全 文 ：·方药研究 ·
湖南药用植物菝葜种质资源亲缘关系研究
InvestigationofGeneticRelationshipforMedicinalPlantGermplasmResourceofSmilaxinHunanProvince
仇萍1 ,盛孝邦 1 ,彭琦 1 ,魏然1 ,刘春林 1 ,黄宇明 2 ,张光贤2 ,宋思才 2
(1.湖南农业大学 ,湖南　长沙　410128;2.怀化正好制药有限公司　湖南　怀化　418000)
[摘要 ] 　目的:探讨湖南药用植物菝葜种质资源的亲缘关系。方法:以湖南金刚藤主产区的 15个菝葜材料为研究对象 ,
用 RAPD技术对其进行亲缘关系分析。在建立适合菝葜植物的 PCR-RAPD反应体系的基础上 , 从 45个随机引物(10 mer)
中筛选出 14条 ,对所有供试材料进行正式扩增 , 共获得 14张 DNA指纹图谱 , 144条 DNA谱带 , 其中有 135条为多态带。建立
了基于 RAPD的菝葜植物亲缘关系树形图。结果:成功地将湖南金刚藤主产区的菝葜植物划分为明山类 、会同类 、靖州类 、雪
峰山类和鸡公界类的菝葜归为会雪类 、靖鸡类和明山类。会雪类与靖鸡类与明山菝葜相比较 , 会雪类与靖鸡类的亲缘关系又
较近。结论:本研究揭示了湖南省不同菝葜类型之间亲缘关系 , 这个研究结果是国内外首次对湖南不同菝葜类型之间亲缘关
系的报道。
[关键词 ] 　菝葜植物;RAPD;亲缘关系分析
[ Abstract] 　Objective:ToinvestigatethegeneticrelationshipformedicinalplantgermplasmresourceofsmilaxinHunanprov-
ince.Methods:FifteenSmilaxmaterialsinHunanprovinceweremadeasstudyobjects, theirgeneticrelationshipwereanalyzedby
randomamplifiedpolymorphicDNAmarkers(RAPD)technology.14 primerswerescreenedfrom 45 arbitrary10-merprimers, and
totalof144DNAbandswereamplified, 135ofwhich(95.4%)werepolymorphism.Accordingtothedata, atreediagramofgenetic
relationshipwasconstructed.Results:Smilaxplants, whichhadbeenclassified5groups, Mingmountaingroup, Huitonggroup, Jing-
zhougroup, XuefengmountaingroupandJigongmountaingroup, weredividedintoHuixuegroup, JingjigroupandMingmountain
group.AndHuixuegroupandJingjigrouptookonintimaterelationshipamongthreegroups.Conclusion:Thestudiesindicatethege-
neticrelationshipindifferentpaternsofsmilaxinHunanprovince, thatsfirstdomesticreportonthisstudy.
[ Keywords] 　Smilax;RAPD;Geneticrelationship
[中图分类号 ] R282.7　[文献标识码 ] A　[文章编号 ] 1672-951X(2007)12-0061-03
　　菝葜(SmilaxchinaL.)为百合科菝葜属(SmilaxL.)植
物 , 别名:金刚藤 、金刚刺 、铁菱角 、马加勒 、筋骨柱子 、红灯果
等 [ 1, 2] 。在我国 400年前就有 “菝葜”作药用的记载 , 始载于
《名医别录》。民间称药用 “菝葜”为金刚藤 , 其根茎具有祛
风利湿 , 解毒散瘀的功效。 菝葜属植物广泛分布于我国湖
南 、湖北 、浙江 , 四川 、陕西等地 [ 3] , 湖南省的资源普查发现有
12种 [ 4] 。由于菝葜属植物外观形态相似 , 人们一般笼统地
称之为 “金刚藤 ”, 据查俗名 “金刚藤”的原植物达 14种之
多 [ 5] ,来源于 4个不同的科 ,药农都将其作为 “金刚藤”药材
采挖 , 以至在药材的收购 、应用中出现多种原植物和混伪品
等情况。因此 , 为了保证金刚藤药材质量 , 对湖南金刚藤药
材原植物主产区的菝葜属资源进行分类学和系统生物学研
究 , 查清楚菝葜资源种属关系和不同来源的菝葜材料之间的
亲缘关系具有重要意义。
目前 , 用于生物资源保护利用和鉴别的一个重要的手段
是 DNA分子标记技术。 DNA分子标记技术有很多种 , 其中
RFLP、RAPD、SSR、AFLP较为常用。而在对研究对象的分子
遗传背景一无所知的情况下 ,要想对研究对象进行亲缘关系
分析 , 以便有效地保护利用生物资源 , 最直接 , 最有效的方法
就是进行 RAPD分子标记研究 [ 6 ～ 14] 。因此 ,利用 RAPD分析
技术 , 对湖南菝葜资源进行分子标记和亲缘关系研究 , 有利
于湖南药用菝葜资源的保护和利用 ,为将来鉴别菝葜药材的
真伪 , 为药厂建立药材的标准提供可靠的知识支撑。
1　材料和方法
1.1　材料　分别从金刚藤主产区芷江明山 、会同 、靖州 、雪
峰山和鸡公界 5个地区采集 , 根据菝葜的分布情况 , 每个地
区选取 1 ～ 5个采样点 ,每个采样点取 10个单株。每个采样
点选取 1个单株用于形态观察;每个采样点取 10个单株的
分别提取总 DNA, 然后按照等量原则 ,分别取一定量的 DNA
于 1个试管中 , 混匀用于 RAPD分析的 DNA模板 ,以次代表
某一采样点的遗传基础 。 1 ～ 15编号分别代表:1为采自芷
江明山下 1个点的材料;2～ 4为采自会同的 3个点的材料;5
～ 6为采自靖州寨芽的 3个点的材料;8 ～ 10为采自雪峰山
大峰的 3个点的材料;11 ～ 15为采自鸡公界的 5个点的材
料。
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取和质量检测　参照《植物遗传手
册》植物基因组总 DNA提取方法 , 并根据李属植物的特征进
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DOI :10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2007.12.032
行了修改。 DNA的质量和浓度检测在 DU-640核酸蛋白质
分析仪上进行。根据所测得的浓度 , 取样品 DNA在 14 gL-
1的琼脂糖凝胶上电泳 , 以 λDNA/EcoⅠ +HindⅢ为 Marker,
并推算出 DNA分子的大小。
1.2.2　PCR反应体系与反应热循环程序　PCR反应体系
为:引物浓度为 0.20 μmol/L, dNTP为 200 μmol/L, TaqDNA
聚合酶为 2 U,模板 DNA为 40ng, Mg2+为 2μmol/L。反应热
循环程序为:预变性 94 ℃, 3 min;变性 92 ℃, 50 s;退火
35 ℃, 50 s;循环 39次 , 延伸 72 ℃, 100 s;后延伸 72 ℃, 5
min。
1.2.3　引物的筛选与扩增产物的电泳　从 45个随机引物
(10mer)中筛选出 14条(S1 -S5, S7 -S8, S11 -14, S40 -
42。其序列见 Sangon产品说明书)有稳定的扩增产物的随
机引物进行 PCR扩增。 PCR产物在 17 g/L的琼脂糖凝胶上
(内含 0.5 μgm/L溴化乙锭)电泳 , 电压 85 V, 电泳 4 h。
Marker同上。电泳结果在 GelDoc1000凝胶分析系统上进
行数据采集 、处理 、分析和结果输出。
1.2.4　数据处理　将每个 PCR反应重复 1次 ,选择重现性
好且稳定的扩增反应和谱 1带 , 每条 DNA谱带作为一个单
位 , 同一 RAPD位点上有带的赋值为 1, 无带的赋值为 0。对
15个材料 14个引物扩增的结果进行统计 , 以 1、 0矩阵输入
计算机 , 用 UPGMA(unweightedpairgroupmethodwitharith-
meticmean)法对材料进行聚类分析。
2　结果与分析
2.1　供试材料基因组 DNA的扩增结果　将筛选出的 14条
随机引物(10bp)对供试的 15个材料进行正式扩增(每个扩
增反应均重复 1次),扩增产物的电泳后得到了菝葜材料基
因组 DNA的指纹图谱(见图 1)。这 14条引物共扩增得到
144条电泳带 ,其中有多态性带 135条 ,检测到了 135个多态
性位点 , 多态率约为 94%(见表 2)。图中 1 ～ 16代表:1为
DNA分子量标记;2 ～ 16为菝葜材料。
图 1　菝葜 RAPD指纹图谱
图 1-a为 S3的扩增结果 ,图 1-b为 S5的扩增结果 ,图 1-c为 S14的扩增结果 , 图 1-d为 S40的扩增结果。
表 1　14个随机引物对 15个供试材料的扩增结果
引物 扩增带数 多态带 多态带百分率 引物 扩增带数 多态带 多态带百分率
S1 7 3 42.8 S11 11 10 95.2
S2 12 12 100 S12 10 8 80.0
S3 9 9 100 S13 8 7 87.7
S4 7 7 100 S14 15 15 100
S5 16 16 100 S40 9 9 100
S7 13 11 84.6 S41 7 7 100
S8 13 13 100 S42 8 8 100
2.2　聚类分析　将每个反应体系重复 1次 , 选择重现性好
且稳定的扩增反应和谱带 ,每条 DNA谱带作为一个单位 ,有
带的赋值为 1,无带的赋值为 0。对 15个材料的 14个引物扩
增的结果进行统计 , 以 1、0矩阵输入计算机。各材料间的遗
传距离 D为纵坐标 ,材料编号为横坐标。根据已知的相似性
系数计算出遗传距离 , 利用 STATSOFT软件进行各材料间
UPGMA(unweightedpairgroupmethodwitharithmeticmean)聚
类分析(见图 2)。 1 ～ 15分别为:1明山;2 ～ 4会同;5 ～ 7靖
州寨芽;8～ 10雪峰山大峰;11 ～ 15鸡公界。
图 2　不同菝葜材料间的亲缘关系
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　　当遗传距离 D值取 0.1883时 , 这些菝葜材料可以分为 6
大类 , 与采集地基本一致 , 能很好地划分为明山类 、会同类 、
靖州类 、雪峰山类和鸡公界类 , 另外加上来自鸡公界类 , 却聚
类到鸡公界类之外的 13号。从聚类关系来看 , 会同的菝葜
先与雪峰山的菝葜聚到一起;靖州的菝葜先与鸡公界的菝葜
聚到一起;然后这两类再聚到一起形成一大类。这一大类再
依次与来自鸡公界的 13号菝葜聚到一起 , 最后再与明山的
菝葜聚到一起。所以从亲缘关系角度来看 , 会同的菝葜先与
雪峰山的菝葜亲缘关系较近(简称会雪类);靖州的菝葜先与
鸡公界的菝葜亲缘关系较近(简称靖鸡类)。 会雪类与靖鸡
类与明山菝葜相比较 ,会雪类与靖鸡类的亲缘关系又较近。
3　讨　　论
金刚藤就其对应的药用植物而言 , 不是一一对应的。同
样是金刚藤 , 可能是来自植物学分类的不同种。目前国内市
场商品金刚藤的主要来源为菝葜属植物 , 但是为不同种植
物 , 这样一种局面无法保证药效。而 2005版《中国药典》收
载的菝葜药材 , 只是对植物菝葜(SmilaxchinaL.)干燥根茎
的描述 , 这种描述与鉴定方法无法保证菝葜药材具有相同的
物种来源。为了确定目前市场上销售的有效中药金刚藤的
原植物来源 , 为了中药金刚藤市场的规范化 , 对目前市场上
销售的中药金刚藤来源的原植物进行植物学分类和系统学
分析势在必行。
通过对我省雪峰山脉药用菝葜植物的形态和 DNA分子
标记研究 , 确定了我省主产区药用菝葜(金刚藤)原植物有菝
葜 (SmilaxchinaL.)和 肖 菝 葜 (Heterosmilaxjaponica
Kunth), 粉菝葜(Smilaxglauco-chinaWarb), 牛尾菜(Smilax
ripariaA.DC.)。会同 、雪峰山的菝葜都属于菝葜这个物种;
靖州与鸡公界的菝葜属于粉菝葜这个物种。此外还发现了
牛尾菜和肖菝葜 (HeterosmilaxjaponicaKunth)这两个物种。
确定了我省主产区中药金刚藤原植物来源于菝葜属植物的
菝葜(SmilaxchinaL.)、粉菝葜(Smilaxglauco-chinaWarb),
牛尾菜(SmilaxripariaA.DC.), 还有肖菝葜属的肖菝葜
(HeterosmilaxjaponicaKunth)。这一结果对药用金刚藤的来
源鉴定提供了一个可靠的区分标准。
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(收稿日期:2007-09-24　编辑:湘泉)
(上接第 49页)白术 、太子参 、黄精 、陈皮 、半枝莲 、半边莲 、
白花蛇舌草 、三棱 、莪术 、肿节风 、冬虫夏草 、女贞子之类。
3.2　化疗与中医结合　化疗配合中药治疗能明显提高疗
效。化疗前按中医辨证施治原则 , 以改善病情与体质 , 为化
疗创造条件。化疗过程中 , 中药以控制 、预防化疗的毒副反
应为主 , 贵在健脾和胃 ,益气养阴。常用石斛 、玉竹 、沙参 、牡
丹皮 、赤芍 、半夏 、黄芪 、白术 、枳实 、柿蒂 、白扁豆 、芡实 、莲
肉 、丹参。化疗疗程间隔期 ,以益气补血为主 , 以促进体质恢
复 , 常用黄芪 、白术 、茵陈蒿 、当归 、川芎 、鸡血藤 、白芍 、黄精 、
补骨脂 、女贞子之类。化疗结束后当扶正祛邪 , 防止复发 ,常
用黄芪 、茯苓 、白术 、当归 、半枝莲 、半边莲 、夏枯草 、干蟾皮 、
龙葵 、白花蛇舌草 、冬虫夏草。
(收稿日期:2007-10-17　编辑:季铁铮)
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