全 文 ：中南大学学报(医学版)
J Cen tSou th Univ (M ed S ci)　2007, 32(2)
*
复方菝葜颗粒对非小细胞肺癌 A549细胞
Bcl-2和 Bax基因表达的影响
李广诚 , 董克礼 , 胡灿红
(中南大学湘雅三医院中医科 , 长沙 410 013)
[ 摘要 ] 　目的:观察复方菝葜颗粒 ( com pound rhizom a sm ilac inus g ranu le, CRSG)对非小细胞肺癌 A 54 9
细胞 Bc l-2 和 Bax mRNA 表达水平的影响 , 探讨 CRSG 抑制非小细胞肺癌的作用机制 。 方法:雄性 SD大
鼠 30只 , 随机分为两组 , 每组 15只 。 一组灌服复方菝葜颗粒 , 2次 /d;另一组灌服等剂量的蒸馏水 , 第
6次灌胃后的 2 h提取血清 。 A 549 细胞株随机分为中药实验组 、西药对照组 、正常对照组 , 分别加入
10%的含药血清 、顺铂 3 μg /mL和 10% SD大鼠血清 , 培养 48 h后收集细胞 , RT-PCR测定 Bcl-2 和 Bax
mRNA的表达水平 。 结果:各组细胞培养 48 h 后中药实验组 、西药对照组细胞 Bcl-2 mRNA 表达下调 ,
Bax mRNA表达上调 , B cl-2 /Bax比值则显著降低 , 与正常对照组比较差异均有统计学意义 (P <0. 01)。
结论:非小细胞肺癌 A 549细胞存在 B cl-2 mRNA 高表达 、Bax mRNA 低表达 , 复方菝葜颗粒干预后可使
Bax mRNA表达量显著增加 , B cl-2 mRNA表达及 B cl-2 /Bax比例显著降低 , 这可能是其对非小细胞肺癌
发挥抑瘤作用的分子机制之一 。
[ 关键词 ] 　 复方菝葜颗粒;　非小细胞肺癌;　A5 49细胞;　Bcl-2;　Bax
[ 中图分类号 ] 　R 743. 2　　[文献标识码 ] 　A　　[ 文章编号 ] 　1 672-734 7(2 007)02-031 2-04
Effect of compound Rhizoma Sm ilacinus granules on the expression of
Bcl-2 and Bax gene in A549 cell lines of non-small cell lung cancers
LIG uang-cheng , DONG Ke-li, HU Can-hong
(D epartm ent o f Trad itiona l Ch inese M ed icine, Th ird X iangya Hospi ta l, Cen tra l Sou th Universty , Chang sha 410003, China)
Abstract:　Objective　 To de term ine the effect o f compound Rh izom a Sm ilacinus g ranules
(CRSG) on the exp ression o fBcl-2 and Bax gene in A 549 ce ll lines , and to explore the mechanism
of CRSG on non-sm all ce ll lung cance rs. M ethods　 The SD rats we re random ly divided into 2
groups:one w as adm inistrated w ith CRSG (n =15), and the o ther w ith the same dose o f distilled
w a te r (n =15). The herbage-conta in ing serum was obtained 2 hours after the 6 th trea tmen t. Non-
sma ll lung cance rA 549 ce ll line s we re random ly divided into CRSG group , diamm inedich lo roplatinum
(DDP) group and no rmal control g roup , which w e re cu ltivated w ith 10% he rbage-containing serum ,
DDP (3 g /mL), and 10% SD rats se rum respec tively. The cultivated cells w ere co llec ted after 48
hours, and then RT-PCR techn ique w as used to de te rm ine the expression of Bcl-2 and Bax mRNA.
Results　Compared w ith the no rm al con tro l group a fte r 4 8 h , the level o fBcl-2 mRNA and the rate
of Bcl-2 /Bax decreased in the CRSG group and the DDP g roup , and the leve l o f Bax mRNA in-
creased w ith sign ificant difference (P <0. 01). Conclusion　Non-sma ll ce ll lung cance rA 549 ce ll
lines have a high level o fBcl-2 mRNA and a low level o fBax mRNA. CRSG can significan tly dow n-
312
* 收稿日期(D ate of reception)　 2006-06-16
作者简介(Biography)　李广诚(1969-),男 ,江西九江人 ,主治医师 ,博士 ,主要从事中西医结合老年病的研究。
通讯作者(Corresponding author)　董克礼 , E-m ail:Dongkeli666@ sina. com
复方菝葜颗粒对非小细胞肺癌 A549细胞 B cl-2和 B ax基因表达的影响　李广诚,等
regu la te the expression ofBcl-2 mRNA and the ra te o fBcl-2 /Bax , and obviously up-regula te the ex-
p ression of Bax mRNA , wh ich probably is one o f the molecu la rmechan isms of CRSG in inh ib iting the
grow th o f non-sma ll cell lung cancers.
Key words:　 compound Rhizoma Sm ilacinus g ranule;　 non-small cell lung cance r;　A 549
ce ll lines;　Bcl-2;　Bax
[ J Cen t South Un iv (Med S ci), 2007 , 32(2):0312-04]
　　肺癌是一种严重威胁人民健康和生命的疾
病 。半个世纪以来 ,世界各国肺癌的发病率和死
亡率都有明显增高的趋势 ,现已成为全球最主要
的癌症 [ 1] 。近年来研究表明 , 肺癌的发生与某些
癌基因的活化及抑癌基因的失活密切相关 , 癌基
因表达过高 、抑癌基因表达减弱 、细胞凋亡特性减
弱等均可导致细胞恶性转化 。其中 Bcl-2 基因家
族在肿瘤的凋亡调控中发挥重要作用 [ 2] 。目前放
疗 、化疗 、手术是肺癌的主要治疗措施 , 但存在费
用贵 、副作用大等弊端 , 5年生存率仅在 14%左
右 [ 3] 。中药以其有效 、低毒的特点在肿瘤治疗领
域越来 越受 到重 视 。复 方菝 葜颗 粒 ( com pound
Rhizom a Sm ilacinus granule , CRSG)是经过 30多年临
床实践 ,结合现代药理研究形成的治疗肺癌的中
药复方制剂 ,临床治疗原发性支气管肺癌 50例取
得满意的疗效 [ 4] 。复方菝葜颗粒前期的研究工作
尚未涉及到基因水平 ,目前探讨中药复方制剂含
药血清对非小细胞肺癌的作用机制主要是从细胞
水平进行研究的 。由于中药血清药理学方法较传
统的中药药理研究方法有利于应用细胞学和分子
生物学手段 , 故本研究拟通过中药血清药理学方
法从基因水平探讨 CRSG 抑瘤作用的分子机制 [ 5] 。
1　材料与方法
1. 1　实验动物 与细胞 　 　纯系 Sprague-Daw ley
(SD )雄性大鼠 30只 ,清洁级 ,体质量 (220 ±20)
g ,购于湖南农业大学动物实验部 [实验动物合格
证号 :SCXK (湘 2003-0003 , 2005年 10月 )] 。随
机分为两组 ,每组 15只 。非小细胞性肺癌 A 549
细胞株由中南大学湘雅医学院细胞中心提供 。
1. 2　主要仪器与试剂　　复方菝葜颗粒 20 g /包
(含生药 130 g),由湖南国华制药厂生产 (批号
B20020355);顺铂 20 mg /支 , 由江西东乡亚东药
业有限公司生产 (批号 2005080202);TRIzo lRe-
agent试剂盒购自美国 G ibcoBRI公司 ;Mastercycler
gradient PCR仪购自德国 Eppendorf公司 ;SYNGENE
凝胶成像系统购自英国 Syngene公司 。
1. 3　实验方法
1. 3. 1　中药含药血清的制备 　　雄性 SD 大鼠
30只 ,随机分为两组 ,每组 15只 。一组灌服复方
菝葜颗粒 ,选择相当于成人临床用药量的 10倍剂
量 ,即 CRSG给药剂量为 3. 6 g /次 。 CRSG由蒸馏
水稀释为每毫升含 0. 9 g , 大鼠灌服 CRSG 4 mL /
只 , 2 次 /d;另一组灌服等剂量蒸馏水 , 2次 /d。
第 6次灌胃后 2 h ,麻醉后采血 ,分装 。常温静置 2
h后 3 000 r /m in离心 10 m in取血清 , 水浴箱内
56℃, 30 m in , 灭活补体 , 在超净台内的无菌条件
下 ,用滤器 (孔径为 0. 22 μm )过滤血清 , 除菌 。
-20℃冰箱保存备用 。
1. 3. 2　细胞培养 及处理 　 　A 549 细 胞采用
1640培养基 ,实验前补充 10%经灭活的小牛血清
(加入青霉素 100 U /mL ,链霉素 100 U /mL),取生
长状态良好 , 处于对数生长期的细胞随机分为中
药含药血清组 (以下简称中药实验组 )、顺铂对照
组 (以下简称西药对照组 )、大鼠血清对照组 (以
下简称正常对照组 ),分别加入 10%的含药血清 、
顺铂 3 μg /mL (10%的 SD 大鼠血清配制 )、 10%
SD大鼠血清 ,继续培养 48 h后收集细胞 , 制成单
细胞悬液 , 1 000 r /m in离心 5 m in。将细胞分别移
至经 DEPC水处理过的 1. 5 mL的 Eppendo rf管中 。
1. 3. 3　RT-PCR检测 　　采用 T rizol试剂提取细
胞总 RNA , PCR引物采用 P rim er P rem ier 5. 0设计
引物序列 (由上海英骏生物技术公司产品合成 )
(表 1)。 PCR循环条件 :94 ℃预变性 150 s, 94 ℃
变性 40 s, 63 ℃退火 40 s, 72 ℃延伸 40 s,循环 30
次 ;72 ℃延伸 7 m in ,反应体系为 20 μL。 PCR反应
产物经琼脂糖凝胶电泳 ,用凝胶成像系统扫描条
带光度值 , 并以 GAPDH 光度值作为参考定量标
准 ,求 待测 基 因 /GAPDH 的 比 值作 为 待测 基因
mRNA的相对表达量 。
1. 4　统计学处理 　　所有数据用均数 ±标准差
(–x ±s)表示 ,多个样本均数的比较采用单因素方
差分析 (one-w ay ANOVA ),两两比较方差齐性时 ,
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中南大学学报(医学版), 2007, 32(2)　
采用 LSD( least significant difference);方差不齐时 ,
采用秩和检验 。应用 SPSS 11. 5统计软件包对数
据进行统计学处理 ,检验水准 α=0. 05。
表 1　PCR引物序列及扩增片段的大小
Tab le 1　P rime r sequence s and am plifica tion fragmen ts of PCR
基因 序列 产物长度(bp)
B cl-2 上游 5′-CTCGTCGCTACCGTCGTGACTTCG-3′下游 5′-CAGATGCCGGTTCAGGTACTCAGTC-3′ 240 bp
B ax
上游 5′-AAGCTGAGCGAGTGTCTCCGGCG-3′
下游 5′-GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGCC-3′ 360 bp
GAPDH
上游 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′
下游 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′ 460 bp
2　结　　果
中药实验组 、西药对照组 Bcl-2 mRNA的表达
及 Bcl-2 /Bax比值均明显低于正常对照组 ,差异有
统计学意义 (P <0. 01),中药实验组与西药对照
组相比 ,差异无统计学意义 (P >0. 05);中药实验
组 、西药对照组 Bax mRNA的表达均明显高于正常
对照组 ,差异有统计学意义 (P <0. 01 ),中药实
验组与西药对照组相比 ,差异无统计学意义 (P >
0. 05)(表 2 ,图 1)。
表 2　各组细胞 Bcl-2 , Bax mRNA光度值及 B cl-2 /Bax比例的比较(–x±s)
Table 2　 Ium ino sity o fB cl-2 , B ax mRNA in each g roup and comparison o fBc l-2 /Bax (–x±s)
组别 n B cl-2 mRNA光度值 B axmRNA光度值 B cl-2 /Ba x
中药实验组 5 0. 601±0. 021** 1. 146±0. 070** 0. 527±0. 049**
西药对照组 5 0. 568±0. 047** 1. 129±0. 037** 0. 501±0. 058**
正常对照组 5 0. 860±0. 198 1. 045±0. 031 0. 825±0. 198
　　与正常对照组比较 , ** P <0. 01
图 1　各组 A549细胞 Bc l-2 和 Bax扩增产物凝胶电泳　1:
中药实验组;2:西药对照组;3:正常对照组
F ig. 1 G el e le ctropho resis im age of the PCR produc ts o fB cl-2
and Bax in A549 ce lls　1:Chinese m edicine g roup;2:
m edicine g roup;3:norm a l contro l g roup
3　讨　　论
诸多基因与肺癌凋亡相关 , 其中 Bcl-2 和 Bax
与非小细胞肺癌的关系密切 [ 6] 。抑凋亡基因 Bcl-2
过表达和促凋亡基因 Bax低表达 , 均可抑制细胞
凋亡 ,细胞存活期延长并扩增 ,这是肺癌发生的重
要机制之一 [ 7] 。在非小细 胞肺癌中 Bax表达异
常 ,可能与非小细胞肺癌的发生 、发展和预后关系
密切 [ 8] 。中药叶下珠提取物启动肺癌细胞凋亡与
下调 Bcl-2基因的表达有关 , 而槲皮素影响 A 549
细胞凋亡的机制是通过下调 Bcl-2 表达 、上调 p53
表达而实现的 [ 6, 9] 。顺铂可以通过 Bax基因表达
上调 , Bcl-2 基因表达下调 , Bcl-2 /Bax比值下调而
诱导肺癌细胞凋亡 [ 10] 。
CRSG 是经过 30多年临床实践 ,在中医辨证
论治原则指导下 , 结合现代药理研究组成的治疗
肺癌的中药复方制剂 ,由菝葜 、鱼腥草 、猫爪草 、土
鳖虫 、冬花 、枸杞 、白参 、大枣等药物组成 。其中以
菝葜 、土鳖虫为君药 , 具有清热解毒 、软坚散结之
作用 ;以鱼腥草 、猫爪草为臣药 , 协助君药解毒散
结 ;佐以冬花止咳化痰 ,使以枸杞 、白参 、大枣养阴
润肺益气 。全方具有清热解毒 、消肿散结 、润肺益
气 、止咳化痰等功效 ,临床治疗原发性支气管肺癌
取得满意的疗效 ,对改善症状 , 控制瘤体扩大 ,提
高患者生活质量 , 延长患者生存期均有很好的作
用 [ 4] ;对提高人体免疫功能及抑制动物瘤株均有
明显作用 [ 11] 。
本实验采用中药血清药理学方法 ,提取 CRSG
含药血清观察其对非小细胞肺癌 A 549细胞 Bcl-2
mRNA和 Bax mRNA的表达水平以及 B cl-2 /Bax比
值的影响 ,结果显示 A549细胞 Bcl-2 mRNA 高表
达 、Bax mRNA低表达 ,经复方菝葜颗粒处理后 Bax
mRNA表达水平显著升高 , 而 Bcl-2 mRNA 表达水
平及 Bcl-2 /Bax比值则显著降低 ,与 Chen 等 [ 10, 12]
研究结果相似 ,提示 CRSG 具有调节 Bcl-2 mRNA
和 Bax mRNA的表达水平以及 Bcl-2 /Bax的平衡作
314
复方菝葜颗粒对非小细胞肺癌 A549细胞 B cl-2和 B ax基因表达的影响　李广诚,等
用 ,这可能是其对非小细胞肺癌发挥抑瘤作用的
分子机制之一 。
在原发性肺癌组织中 Bcl-2 的阳性表达率随
分化程度增高而增高 ,在鳞癌 、腺癌 、腺鳞癌及小
细胞癌各组织类型之间比较无明显差异 ,与有无
淋巴结转移关系不明显 , Hem ing 等 [ 13] 认为 Bcl-2
高表达是肺癌形成的早期事件 。 F lem ing 等 [ 14] 发
现早期肺癌组织中的 Bcl-2 表达要高于晚期 ,预示
Bcl-2 有可 能 成 为 肺 癌 早 期诊 断 指 标 。 Z iegler
等 [ 15]研究表明 B cl-2 过表达与放 、化疗的耐受有
关 ,可通过药物抑制 Bcl-2 的表达水平 , 以提高肿
瘤细胞对放 、化疗的敏感性 。复方菝葜颗粒可以
抑制 A549细胞 Bcl-2 mRNA的表达水平 ,但是否
能够提高肿瘤细胞对放 、化疗的敏感性 ,有待进一
步研究 。
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(本文编辑　傅希文 )
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