全 文 ：学 报
Journal of China Pharmaceutical University 2010，41(4) :363 － 366
酶联免疫法测定知母中菝葜皂苷元的含量
王 晶
1
，刘吉华
1
，张 剑
2
，余伯阳
1，2*
(1 中国药科大学中药复方研究室，南京 211198;2 中国药科大学现代中药重点实验室，南京 210009)
摘 要 应用菝葜皂苷元多克隆抗体建立检测知母中菝葜皂苷元含量的酶联免疫分析方法，结果显示其检测线性范
围为 20 ～ 1 311 ng /mL，最低检出浓度为 20 ng /mL。样品加样回收率为 92. 2% ～ 97. 1%，日内日间 RSD 均小于 14. 3%。以
所建立的方法检测 5 个产地知母中菝葜皂苷元的含量，检测结果与 HPLC-ELSD 分析结果一致。本实验建立的菝葜皂苷元
免疫分析方法具有简便、灵敏、快速的特点，可简化中药复杂体系中单一成分的含量测定。
关键词 酶联免疫法;多克隆抗体;菝葜皂苷元;知母
中图分类号 R917 文献标识码 A 文章编号 1000 － 5048(2010)04 － 0363 － 04
An enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of sarsasapo-
genin in Rhizoma Anemarrhenae
WANG Jing1 ，LIU Ji-hua1 ，ZHANG Jian2 ，YU Bo-yang1，2*
1 Department of Complex Prescription of Traditional Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198;
2 Key Laboratory of Modern Chinese Medicines，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China
Abstract Using polyclonal antibody against sarsasapogenin，an enzyme-linked immunosorbent assay ( ELISA)
for quantitative analysis of sarsasapogenin in Rhizoma Anemarrhenae was developed. The linear detection range of
sarsasapogenin was 20-1 311 ng /mL. The lowest limit of detection( LOD) of the assay was 20 ng /mL，and the re-
covery rate ranged from 92. 2% to 97. 1% . The relative standard deviation for intra- and inter- assays were less
than 14. 3% . To validate the immunoassay，the sarsasapogenin content of Rhizoma Anemarrhenae from 5 different
habitats were analyzed by the immunoassay and HPLC-ELSD. The results obtained by the two methods were con-
sistent. This immunoassay is simple，sensitive and rapid，and could simplify the determination of the single compo-
nents in multi-component system.
Key words ELISA; polyclonal antibody; sarsasapogenin; Rhizoma Anemarrhenae
This study was supported by the Key Project of Chinese Ministry of Education ( No. 08071) ; and the Program for Postgraduates
Research and Innovation in Universities of Jiangsu Province ( No. CX08B_192Z)
知母为百合科植物知母 Anemarrhena asphode-
loides Bge. 的干燥根茎。菝葜皂苷元(sarsasapoge-
nin，SAR)为知母中的代表皂苷元，具有多种药理
活性，能提高记忆衰退大鼠脑中 M 胆碱受体密
度［1］及具有抗抑郁功效［2］。目前所采用的含量分
析方法有薄层扫描法［3］和高效液相色谱-蒸发光散
射检测(HPLC-ELSD)法［4］，但这两种方法的灵敏
度均较低。酶联免疫方法(ELISA)具有灵敏度高、
设备要求低及样品前处理简单等优点。目前基于
小分子抗体的 ELISA 分析方法已有广泛应用，例
如 ELISA 法检测药物残留［5－ 9］、食品添加剂含
量［10］以及中药材含量［11］。本研究通过制备菝葜
皂苷元多克隆抗体，建立 ELISA 分析方法，对知母
药材中的 SAR 进行了含量分析，该方法样品前处
理简单，不需高效液相色谱测定中待测成分与杂质
的分离，适合于中药复杂体系中成分的检测。
363
* 收稿日期 2010-04-20 * 通讯作者 Tel:025 － 86185158 E-mail:boyangyu59@ 163. com
基金项目 教育部科学技术研究重点项目资助(No. 08071) ;江苏省普通高校研究生科研创新计划资助项目(No. CX08B_192Z)
学 报 Journal of China Pharmaceutical University 第 41 卷
1 材 料
1. 1 试 剂
N，N-二环乙基碳化亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰
亚胺(NHS)、卵清白蛋白(OVA)、弗氏完全佐剂、弗
氏不完全佐剂、甘草酸二铵(美国 Sigma 公司) ;牛血
清白蛋白(BSA，美国 Roche 公司) ;琥珀酸酐(化学
纯，国药集团化学试剂有限公司) ;TMB(美国 Am-
resco 公司) ;HRP 标记山羊抗兔 IgG(美国 Jackson
公司) ;菝葜皂苷元、三七皂苷 R1(纯度 ＞ 98%，芜湖
甙尔塔医药科技公司) ;25(R，S)Ruscogenin 1-O-［β-
D-glucopyranosyl(1→ 2) ］［β-D-xylopyranosyl(1→
3) ］-β-D-fucopyranoside(DT-13，纯度 ＞ 96%，中国药
科大学中药复方研究室从短葶山麦冬中分离得到) ;
薯蓣皂苷元(diosgenin)、鲁斯可皂苷元(ruscogenin)
(纯度 ＞ 96%，中国药科大学中药复方研究室从麦冬
中分离得到) ;甲醇(色谱纯，江苏永华精细化学品
有限公司) ;其他试剂均为市售分析纯。
1. 2 仪 器
A-5080 型酶标仪(奥地利 Tecan 公司) ;LC-
10A 型高效液相色谱仪(日本岛津公司) ;2000ES
型蒸发光散射检测器(美国奥泰公司) ;酶标板(美
国 Costar 公司)。
1. 3 动 物
新西兰大白兔，雄性，体重 2. 5 kg，购自南京市
江宁区青龙山动物繁殖场，合格证号 No. SCXK
(苏)2007-0008。
2 方 法
2. 1 完全抗原的合成
采用琥珀酸酐法将 SAR 与琥珀酸酐酯化形成
菝葜皂苷元琥珀酰酯(SAR-HS) ，再以活泼酯法将
SAR-HS 与载体蛋白 BSA，OVA 偶联，制备得到完
全抗原 SAR-HS-BSA 用于免疫，SAR-HS-OVA 用于
分析检测。
2. 2 动物免疫
以 SAR-HS-BSA 免疫新西兰大白兔，免疫剂量
为每只 1 mg，初次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，
间隔 14 d 加强免疫，采用弗氏不完全佐剂乳化抗
原。加强免疫后的第 7 天从兔耳缘静脉取血，间接
ELISA 方法测定血清效价。末次免疫后第 7 天，兔
颈动脉放血，血浆室温放置 1 h，4 ℃ 过 夜，
4 000 r /min离心 10 min，上层血清于 － 20 ℃保存。
2. 3 SAR 多克隆抗体效价的检测
参照文献［12］，采用间接 ELISA 的方法测定
血清中抗体的效价。SAR-HS-OVA 4 ℃包被酶标
板过夜，洗涤后每孔加入封闭液 150 μL，37 ℃反应
1 h。洗涤后加入从 1 000 倍开始倍比稀释的待测
血清和阴性血清，每孔 100 μL，37 ℃反应 2 h。酶
标板洗涤后加入 HRP 标记的羊抗兔 IgG (1 ∶
40 000 倍稀释) ，每孔 100 μL，37 ℃反应 1 h。洗
涤后加入 TMB 底物液，每孔 100 μL，显色 15 min
后每孔加入 2 mol /L H2 SO4 50 μL 终止反应。酶标
仪 450 nm 测定吸收度。
2. 4 标准曲线的制备
用 SAR 多克隆抗体，建立间接竞争 ELISA 分
析检测方法。参照文献［13］，封闭后的酶标板加
入工作浓度的多克隆抗体 50 μL 和质量浓度分别
为 10，50，100，500，1 000，5 000 ng /mL 的 SAR 标
准品溶液 50 μL。其他步骤与间接 ELISA 方法相
同。加入 SAR 时的吸收度为 A，不加 SAR 的吸收
度为 A0，以 A /A0 为纵坐标，竞争药物浓度的对数
值为横坐标，得到竞争抑制曲线。再以 ln［(A /
A0)/(1 － A /A0) ］为纵坐标，竞争药物浓度的对数
值为横坐标，将上述曲线化为直线，计算 IC20 ～
IC80，即得多克隆抗体检测 SAR 的线性范围。
2. 5 SAR 多克隆抗体交叉反应
将鲁斯可皂苷元、薯蓣皂苷元、DT-13、三七皂
苷 Rg1、甘草酸二铵，同“2. 4”项方法分别作为竞争
药物用间接竞争 ELISA 方法做抑制曲线，计算 IC50
和交叉反应率。交叉反应率 =［IC50(SAR)/ IC50
(竞争药物) ］× 100%。
2. 6 待检测样品制备
2. 6. 1 对照品溶液制备 精密称取菝葜皂苷元对
照品适量，加甲醇配制成质量浓度为 1 mg /mL 的
溶液。
2. 6. 2 供试品溶液制备 根据文献［14］方法，取
知母药材，粉碎，过 60 目筛，精密称取药材粉末
0. 5 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇 25 mL，静置过
夜，超声处理 40 min，过滤，精密量取续滤液
10 mL，蒸干，加入 10%盐酸 11 mL，沸水浴加热回
流 2 h，40% NaOH 中和。氯仿萃取两次，每次
30 mL。合并氯仿层，回收溶剂，残渣用甲醇溶解
定容至 2 mL。
463
第 4 期 王 晶等:酶联免疫法测定知母中菝葜皂苷元的含量
2. 7 ELISA 法与 HPLC-ELSD 法的相关性
2. 7. 1 色谱条件［14］ 色谱柱:Diamonsil 柱(250
mm × 4. 6 mm，5 μm) ;流动相:甲醇-水(95 ∶ 5) ;流
速:1. 0 mL /min;漂移管温度:63 ℃;载气流速:1. 7
L /min。
2. 7. 2 相关性检测 SAR 对照品溶液稀释成质
量浓度为 100，150，200，250，300，350 μg /mL 的溶
液，用 HPLC-ELSD 测定。此各浓度溶液稀释 500
倍后，用 ELISA 测定，考察 HPLC-ELSD 测定值和
ELISA 测定值之间的相关性。
2. 8 知母中 SAR 含量测定
2. 8. 1 重复性试验 精密称取知母药材粉末
0. 5 g，平行 6 份，按“2. 6. 2”项下方法制备供试品
溶液，间接竞争 ELISA 法测定含量，计算 6 份药材
含量之间的相对标准偏差(RSD)。
2. 8. 2 加样回收率及精密度试验 精密称取知母
药材粉末 0. 25 g，平行 9 份，置具塞锥形瓶中，精密
加入菝葜皂苷元标准品 0. 9，1. 5，2. 1 mg，按
“2. 6. 2”项下方法制备待检测溶液，间接竞争
ELISA 方法测定含量，计算回收率和日内精密度。
同时精密称取知母药材粉末 0. 25 g，连续 3 d 精密
加入菝葜皂苷元 0. 9 mg，测 定 含 量，计 算 日
间 RSD。
2. 8. 3 不同产地知母药材含量的测定 取 5 个产
地的知母药材，粉碎过筛，按“2. 6. 2”项下方法制
备供试品溶液，采用间接竞争 ELISA 法和 HPLC-
ELSD 法分别测定 SAR 含量。
3 结 果
3. 1 完全抗原的合成
质谱测定给出了 SAR 的分子离子峰 417. 4
［M + H］+，而其对应的产物 SAR-HS 的分子离子
峰为 517. 4［M + H］+，产物的相对分子质量增加
了 100，与琥珀酸单酰基的相对分子质量相符;而
在 SAR-HS 红 外 光 谱 上，在 1 731. 43 cm － 1，
1 706. 21 cm － 1 处 有 明 显 的 羰 基 吸 收 峰，且 在
984. 74，910. 12，895. 55，851. 15 cm － 1处有螺甾烷
的特征吸收，为菝葜皂苷元已连接上琥珀酸酐提供
了进一步的证据。对于 SAR-HS 进一步连接上
BSA 生成的产物 SAR-HS-BSA，由于其红外光谱除
了在 985. 91，926. 51，898. 14，866. 29 cm － 1具有螺
甾烷型甾体皂苷的特征吸收峰外，在 3 600 ～ 3 200
cm － 1和 1 700 ～ 1 600 cm － 1区域增加了与 BAS 相
同的氨基酸特征吸收峰，说明 SAR-HS 已被成功地
接上了 BSA，标志着完全抗原的成功合成。
3. 2 多克隆抗体效价检测
抗体效价判定原则:P 为阳性血清吸收度;N
为阴性血清吸收度。以 P /N≥2. 1 且 P － N ＞ 0. 2
的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。当兔免疫
6 次后，血清效价达到 32 000。
3. 3 抗体检测线性范围
应用 SAR 多克隆抗体建立 ELISA 检测方法，
得到线性方程 y = － 1. 533 7 x + 3. 395 4，线性范围
为 20 ～ 1 311 ng /mL，r = 0. 993 4。最低检出浓度为
20 ng /mL。
3. 4 SAR 多克隆抗体的交叉反应性
SAR 多克隆抗体与结构类似的甾体皂苷元薯
蓣皂苷元、鲁斯可皂苷元和甾体皂苷 DT-13 有一定
程度的识别能力(交叉反应) ，交叉反应率分别为
22%、23%和 26%;而与结构相差较大的甘草酸二
铵和三七皂苷 R1 几乎无交叉反应(交叉反应率均
小于 0． 01%)。
3. 5 HPLC-ELSD 和 ELISA 的相关性
不同浓度 SAR 标准品 ELISA 测定结果与
HPLC-ELSD 的测定结果基本一致，具有相关性，相
关性方程为 y = 1. 010 8 x － 11. 711，r = 0. 992 6。
3. 6 重复性
同一来源知母药材样品 6 份，ELISA 测得菝葜
皂苷元含量为 0. 6%，RSD 为 3. 7%。
3. 7 回收率测定和日内日间精密度
知母药材添加菝葜皂苷元标准品 0. 9，1. 5，
2. 1 mg 时，间接竞争 ELISA 测得样品的加样回收率
分别为 92. 2%、96. 0% 和 97. 1%;日内精密度为
12. 0%、6. 9%和 4. 4%。日间精密度为 14. 3%(表 1)。
Table 1 Recovery of sarsasapogenin (SAR)determinated by ELISA
(x ± s，n = 3)
Added /mg Found /mga RSD /% Recovery /%
0. 9 0. 83 ± 0. 10 12. 0 92. 2
1. 5 1. 44 ± 0. 10 6. 9 96. 0
2. 1 2. 04 ± 0. 09 4. 4 97. 1
a SAR in added samples was extracted with sample prepara-
tion. Measured amount of added SAR = total amount of SAR after
added － the amount in the herb
3. 8 不同产地知母药材的含量测定
对 5 个产地的知母药材按“2. 6. 2”项下方法
563
学 报 Journal of China Pharmaceutical University 第 41 卷
处理后，用 ELISA 和 HPLC-ELSD 方法分别进行了
含量测定。测定结果见表 2。
Table 2 Determination of SAR in Rhizoma Anemarrhena by ELISA
(x ± s，n = 3)
Source
Content /(mg / g)
ELISA HPLC-ELSD
Hunan 2. 01 ± 0. 10 1. 94 ± 0. 03
Jilin 2. 93 ± 0. 06 2. 82 ± 0. 03
Hebei 11. 51 ± 0. 16 11. 96 ± 0. 06
Anhui 6. 00 ± 0. 22 5. 77 ± 0. 22
Shanxi 9. 89 ± 0. 21 9. 20 ± 0. 10
4 讨 论
酶联免疫检测方法具有快速、灵敏的优点，实
现酶联免疫检测优势的关键在于制备抗体。皂苷
元相对分子质量较小，不能刺激机体产生抗体，须
与大分子蛋白偶联后才具有免疫原性。而与蛋白
偶联，需引入活性基团，如羧基、羟基、氨基和巯基
等。本实验通过琥珀酸酐将 SAR 衍生化引入羧
基，再将此反应产物与载体蛋白偶联形成完全抗原
后免疫动物产生抗体。
本实验建立了 SAR 多克隆抗体的 ELISA 分析
方法，并对其特异性、准确度、灵敏度进行了评价。
研究结果表明 SAR 多克隆抗体具有较高的特异
性，能特异性识别甾体皂苷的螺甾烷结构。此外，
实验所建立的 ELISA 分析方法，检测灵敏度高，线
性范围是 20 ～ 1 311 ng /mL。回收率和日内日间
RSD 均达到生物分析要求，具有较好的稳定性和
准确性。此分析方法与 HPLC-ELSD 方法具有良好
的相关性，并且与 HPLC-ELSD 方法相比样品前处
理简单，测定过程中不需 HPLC 分析时杂质峰与待
测峰的分离，更具有简便、灵敏、快速、分析成本低
的特点。能够实现中药多组分中单一成分的快速
检测，同时可利用多孔酶标板同时测定上百个样
品，适合于大批量样品快速检测的需求。本实验方
法为制备 SAR 单克隆抗体奠定了基础，也为提供
大量稳定且效果均一的试剂盒作了准备。
参 考 文 献
［1］ Hu YE，Xia ZQ，Sun QX，et al． A new approach to the pharma-
cological regulation of memory:sarsasapogenin improves memory
by elevating the low muscarinic acetylcholine receptor density in
brains of memory-deficit rat models［J］． Brain Res，2005，1 060
(1 /2) :26 － 39.
［2］ Ren LX，Luo YF，Li X，et al． Antidepressant-like effects of sar-
sasapogenin from Anemarrhena asphodeloides Bunge (Liliaceae)
［J］． Biol Pharm Bull，2006，29(11) :2 304 － 2 306.
［3］ 任爱农(Ren AN) ，季锡忠(Ji XZ) ，龙湘鸿(Long XH)． 知母
中菝葜皂甙元含量测定方法探讨［J］． 中成药(Chin Trad Pat
Med) ，2000，22(2) :171 － 172.
［4］ 党小平(Dang XP) ，毛春芹(Mao CQ) ，陆兔林(Lu TL) ，等 ．
HPLC 法测定生知母和盐知母中芒果苷和菝葜皂苷元［J］．
中草药(Chin Trad Herb Drugs) ，2009，40(2) :236 － 238.
［5］ 余宇燕(Yu YY) ，唐舒雅(Tang SY) ，庄惠生(Zhuang HS)．
五氯酚人工抗原的合成与多克隆抗体的制备［J］． 农业环境
科学学报(J Agro-Environ Sci) ，2007，26(1) :314 － 317.
［6］ 王玉坤(Wang YK) ，李锦程(Li JC) ，曹远银(Cao YY)． 兔抗
灭多威多克隆抗体的制备［J］． 江苏农业科学(Jiangsu J
Agric Sci) ，2008，36(2) :79 － 81.
［7］ 李彬彬(Li BB) ，侯玉泽(Hou YZ) ，邓瑞广(Deng RG) ，等 ．
氧氟沙星人工抗原的合成与多克隆抗体的制备［J］． 食品科
技(Food Sci Technol) ，2009，34(9) :6 － 10.
［8］ 李方实(Li FS) ，孙 峰(Sun F) ，刘贤进(Liu XJ) ，等 ． 抗异
丙隆多克隆抗体的研制［J］． 中国农业科学(Sci Agr Sin) ，
2007，40(2) :298 － 303.
［9］ Haasnoot W，Cazemier G，Koets M，et al． Single biosensor immu-
noassay for the detection of five aminoglycosides in reconstituted
skimmed milk［J］． Anal Chim Acta，2003，488(1) :53 － 60.
［10］ Ju CM，Tang Y，Fan HY，et al． Enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA)using a specific monoclonal antibody as a new
tool to detect Sudan dyes and Para red［J］． Anal Chim Acta，
2008，621(2) :200 － 206.
［11］ Kido K，Edakuni K，Morinaga O，et al． An enzyme-linked immu-
nosorbent assay for aconitine-type alkaloids using an anti-aconi-
tine monoclonal antibody［J］． Anal Chim Acta，2008，616(1) :
109 － 114.
［12］ 张 华(Zhang H) ，陆 莹(Lu Y) ，赵 虎(Zhao H) ，等 ． 海
洋真菌多糖 YCP 多克隆抗体的制备和鉴定［J］． 药物生物技
术(Pharm Biotechnol) ，2008，15(2) :100 － 103.
［13］ Sahamoto S，Putalun W，Tsuchihashi R，et al． Development of an
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)using highly-spe-
cific monoclonal antibodies against plumbagin［J］． Anal Chim
Acta，2008，607(1) :100 － 105.
［14］ 宋 坤(Song K) ，陆兔林(Lu TL) ，季 德(Ji D)． 不同产
地、不同炮制品知母中菝葜皂苷元含量的比较研究［J］． 中
国药师(China Pharm) ，2009，12(10) :1 338 － 1 340.
663