全 文 ：·论 著·
芒柄花黄素对非小细胞肺癌 A549 细胞增殖
及上皮间质转化的抑制作用
071000 河北保定 保定市第一医院胸外科 李爱明，赵惠民，揭俊卿
【摘 要】 目的 探讨芒柄花黄素(Form)对人非小细胞肺癌 A549 细胞增殖、凋亡及上皮间质转化(EMT)的影响。方
法 采用终浓度为 0. 1、1、10、100 μmol /L Form处理 A549 细胞，应用四甲基偶氮唑盐比色法测定对照组(不加药物)及不同浓
度 Form处理 24、48、72 和 96 h的细胞增殖情况，分别采用 Annexin V-FITC /PI双染联合流式细胞术和实时荧光定量聚合酶链
反应检测不同浓度 Form处理 48 h的凋亡率及凋亡相关基因的表达情况，Western blotting检测各组处理 48 h后的 EMT相关分
子标志物(E-cadherin、N-cadherin及 Vimentin)水平，采用酶联免疫吸附法测各组处理 24、48、72 及 96 h的细胞上清液中纤连蛋
白(FN)水平。结果 Form在 1 ～ 100 μmol /L的范围内对 A549 细胞有增殖抑制作用，增殖抑制率呈浓度和时间依赖性，且除
24 ～ 48 h 0. 1 μmol /L外，其余浓度及作用时间的增殖抑制率均高于对照组(P ＜ 0. 05);与对照组比较，Form处理 48 h后的早
期、晚期凋亡率及 Bax、Bak的 mRNA水平均升高，而 Bcl-2 水平降低，差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05)，且呈剂量依赖性;与对
照组比较，不同浓度 Form处理 48 h后的 N-cadherin和 Vimentin水平及上清液 FN水平均降低，而 E-cadherin水平升高，以上差
异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。结论 Form对非小细胞肺癌 A549 细胞有毒性作用，不仅抑制其增殖还诱导凋亡，可能与抑制
其 EMT过程有关。
【关键词】 芒柄花黄素; 非小细胞肺癌; 细胞增殖; 凋亡; 上皮间质转化
中图分类号:R734. 2 文献标识码:A 文章编号:1009 － 0460(2015)06 － 0481 － 06
Inhibitory effect of formononetin on proliferation and epithelial mesenchymal transition of non-small cell
lung cancer A549 cells
LI Aiming，ZHAO Huimin，JIE Junqing． Department of Thoracic Surgery，the First Hospital of Baoding City，
Baoding 071000，China
【Abstract】 Objective To explore the inhibitory effect of formononetin(Form)on proliferation and epithelial mesenchymal tran-
sition (EMT)of non-small cell lung cancer A549 cells． Methods The A549 cells were cultured with Form (a final concentration of
0. 1，1，10，100 μmol /L)． The cell proliferation was determined at 24，48，72 and 96 h post-treatment by MTT method in control group
and From group． The Annexin V-FITC /PI double staining combined with flow cytometry and quantitative real-timepolymerase chain reac-
tion were applied to measure the early-apoptotic and late-apoptotic rates and expression of apoptosis related genes at 48 h after treatment．
Western blotting was used to detect the EMT related molecular markers，including E-cadherin，N-cadherin and Vimentin． The superna-
tant levels of fibronectin (FN)were measured at 24，48，72 and 96 h by enzyme linked immunosorbent assay． Results Form exerted
the inhibitory effect on the proliferation of A549 cells in the range of 1-100 mol /L，and presented in a dose-and time-dependent manner．
In addition to 0. 1 mol /L at 24-48 h，the proliferation inhibiting rates of Form were higher than those of control group (P ＜0. 05)． Com-
pared with the control group，there were higher levels of early-apoptotic and late-apoptotic rates and mRNA levels of Bax and Bak but low-
er Bcl-2 mRNA levels in Form groups with statistical significance (P ＜0. 05)． In response to Form，there were increased E-cadherin but
decreased N-cadherin，Vimentin and FN in comparison with control group at 48 h． Conclusion Form has a toxic effect on A549，which
not only inhibit the proliferation and induce apoptosis． It may be related to the inhibition of the EMT process．
【Key Words】 Formononetin; Non-small cell lung cancer; Cell proliferation; Apoptosis; Epithelial mesenchymal tran-
sition(EMT)
目前，肺癌已成为全球范围内发病率和死亡率 最高的恶性肿瘤［1］，其中 85%为非小细胞肺癌［2］，
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而无法手术的局部晚期非小细胞肺癌患者约占肺
癌全部病例数的 40%［3］。故化疗成为挽救无法手
术非小细胞肺癌患者的主要手段，但临床疗效不理
想，且毒副反应较大［4］。因此，积极探寻抗非小细
胞肺癌的有效药物对临床治疗有重要意义。芒柄
花黄素(Formononetin，Form)提取自豆科植物红车
轴草全草，目前发现其具有抗癌效果，可防治前列
腺癌及结肠癌等［5-6］。本研究推测 Form 对非小细
胞肺癌细胞的恶性生物学活性亦有抑制作用，鉴于
失控性增殖和凋亡抵抗是恶性肿瘤的基本特征，且
上皮间质转化(EMT)与恶性肿瘤的局部浸润及远
处转移有着非常密切的关系，故本研究以非小细胞
肺癌常见细胞株 A549 为对象，探讨 Form 对 A549
细胞增殖、凋亡及 EMT 的影响。现将结果报告
如下。
1 材料与方法
1. 1 细胞和主要试剂 A549 细胞购自中科院上海
细胞所;Form(纯度 ＞ 99%)购自中国药品生物制品
检定所;RPMI 1640 细胞培养基、TRIzol 试剂购自美
国 Gibco BRL公司;ECL发光试剂盒、BCA蛋白分析
试剂盒购自美国 Pierce公司;胰蛋白酶、优质胎牛血
清购自美国 Gibco 公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、
Triton X-100 购自美国 Amresco 公司;Annexin V-
FITC /PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京赛宝生物公
司;内参 GAPDH、上皮性钙粘附素(E-cadherin)及神
经性钙粘附素(N-cadherin)抗体购自美国 Cell Sigal-
ing Technology公司，波形蛋白(Vimentin)多克隆抗
体购自 Santa Cruz公司;二抗 HRP 标记的 IgG 购自
北京中杉金桥生物技术有限公司。
1. 2 细胞培养 严格遵循无菌原则，将 A549 细胞
进行解冻复苏，于 RPMI 1640 培养液中培养，其中含
有 10%胎牛血清、100 μ /ml 青霉素和 100 μmol /L
链霉素，培养条件为 37 ℃、5% CO2 饱和湿度，每隔
24 h更换完全培养基，镜下观察待细胞生长达 80%
～90%融合时，采用胰蛋白酶 /EDTA 消化传代，稳
定传 3 ～ 5 代，留取细胞进行后续实验。
1. 3 细胞增殖活性检测 取对数生长期 A549 细
胞进行增殖检测实验，将细胞浓度调整至 1 × 105 /
ml，以每孔 150 μl 接种 96 孔培养板，常规培养(37
℃、5% CO2 饱和湿度)24h 后选用不同浓度 Form
(0. 1、1、10、100 μmol /L)作用 24、48、72 和 96 h 后
(每个浓度设 3 个复孔)，向每孔加入 10 μl MTT 溶
液(5 mg /ml)，继续培养 4 h后，弃掉 MTT溶液并加
入 DMSO溶液(150 μl /孔)终止反应，采用酶标仪检
测 492 nm波长下的各浓度吸光值(A)。以不加药
物为对照组，根据公式计算增殖抑制率，增殖抑制
率(%)=(1 －处理组 A值 /对照组 A值)× 100%。
1. 4 细胞凋亡率检测 将取对数生长期 A549 细
胞调整密度至 2 × 105 /ml，以每孔 3 ml 接种于 6 孔
培养板中，24 h 后按实验设计加入不同浓度 FORM
(0. 1、1、10、100 μmol /L)，常规培养 48 h 后收获细
胞，PBS 冲洗 3 次后，Annexin V-FITC /PI 染色后上
流式细胞仪检测 A549 细胞的早期凋亡率和晚期凋
亡率。
1. 5 凋亡相关基因 mRNA 水平检测 收集不同浓
度 Form处理 48 h 后的 A549 细胞并采用 TRIzol 试
剂提取总 RNA，分别采用提取物 260 nm 处测量 A
值及 260 nm和 280 nm处测量 A值的比值来评价提
取总 RNA的浓度和纯度。采用 M-MLV反转录酶试
剂盒将总 RNA逆转录为 cDNA，反应条件为:30 ℃
10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min;在 ABI 7000 荧光
定量 PCR仪系统按照标准程序进行实时荧光定量
聚合酶链反应(qRT-PCR)。荧光定量 PCR 引物由
Primer 5. 0 software设计(以 GAPDH 为内参)。PCR
反应体系为 20 μl，反应条件为 95 ℃ 2 min;95 ℃ 15
s，60 ℃ 40 s，45 个循环。实验重复 3 次。采用 2-Ct
法表示 Form 处理组的 Bcl-2(抑制凋亡基因)和
Bax、Bak(促凋亡基因)相对于对照组的相对表达
量。见表 1。
表 1 凋亡相关基因 mRNA水平检测引物序列
基因 引物序列
Bcl-2 上游:5’-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3’;
下游:5’-AGGCACCCAGGGTGATGCAA-3’;
Bax 上游:5’-GGCCCACCAGCTCTGAGCAGA-3’;
下游:5’-GCCACGTGGGCGGTCCCAAAGT-3’;
Bak 上游:5’-TCAGATCTCGAGCTATGGCTTCGGGG-
CAAGGCCC-3’;
下游:5’-ACTGCAGAATTCTCATGATTTGAAGA-
ATCTTCGTACC-3’;
GAPDH 上游:5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’;
下游:5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC-3’;
1. 6 免疫印迹法 收集不同浓度 Form 处理 48 h
后的 A549 细胞，4 ℃下以13 000 r /min离心(离心半
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径 8 cm)30 min，保留细胞沉淀并行冰上裂解，收集
上清液后行 BCA法测定蛋白浓度。每个样本取 30
μg蛋白样本，常规行 10%十二烷基硫酸钠—聚丙
烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳和半干转法
转膜，根据膜大小加入适量 E-cadherin、N-cadherin
及 Vimentin一抗(E-cadherin为 1∶ 200，其余均为 1∶
100)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶ 3000)室温下摇荡
孵育 2 h，化学发光法显影后，将曝光后的条带用
Image Pro-Plus 6. 0 软件分析其光密度，最终结果表
示为各条带光密度与内参 GADPH的比值。
1. 7 酶联免疫吸附法( ELISA) 收集各组处理 24、
48、72 和 96 h 后的细胞上清液，采用针对 FN 的检
测试剂盒，根据试剂盒说明书提示检测各组不同处
理时间的上清液 FN水平。
1. 8 统计学分析 采用 SPSS 19. 0 版软件处理。
数据以“均数 ±标准差”表示;多组比较采用单因素
方差分析，两两比较采用 Bonferroni法。以 P ＜ 0. 05
为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 不同浓度 Form 对 A549 细胞增殖的影响 与
对照组比较，除 0. 1 μmol /L Form 作用 24 ～ 48h 外，
各浓度作用 24、48、72 和 96 h 后的增殖抑制率均升
高，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。Form 对 A549
细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性(P ＜
0. 05)。见图 1。
2. 2 不同浓度 Form对 A549 细胞凋亡的影响
2. 2. 1 细胞凋亡率 A549 细胞经 0. 1、1、10、100
μmol /L Form处理 48 h 后，Annexin V-FITC /PI 双染
联合流式细胞术发现，与对照组比较，Form 各浓度
处理后的早、晚期凋亡率均升高，呈浓度依赖性，差
异均有统计学意义(P ＜ 0. 05)。见表 2、图 2。
2. 2. 2 凋亡相关基因的 mRNA水平 A549 细胞经
0. 1、1、10、100 μmol /L Form 处理 48 h 后，qRT-PCR
检测发现，与对照组比较，Form 各浓度处理后的
Bcl-2 mRNA水平降低，Bax 和 Bak mRNA 水平均升
高，组间差异有统计学意义(P ＜ 0. 05)。见图 3。
2. 3 不同浓度 Form 处理对 EMT 相关分子标志物
的影响 A549 细胞经 0. 1、1、10、100 μmol /L Form
处理 48h后，免疫印迹发现，与对照组比较，Form 各
浓度处理后的 E-cadherin 水平升高，N-cadherin 和
Vimentin水平降低，组间差异均有统计学意义(P ＜
0. 05)。见图 4、表 3。
2. 4 不同浓度 Form处理对细胞上清液 FN 水平的
影响 与对照组比较，在 24 ～ 96 h 内，其余浓度的
FN水平均降低，差异均有统计学意义(P ＜ 0. 05)。
见表 4。
3 讨 论
化疗仍是目前恶性肿瘤治疗的主要策略，但由于
部分患者体力状态较差，不能耐受化疗方案，而不得
不中断、推迟或减量治疗［3］。与目前常用的化疗药物
比较，Form为从天然药用中提取的活性成分，已被证
实该药物可抑制多种恶性肿瘤的增殖［5-6］，但目前国
内外鲜有报道其对 A549 细胞的影响，故本研究推测
Form对 A549细胞亦有抑制效果。
本研究选用研究非小细胞肺癌生物学行为常
用的 A549 细胞为对象，采用 Form 处理 A549 细胞
发现，一定剂量的 Form 可降低 A549 细胞的存活
率，表现为 Form 各浓度处理组的增殖抑制率均升
高，且总体上抑制效应呈剂量和时间依赖的方式，
提示 Form 可抑制 A549 细胞增殖，与其他恶性肿瘤
中的研究结果一致［5-6］，更加表明 Form 具有广谱的
抗肿瘤效果，临床应用前景广阔。此外，在本研究
中发现，Form处理后的细胞表现出了染色质边集和
核固缩等细胞凋亡的典型特征，故本研究推测 Form
可通过诱导细胞凋亡来达到抑制 A549 细胞生长。
细胞凋亡在肿瘤的发生、发展及抗肿瘤药物的
治疗中起着重要作用，细胞凋亡启动和执行的发生
过程受到精确调控［7-8］。本研究通过 2 种方法验证
Form对 A549 细胞凋亡的影响，分别为 Annexin V-
FITC /PI联合双染流式细胞术及 qRT-PCR 法检测
Form处理 48 h后的细胞早晚期凋亡率和相关基因
的 mRNA水平(Bcl-2、Bax和 Bak)。实验结果显示，
与对照组比较，Form 处理后的 A549 细胞凋亡率均
升高，从分子生物学水平证实 Form对细胞凋亡有诱
导作用。同样，Form 处理后凋亡诱导基因 Bax 和
Bak的 mRNA 水平均升高，而 Bcl-2 凋亡抑制基因
的 mRNA水平均降低，以上表明 Form 可促进 A549
细胞的凋亡。Liu 等［9］的研究亦发现 Form 在体外
可诱导前列腺癌 DU-145 细胞的凋亡，而 Chen等［10］
也证实 Form具有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。以
上结果均提示 Form通过诱导癌细胞凋亡是其发挥
细胞毒性的基本模式。此外。Jia 等［11］的研究发现
Form 可抑制过氧化氢诱导的视网膜神经节细胞凋
亡，提示其对正常细胞有保护作用。
·384·临床肿瘤学杂志 2015 年 6 月第 20 卷第 6 期 Chinese Clinical Oncology，Jun 2015，Vol． 20，No． 6
图 1 不同浓度 Form处理对 A549 细胞增殖能力
的影响
表 2 不同浓度 Form 对 A549 细胞凋亡率的影
响( % )
组别 早期凋亡 晚期凋亡
对照组 3. 24 ± 0. 54 2. 75 ± 0. 64
Form组
0. 1 μmol /L 8. 51 ± 1. 21* 6. 28 ± 1. 27*
1 μmol /L 13. 66 ± 2. 47＊△ 12. 71 ± 1. 52＊△
10 μmol /L 25. 72 ± 3. 75＊△▲ 17. 48 ± 2. 69＊△▲
100 μmol /L 32. 69 ± 3. 83＊△▲▼ 21. 63 ± 2. 46＊△▲▼
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05;与 0. 1 μmol /L 比较，△P ＜ 0. 05;与
1 μmol /L比较，▲P ＜ 0. 05;与 10 μmol /L比较，▼ P ＜ 0. 05
A:对照组;B:0. 1 μmol /L Form;C:1 μmol /L Form;D:10 μmol /L Form;E:100 μmol /L Form
图 2 不同浓度 Form处理对 A549 细胞凋亡率的影响
图 3 不同浓度 Form处理对 A549 细胞凋亡相关
基因表达的影响
注:A:对照组;B:0. 1 μmol /L;C:1 μmol /L;D:10 μmol /L;E:100
μmol /L
图 4 不同浓度 Form 处理对 A549 细胞 EMT 相
关分子标志物的影响
·484· 临床肿瘤学杂志 2015 年 6 月第 20 卷第 6 期 Chinese Clinical Oncology，Jun 2015，Vol． 20，No． 6
表 3 各组处理 48 h后 EMT相关分子标志物的表达情况
组别 E-cadherin N-cadherin Vimentin
对照组 0. 214 ± 0. 039 0. 644 ± 0. 020 0. 857 ± 0. 018
Form组
0. 1 μmol /L 0. 351 ± 0. 050* 0. 568 ± 0. 014* 0. 717 ± 0. 026*
1 μmol /L 0. 467 ± 0. 023＊△ 0. 432 ± 0. 023＊△ 0. 593 ± 0. 033＊△
10 μmol /L 0. 554 ± 0. 027＊△▲ 0. 291 ± 0. 017＊△▲ 0. 482 ± 0. 025＊△▲
100 μmol /L 0. 732 ± 0. 044＊△▲▼ 0. 234 ± 0. 012＊△▲▼ 0. 349 ± 0. 047＊△▲▼
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05;与 0. 1 μmol /L比较，△P ＜ 0. 05;与 1 μmol /L比较，▲P ＜ 0. 05;与 10 μmol /L比较，▼ P ＜ 0. 05
表 4 各组处理不同时间后细胞上清液 FN水平变化( ng /ml)
组别 24 h 48 h 72 h 96 h
对照组 85. 07 ± 6. 23 79. 61 ± 4. 57 83. 38 ± 6. 14 80. 33 ± 5. 28
Form组
0. 1 μmol /L 76. 83 ± 3. 64 52. 37 ± 4. 38* 46. 41 ± 2. 73* 37. 85 ± 3. 44*
1 μmol /L 62. 69 ± 4. 16＊△ 44. 62 ± 5. 27＊△ 37. 24 ± 3. 21＊△ 29. 21 ± 2. 02＊△
10 μmol /L 55. 31 ± 3. 23＊△▲ 37. 50 ± 4. 14＊△▲ 28. 43 ± 2. 78＊△▲ 17. 30 ± 2. 29＊△▲
100 μmol /L 47. 25 ± 4. 22＊△▲▼ 29. 48 ± 3. 31＊△▲▼ 16. 27 ± 1. 34＊△▲▼ 9. 24 ± 0. 98＊△▲▼
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05;与 0. 1 μmol /L比较，△P ＜ 0. 05;与 1 μmol /L比较，▲P ＜ 0. 05;与 10 μmol /L比较，▼ P ＜ 0. 05
EMT是癌细胞发生侵袭转移的重要步骤，作为
一种病理生理现象，以上皮细胞特性丧失及间质细
胞特性获得为重要特征［12］。EMT 过程中介导上皮
细胞间紧密连接的胞膜蛋白 E-cadherin 表达下调，
间质细胞间的连接蛋白如 N-cadherin 表达上调［13］。
本研究发现 Form处理后可升高上皮分子标志物 E-
cadherin水平，同时降低间质分子标志物 N-cadherin
和 Vimentin 水平，表明 Form 可以抑制非小细胞肺
癌的 EMT过程。本研究采用 ELISA 法观察另一间
质分子标志物 FN 的水平动态变化，同样发现 Form
亦可降低其水平，进一步表明 Form 可以抑制 EMT
过程。Form调控 EMT 的具体机制尚不清楚，可能
与调控相关基因表达有关，如 Liu等［14］发现 ERK和
Akt通路均参与了 Form对癌细胞的调控作用，且两
条通路均在调控 EMT过程中起重要作用［15-16］，下一
步将对 Form调控 EMT的机制进行研究。
综上所述，Form对非小细胞肺癌 549 细胞具有
毒性作用，包括抑制其增殖和诱导凋亡，这可能与
抑制其 EMT过程有关。
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收稿日期:2015 － 01 － 20; 修回日期:2015 － 04 － 09
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