New
England B io lab), 50℃温育 16 h,经酚 /氯仿萃取
后 , -20℃沉淀 30 ～ 60 m in。
为了提高文库中插入片段的长度 ,必须对酶切
后的 cDNA片段进行分级 ,以除去引物和酶切形成
的小片段 。常用于片段分级的方法有两种:胶回收
法和葡聚糖柱分离法 ,前者比较直观 ,可以直接确定
片段的大小 ,后者则比较方便 ,但分级效果不如前者
好。将沉淀后的 cDNA 重新溶解于 20 μL 的
ddH2O中 ,电泳后 ,挖胶 ,回收目的片段。
1. 2. 10　连接 、包装及插入片段检测
收集分级后的目的 cDNA片段 , 重新溶解于
3. 5 μL ddH2O中 ,取 0.5 μL检测 cDNA浓度 ,确定
cDNA的浓度后 ,取适量的 cDNA与载体 UniZAPⅡ
(Stra tagene)连接过夜。包装后 ,侵染宿主菌 XL1-
B lue,检测滴度 [ 18] 。
用牙签随机挑取 30个噬菌斑 ,于 SM buffer浸
泡 10 m in,以浸出的噬菌体作为模板 ,进行 PCR扩
增 ,电泳检测插入片段的大小 。
1. 2. 11　质粒提取及序列测定
文库扩增后 ,取一定量的扩增文库用于噬粒环
化 ,检测噬粒滴度 ,最后取适量环化后的噬粒侵染宿
主菌 SOLR。涂布平板 , 37℃培养过夜 。
随机挑取阳性克隆于 96孔深孔培养板中培养
过夜 ,按常规方法提取质粒 ,调整质粒浓度 ,分别以
T3和 T7为引物做测序 PCR。 PCR产物经纯化后 ,
溶解在 10 μL的去离子甲酰铵中 ,用 ABI3730 XL
DNA analyzer测序。
2　结　果
利用改进的全长 cNDA文库构建方法 ,我们成
功构建了普通小麦 B基因组的可能供体种拟斯卑
尔脱山羊草幼叶的全长 cDNA文库。统计结果表
明 ,所建文库中全长 cDNA比例达到 89. 6%,库容
量达到了 3. 0 ×106 cfu,重组率超过 99%,插入片
段大于 1. 0 kb(图 1)。
图 1　全长 cDNA文库插入片段检测
M:MB I100 bp ladder。
Fig. 1　Average insert s ize o f full-length cDNA lib ra ry
M:100 bp ladder ofMB .I
814 遗传学报　Acta Gene tica S in ica　Vo .l 32　No. 8　2005
3　讨　论
由于 Cap-trapper法实验流程长 ,技术要求高 ,
操作相当困难 ,国内至今没有见到使用这种方法建
库的相关报道。我们结合本实验室的实际情况 ,经
过一系列的实验摸索 ,对原有的文库构建方法做了
一些改进:第一 ,反转录时 ,为了提高 cDNA的产
量 ,我们每隔 20 m in向反应体系中补加一次反转录
酶 ,以减少由于反转录酶活性降低对全长 cDNA合
成的影响。为避免由于腺嘌呤与胞嘧啶错配而导致
的 poly(A)过长问题[ 19, 20 ] ,我们在反应结束前 20
m in才加入第一链引物 Ⅱ ,这样既保证了文库中各
种表达产物的原始比例 ,又减少错配对整个文库质
量的影响;第二 ,在同位素检测方法上我们采用离
心 ,过 M icrosp in S-300 HR柱的方法代替原有的
DE-81滤纸检测法 ,这样既方便省时 ,又准确高效;
第三 ,引物设计时 ,我们在 EcoRⅠ和 XhoⅠ的酶切
位点的外侧引入了 BsaⅠ酶切位点。借助 BsaⅠ的
酶切特性 ,仅使用 BsaⅠ单酶切就获得了不对称的
黏性末端 ,从而实现了 cDNA的定向克隆 ,这样不
仅取得了良好的效果 ,也简化了实验的操作流程;第
四 ,控制 poly(G)的长度 。测序结果显示 ,如果 5′
端 po ly(C)少于 13个碱基 ,则 5′端测序能够顺利通
过 ,反之峰值则会急剧下降 ,甚至导致测序失败。一
般末端转移酶推荐的反应条件是 37℃温育 20 ～ 30
m in,如果按厂家提供的反应条件 , po ly(G)的长度
就可能超过 13个碱基 ,我们就无法通过测序得到
cDNA 5′端的信息。经过反复实验 ,我们将反应时
间控制在 9 m in, poly(G)的长度介于 9 ～ 13个碱基
之间 (图 2),所有 5′端测序反应都能顺利进行 ,单次
测序长度可超过 1. 1 kb,这样不仅提高了工作效
率 ,也大大降低了测序的成本;第五 ,限定 3′端 poly
(A)的长度 。 cDNA 3′端 poly(A)的长度也是影响
测序的一个重要因素 。普通 cDNA文库构建时用
oligo(dT)引发第一链 cDNA合成 ,这样构建的文库
中的 cDNA 3′端常带着长长的 poly(A)尾巴 (多达
200 bp)。如果从 3′端测序 ,就会影响测序的质量 ,
同时也不利于获取更多有用的信息。此外 ,后期如
需采用差减或均一化的方法来发掘稀有表达的基因
就非常困难 。由于 poy(A)较长 ,不同基因的 poly
(A), poly(T)间会杂交形成网状结构 ,导致差减或
均一化失败 [ 19, 20] 。有人推荐使用末端带有两个简
并碱基的 oligo(dT)VN代替单一的 oligo(dT),我
们的实验结果证明 ,由于腺嘌呤与胞嘧啶之间的错
配[ 19, 20] , 这种方法也无法完全避免类似事件的发
图 2　控制 po ly(A)、 poly(G)长度前后测序结果比较
1:第一链引物改进前的测序结果;2:第一链引物改进后的测序结果;3:控制末端转移反应时间前的测序结果;4:将末端
转移反应时间限定在 9 m in的测序结果。
Fig. 2　Sequenc ing resu lt comparisons after tak ing methods to lim it the length of po ly(A) and po ly(G)
1:Resultw ithoutmodify ing the 1st s trand prmi ers;2:Result after modify ing the 1st s trand prmi ers;3:Resultw ithout
lmi iting the term inal transfer reac t ion tmi e;4:Result after lmi it ing the term ina l trans fer react ion tmi e to 9 m in.
815MAO X in-Guo et a l. :Construc tion o f a Fu ll-leng th cDNA L ibrary o fAeg ilops speltoides…
生 。为此 ,我们用多引物组合取代单一引物来引发
第一链 cDNA的合成。我们所用的第一链引物由 5
条简并引物组成 ,其中引物 Ⅰ由 4条引物组成 ,其序
列如表 1所示 , P rmi er1、Prmi er2、P rmi er3、Prmi er4
的比例分别为 8∶2∶2∶1。引物 Ⅱ为一简并引物 (序
列见表 1),它在第一链引物总量中所占的比例约为
10%。通过采取这些改进措施 ,我们有效地将 poly
(A)限制在 16个碱基左右(图 2)。
全长 cDNA文库中全长基因的比例是影响文
库质量的一个重要指标。为评价全长 cDNA在文
库中所占的比例 ,我们从测序结果中随机挑取了
220条高质量的序列用于完整性分析 ,除去冗余序
列后 ,共计得到 155条单一序列。我们首先将这些
单一序列提交到 GenBank中比对 ,然后根据单子
叶植物 Kozak序列的结构特征和 5′端非编码区长
度对目的序列进行全面系统地分析 [ 21 ～ 26] ,最终统
计结果表明 , 文库中全长基因的比例达到了
89.6%,这一结果也充分说明我们对原有步骤的改
进是可行的 。
致　谢:衷心感谢日本理化研究所的 Carn inc i P先
生为我们提供了构建全长 cDNA文库的方法 ,同时
感谢凯拓公司夏勉老师为我们提供的技术指导 。
参考文献(References):
[ 1 ] 　Carninc i P, Sh iba ta Y, Haya tsu N, Sugahara Y, Sh iba ta K,
Itoh M , Konno H, Okazak iY, Muram atsu M , Hayash izak i Y.
Norma lization and subtract ion o f cap-trapper-selec ted
cDNAs to prepare full-leng th cDNA libraries for rapid dis-
covery of new genes. Genome Res, 2000, 10(10):1617 ～
1630.
[ 2 ] 　Zhu Y Y, Machleder E M , Chenchik A, Li R, S iebert P D.
Reverse transc riptase temp late sw itching:A SMART ap-
proach for full-length cDNA library cons truc tion. B iotech-
n iques, 2001, 30(4):892～ 897.
[ 3 ] 　Suzuk i Y, Yoshitomo-Nakagawa K, Maruyama K , Suyama
A, Sugano S. Construct ion and characterizat ion of a full
leng th-enriched and a 5′-end-enriched cDNA library. Gene ,
1997, 200(1-2):149 ～ 156.
[ 4 ] 　Suzuk i Y, Sugano S. Const ruct ion of a full-length enriched
and a 5′-end enriched cDNA library us ing the oligo-capp ing
method.MethodsM ol B io l, 2003, 221(1):73 ～ 91.
[ 5 ] 　 Edery I, Chu L L, Sonenberg N , Pellet ier J. An eff ic ient
strategy to isolate full-length cDNAs based on an mRNA
cap retent ion procedure (CAPture).MolCell B iol, 1995, 15
(6):3363 ～ 3371.
[ 6 ] 　Efmi ov V A, Chakhmakhcheva O G, Archdeacon J, Fernan-
dez J M , Fedork in O N, Dorokhov Y L, A tabekov J G. De-
tec t ion of the 5′cap structure ofm essenger RNAs w ith the
use of the cap-jump ing approach. Nuc leic Ac idsR es, 2001,
29(22):4751 ～ 4759.
[ 7 ] 　Carn inc iP, Kvam C, K itam ura A, Ohsum iT, Okazak iY, Itoh
M , Kam iya M , Sh iba ta K , Sasak i N , Izawa M , Murama tsu
M , Hayash izak i Y, Schneider C. H igh-e ffic iency full-length
cDNA c loning by b iot iny lated CAP trapper. Genom ics,
1996, 37(3):327 ～ 336.
[ 8 ] 　Carninc i P, Westover A, N ish iyama Y, Ohsum i T, Itoh M,
Nagaoka S, Sasak iN , Okazak i Y,Muramatsu M, Schne ider
C , Hayashizak i Y. H igh effic iency se lect ion o f full-length
cDNA by mi proved bio tiny lated capt rapper. DNA Res,
1997, 4(1):61 ～ 66.
[ 9 ] 　Sek iM , Carn inc i P, N ish iyam aY, Hayashizak i Y, Shinozak i
K. H igh-eff ic iency c loning A rab idopsis full-leng th cDNA by
b iot iny lated CAP trapper. P lan t J, 1998, 15(5):707 ～ 720.
[ 10] 　Sugahara Y, Carn inc iP, Itoh M , Sh ibata K , Konno H, Endo
T, Muram atsu M , Hayashizak iY. Compara tive evaluat ion of
5′-end-sequence qua lity o fc lones in CAP trapper and o ther
full-leng th cDNA libraries. Gene , 2001, 263(1-2):93 ～ 102.
[ 11] 　Sek iM , Narusaka M, Kam iya A, Ishida J, Satou M , Sakura i
T, Nakajmi aM , En ju A, Ak iyam a K, Oono Y, Murama tsu M,
Hayashizak iY, Kawa i J, Carninc iP, ItohM , IshiiY, Arakaw a
T, Sh ibata K , Sh inagaw a A, Shinozak i K. Funct ional anno-
tat ion of a full-leng thArab idops is cDNA co llec t ion. Sc ience,
2002, 296(5565):141～ 145.
[ 12] 　Carn inc i P,Wak iK, Sh irak i T, Konno H, Shibata K, Itoh M,
Aizawa K, A rakawa T, IshiiY, Sasak iD , Bono H , Kondo S,
Sugahara Y, Sa ito R , Osato N , Fukuda S, Sato K ,Watahik i
A, H irozane-K ishikawa T, Nakam ura M , Shibata Y, Yasun-
ishi A, K ikuch i N, Yoshik i A, Kusakabe M, Gus tinc ich S,
Be isel K, Pavan W , A id in is V, Nakagawara A, Held W A,
Iw ata H, Kono T, Nakauch i H , Lyons P, Wells C , Hum e D
A, Fag io lin iM , Hensch T K, BrinkmeierM , Cam per S, H irota
J, Mombaerts P, Muramatsu M , Okazak i Y, Kawa i J, Ha-
yashizak i Y. Targeting a comp lex transc riptome:The con-
s truct ion of the mouse full-leng th cDNA encyclopedia. Ge-
nom e Res, 2003, 13(6B):1273 ～ 1289.
[ 13] 　S tap leton M , L iao G, B rokstein P, Hong L, Carninc i P,
Sh irak i T, Hayashizak i Y, Champe M , Pac leb J,Wan K, Yu
C , Carlson J, George R , Celniker S, Rubin G M. The D ro-
sophila gene collect ion:Ident if icat ion of putat ive full-length
cDNAs for 70% o fD. m elanogas ter genes. Genom e Res,
2002, 12(8):1294 ～ 1300.
[ 14] 　K ikuchi S, Satoh K, Nagata T, Kaw agash ira N , Doi K, K ish i-
moto N , Yazak i J, Ish ikaw a M, Yamada H, Ooka H, Ho tta I,
Kojmi a K, Nam ik iT, Ohneda E, Yahag iW , Suzuk iK, L iC J,
Ohtsuk iK, Sh ish ik i T, Otomo Y, Murakam iK, Iida Y, Suga-
816 遗传学报　Acta Gene tica S in ica　Vo .l 32　No. 8　2005
no S, Fu jmi ura T, Suzuk i Y, Tsunoda Y, Kurosak i T, Ko-
dama T, Masuda H , Kobayash iM , X ie Q, Lu M , Narikawa
R, Sug iyama A,M izuno K, Yokom izo S, N iikura J, Ikeda R,
Ishib ik i J, Kawam ata M , Yoshmi ura A, M iura J, Kusumeg i
T, Oka M , Ryu R, Ueda M , Matsubara K, Kaw ai J, Carninc i
P, Adach i J, Aizawa K, Arakaw a T, Fukuda S, Hara A,
Hash izum eW , Hayatsu N, Imotan iK , Ishii Y, Itoh M , Kaga-
wa I, Kondo S, Konno H ,M iyazak i A, Osato N , Ota Y, Sa ito
R, Sasak i D , Sato K, Shibata K, Shinagawa A, Shirak i T,
Yoshino M, Hayashizak i Y, Yasunishi A. Collec tion, map-
p ing, and annotat ion of over 28, 000 cDNA c lones from ja-
ponica r ice. Sc ience , 2003, 301(5631):376 ～ 379.
[ 15] 　Sp iess A N, Ivell R. A highly eff ic ientm ethod for long-cha in
cDNA synthes is us ing treha lose and beta ine. Ana l B io-
chem , 2002, 301(2):168 ～ 174.
[ 16] 　Carn inc i P, N ishiyama Y, Wes tover A, Itoh M , Nagaoka S,
Sasak i N, Okazak i Y, Muram atsu M, Hayashizak i Y. Ther-
mos tab ilizat ion and thermoac tiva tion o f therm olab ile en-
zym es by treha lose and its applicat ion for the synthes is of
full leng th cDNA. P roc Na tl Acad Sc i USA , 1998, 95(2):
520～ 524.
[ 17] 　Carninc iP, Sh irak i T, M izuno Y,MuramatsuM , Hayashizak i
Y. Ex tra-long f irst-strand cDNA synthes is. B iotechniques.
2002, 32(5):984 ～ 985.
[ 18] 　Sambrook J, F rit ish E F, Manit is T. Mo lecular C loning:A
Laboratory Manau.l New York:Cold Spring Habor Labora-
tory Press, 2002.
[ 19] 　Wang S M, Fears S C , Zhang L, Chen J J, Row ley J D.
Sc reen ing po ly ( dA /dT)-cDNAs for gene identificat ion.
P roc Natl Acad Sc i USA , 2000, 97(8):4162～ 4167.
[ 20] 　Nam D K, Lee S, Zhou G, Cao X, Wang C , C lark T, Chen
J, Row ley J D, Wang S M. O ligo(dT) prmi er generates a
h igh frequency of truncated cDNAs through internal po ly
(A) prmi ing dur ing reverse transc ript ion. P roc Na tl Acad
Sc i USA , 2002, 99 (9):6152 ～ 6156.
[ 21] 　Pesole G, Liun iS, Gr illo G, Saccone C. Struc tural and com-
pos itiona l features o f untrans lated regions o f eukaryot ic
mRNAs. Gene , 1997, 205(1-2):95 ～ 102.
[ 22] 　Pesole G, G iss iC , Grillo G, L icc iulli F, Liun i S, Saccone C.
Ana lys is o f oligonuc leot ide AUG start codon contex t in eu-
kariot ic mRNAs. Gene , 2000, 261(1):85 ～ 91.
[ 23] 　Pesole G, M ignone F, G iss i C, Grillo G, Licc iulli F, Liuni S.
Struc tural and funct ional features of eukaryo tic mRNA
untrans lated regions. Gene, 2001, 276(1-2):73～ 81.
[ 24] 　M ignone F, G issi C , Liuni S, Pesole G. Untrans lated reg ion
ofmRNAs. Genom e B iol, 2002, 3(3):REV IEWS0004.
[ 25] 　Kozak M. Recognit ion AUG and a lternat ive in it iator codons
is augmented by G in position +4 but is not genera lly
affected by the nuc leo tides in pos itions +5 and +6. EMBO
J, 1997, 16(9):2482 ～ 2492.
[ 26] 　Kochetov A V, Syrn ik O A, Rogoz in I B, G lazko G V, Kom-
arova M L, Shumny i V K. Contex torganiza tion ofmRNA 5′-
untrans lated reg ions of higher plants. Mo l B iol(Mosk),
2002, 36(4):649 ～ 656.
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　　《作物学报》是中国科学技术协会主管 、中国作物学会和中国农业科学院作物科学研究所共同主办 、科
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