全 文 ：◇ 基础研究 ◇
中国临床药理学与治疗学
中国药理学会主办
ＣＮ　３４－１２０６／Ｒ，ＩＳＳＮ　１００９－２５０１
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｊｃｐｔ．ｃｏｍ
２０１４Ａｕｇ；１９（８）：８５１－８５５
２０１４－０３－１１收稿　２０１４－０７－１７修回
国家自然科学基金（８１２４１１０２）；安徽省卫生厅中医药课题
（２０１２ｚｙ５９）
张刚，男，硕士研究生，研究方向：肿瘤化学及生物防治机理和临
床应用。
Ｔｅｌ：１５８５５９７６９５５　Ｅ－ｍａｉｌ：９２１９５０７８２＠ｑｑ．ｃｏｍ
吉兆宁，通信作者，男，教授，硕士研究生导师，研究方向：肿瘤化
学及生物防治机理和临床应用。
Ｔｅｌ：０５５３－５７３９０６０　Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｚｎｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
左旋一叶萩碱诱导人非小细胞肺癌
Ａ５４９细胞自噬机制的研究
张 刚，陈冬云，程 静，吉兆宁
皖南医学院附属弋矶山医院肿瘤内科，芜湖２４１００１，安徽
摘要　目的：研究左旋一叶萩碱诱导人非小细胞
肺癌Ａ５４９细胞自噬的机制。方法：常规体外培
养人非小细胞肺癌 Ａ５４９细胞株，取对数生长期
的细胞传代２４ｈ后加入不同浓度（６．２５、１２．５、
２５、５０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌ）左旋一叶萩碱处理，分
别继续培养２４、３６、４８ｈ后，用ＣＣＫ－８法测定细
胞增殖活性；倒置显微镜下观察对照组和各实验
组的 细 胞 形 态 变 化；分 别 用 不 同 浓 度 （０、
２０μｍｏｌ／Ｌ）左旋一叶萩碱作用 Ａ５４９细胞４８ｈ
后，进行单丹磺酰尸胺（ｍｏｎｏｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ，
ＭＤＣ）染色，分别通过荧光显微镜检测细胞自噬
发生情况；荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ法检测Ｂｅｃｌｉｎ　１在
ｍＲＮＡ水平表达变化情况。结果：左旋一叶萩
碱可以抑制 Ａ５４９细胞增殖，并且呈浓度和时间
依赖性（Ｐ＜０．０５）。其中，２１．２０４μｍｏｌ／Ｌ左旋一
叶萩碱作用Ａ５４９细胞４８ｈ后，细胞死亡率接近
５０％；倒置显微镜观察到药物作用后细胞形态发
生了明显变化；随着左旋一叶萩碱剂量增加，
ＭＤＣ阳性细胞的荧光强度及细胞内 ＭＤＣ荧光
颗粒数目明显增加。另外，研究还发现随着药物
浓度的上升，自噬基因Ｂｅｃｌｉｎ　１的表达明显增强。
结论：左旋一叶萩碱具有抑制人非小细胞肺癌
Ａ５４９细胞增殖、诱导细胞自噬性凋亡，其作用具
有浓度和时间依赖性。左旋一叶萩碱上调自噬基
因Ｂｅｃｌｉｎ　１ｍＲＮＡ 的表达水平可能是其诱导
Ａ５４９细胞自噬性凋亡的机制之一。
关键词　左旋一叶萩碱；非小细胞肺癌；Ａ５４９细
胞；自噬
中图分类号：Ｒ７３－３６＋２
文献标志码：Ａ
文 章 编 号：１００９－２５０１（２０１４）０８－０８５１－０５
Ｂｅｃｌｉｎ　１是自噬的正向调控基因。对肿瘤来
说，自噬是一把“双刃剑”［１］，适度的自噬可促进细
胞生存，而过度的自噬（即自噬性细胞死亡）将诱
导肿瘤细胞死亡。Ｂｅｃｌｉｎ　１与肿瘤之间的关系正
如自噬与肿瘤之间的关系，Ｂｅｃｌｉｎ　１对肿瘤也发
挥双重调节作用。一方面，Ｂｅｃｌｉｎ　１作为一种抑
癌蛋白［２］，可抑制肿瘤的发生、发展和诱导肿瘤细
胞死亡；另一方面，在实体瘤中，当新生血管还未
形成时，肿瘤细胞往往缺乏营养，Ｂｅｃｌｉｎ　１的适度
表达可诱导有限的自噬水平，为肿瘤细胞提供必
要的物质和能量而促进肿瘤的生长和生存［３］。
肺癌是全球范围内最常见、致死人数最多的
恶性肿瘤之一［４］，也是我国第一大癌症，其发病率
及死亡率增长最为迅速［５］。我国的肺癌居恶性肿
瘤死亡的第一位，约占２２．７％，其中非小细胞肺
癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌ　ｃｅｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）约占肺癌
的８０％［６］。目前肺癌的主要治疗手段是化疗，但
化疗的毒副作用如骨髓抑制等却限制了其应用。
因此，研发新型活性高、毒副作用小的抗肺癌药物
·１５８·
一直是肿瘤治疗领域的重要任务。一叶萩碱（ｓｅ－
ｃｕｒｉｎｉｎｅ）又被称为一叶碱、叶萩碱，是大戟科植
物叶底珠Ｓｅｃｕｒｉｎｅｇａ　ｓｕｆｆ　ｒｕｔｉｃｏｓａ（Ｐａｌ）Ｒｅｈｄ嫩
枝叶或根的主要生物碱。该生物碱最早由原苏联
学者从俄罗斯乌苏里地区植物中分离获得，但其
化学结构却是由我国学者从本土资源提取分离并
最终确定了。一叶萩碱在一叶萩植物中的生物合
成具有十分独特的旋光现象，分为左旋一叶萩碱
（图１）和右旋一叶萩碱２种旋光异构体。有报道
称左旋体的药理活性较强，约为右旋体的１０
倍［７］。早期，Ｔｙｐｏ　Ｂ等的初步研究认为其是一
种主要作用于脊髓的中枢兴奋药，对再障、面部
神经麻痹及伴有抑郁的神经衰弱等有一定疗
效［８－９］。最新的研究结果表明，一叶萩碱还具有抗
肿瘤的生物活性，对人结肠癌ＳＷ４８０细胞具有明
显的抑制作用［１０］，其中左旋一叶萩碱可通过上调
自噬基因Ｂｅｃｌｉｎ　１从而诱导人结肠癌ＳＷ－４８０细
胞自噬性凋亡［１１］。但关于一叶萩碱抗肺癌的研
究则鲜有报道。本研究根据已有研究结论，结合
当前抗肿瘤研究的新热点，观察左旋一叶萩碱是
否诱导人非小细胞肺癌Ａ５４９细胞自噬及其可能
的分子机制。
图１　左旋一叶萩碱（Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ）化学结构图
１　材料与方法
１．１　主要试剂和仪器　左旋一叶萩碱由暨南大
学提供，结构式如图１所示，ＤＭＳＯ溶解配制成
１００ｍｍｏｌ／Ｌ的储存液，４℃ 保存备用；人非小细
胞肺癌系Ａ５４９由皖南医学院附属弋矶山医院中
心实验室传代保存；青霉素、链霉素０．２５％ Ｔｒｉｐ－
ｓｉｎ－ＥＤＴＡ、ＰＢＳ、ＣＣＫ－８、单丹磺酰尸胺（ｍｏｎｏ－
ｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ，ＭＤＣ）（南京凯基生物科技发展
有限公司）；ＲＰＭＩ１６４０（美国 ＧＩＢＣＯ ）；ＤＭＳＯ
（美国ＳＩＧＭＡ）；ＴＲＩｚｏｌ（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｃＤＮＡ
第一链合成试剂盒（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）；Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙ－
ｍｅｒａｓｅ（ＤＮＡ 聚合酶）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）超净工作台
（中国 苏州净化）；ＣＯ２ 培养箱（日本ＳＡＮＹＯ ）；
生物倒置显微镜（日本ＯＬＹＭＰＵＳ）；荧光显微镜
（Ｌｅｉｃａ　ＤＭＩＲＢ公司）；台式低速离心机（中国上
海医疗器械股份有限公司医疗设备厂）；酶标仪
（美国 ＢｉｏＴｅｋ）；高速冷冻离心机（德国 Ｓｏｒ－
ｖａｌ，）；紫外光度仪（日本 ＳＨＩＭＡＤＺＵ）；荧光定
量ＰＣＲ循环仪（中国 中山达安）。
１．２　培养细胞　将符合细胞计数要求的 Ａ５４９
细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入３７℃、
饱和湿度、５％ＣＯ２ 培养箱中培养，培养液为含
１０％～１５％灭活小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０，含１％的
双抗（青霉素及链霉素）。每２～３ｄ传代一次，并
取对数生长期的细胞用于实验。
１．３　倒置显微镜观察Ａ５４９细胞形态的变化　
用含１０％新生牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液配成
单细胞悬液，以每孔（０．８～１）×１０４ 个细胞接种
于９６孔培养板中。将培养板放入ＣＯ２ 孵箱，在
３７℃、５％ＣＯ２ 及饱和湿度条件下培养。培养
２４ｈ后，使用平板离心机弃去上层培养液，每孔
加入用 １６４０ 完全培养基配制成浓度为 １０、
４０μｍｏｌ／Ｌ的左旋一叶萩碱２００μＬ，每个浓度设
４个平行孔（阴性对照组加等量的１６４０完全培养
基）。放入ＣＯ２ 孵箱继续培养３６ｈ后，倒置显微
镜下观察细胞生长状态及形态学改变。
１．４　ＣＣＫ－８法检测细胞增殖　细胞消化、计数、
配制成浓度为５×１０４ 个／ｍＬ的细胞悬液，９６孔
细胞培养板中每孔加入１００μＬ细胞悬液；将９６
孔细胞培养板置于３７℃、５％ＣＯ２ 培养箱中培养
２４ｈ；弃去培养基，ＰＢＳ清洗２次，用完全培养基
稀释药物至所需浓度，每孔加入２００μＬ 相应的
含药培养基，同时设立阴性对照组；将９６孔细胞
培养板置于３７℃、５％ ＣＯ２ 培养箱中培养２４、
３６、４８ｈ；将 ９６ 孔 板 进 行 ＣＣＫ－８ 染 色，λ＝
４５０ｎｍ，测定ＯＤ值；每孔加入１０μＬ　ＣＣＫ－８，在
培养箱继续培养３ｈ；摇床１０ｍｉｎ轻轻混匀；λ＝
４５０ｎｍ，酶标仪读出每孔的ＯＤ值，计算抑制率；
ＩＲ（％）＝［（对照组ＯＤ值－实验组ＯＤ值）／对照
组ＯＤ值］×１００％。
１．５　ＭＤＣ荧光检测自噬　选择生长良好的
Ａ５４９细胞接种于６孔板，培养２４ｈ后参照本实
验室以前的ＣＣＫ－８试验结果，分别用含左旋一叶
萩碱浓度为０、２０μｍｏｌ／Ｌ 的培养液继续培养
·２５８· Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｈｅｒ　２０１４Ａｕｇ；１９（８）
２４ｈ，取出后ＰＢＳ洗２遍，每孔加入 ＭＤＣ（终浓
度５０μｍｏｌ／Ｌ）于３７℃、５％ＣＯ２，的恒温培养箱
中温育３０ｍｉｎ，再置于荧光显微镜下１ｈ内观察
和摄片。
１．６　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法检测Ｂｅｃｌｉｎ　１在ｍＲＮＡ的
表达水平　实验组加入左旋一叶萩碱浓度分别为
１０、２０、４０μｍｏｌ／Ｌ；紫外线分光光度计测ＯＤ２８０和
ＯＤ２６０值，对提取的 ＲＮＡ纯度及总量进行计算。
取１０μＬ　ＰＣＲ扩增产物，１．５％琼脂糖凝胶电泳，
完成电泳后经凝胶扫描仪扫描，并以ＧＡＤＰＨ校
正进行相对量分析，两者积分光密度的比值表示
其数值，３次重复试验后取平均值。ＰＣＲ引物序
列由南京凯基生物科技发展有限公司验证并合
成，选择ＧＡＰＤＨ为内参照。各基因引物序列如
表１所示。
表１　各基因引物序列
引物名称 序列 产物长度（ｂｐ）
β－ａｃｔｉｎ 上游引物 ５＇ＧＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧ　３＇
下游引物 ５＇ＧＣＣＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＣ　３＇ ５１０
Ｂｅｃｌｉｎ　１ 上游引物 ５＇ＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＧＡ　３＇
下游引物 ５＇ＧＴＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧＴＣＧＧＴＡＴＣ　３＇ １１０
１．７　统计学处理　应用ＳＰＳＳ　１８．０软件完成统
计学处理，实验数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，
组间分析比较采用ｔ检验，以α＝０．０５为检验水
准，Ｐ＜０．０５表示差异有统计学意义。
２　结果
２．１　对Ａ５４９细胞增殖的影响　左旋一叶萩碱
作用Ａ５４９细胞２４ｈ后，细胞生长均不同程度地
受到抑制，呈时间－浓度依赖性，随着药物剂量的
增加，抑制率呈上升趋势，与阴性对照组相比，差
异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。由图２可以看出，
随浓度增加和时间延长其抑制作用增强，４８ｈ抑
制率较２４、３６ｈ明显增高（Ｐ＜０．０５）。４８ｈ时左
旋一叶萩碱的ＩＣ５０＝２１．２０４μｍｏｌ／Ｌ。
图２　左旋一叶萩碱对Ａ５４９细胞生长抑制的影响
２．２　细胞形态学改变　阴性对照组：未用药的
Ａ５４９细胞生长良好，形状不规则，呈梭形或多角
形，细胞核大，核异型，核质比高，可见异常核分
裂；浓度为１０、４０μｍｏｌ／Ｌ左旋一叶萩碱加药组：
左旋一叶萩碱作用 Ａ５４９细胞４８ｈ后与对照组
相比细胞形态发生明显变化，且高浓度组细胞形
态变化更加显著，用药后细胞贴壁能力明显下降，
细胞成悬浮生长状态，细胞变小变圆，且细胞内颗
粒明显增多，如图３所示。
图３　倒置显微镜下观察肺癌 Ａ５４９细胞形态变化（×
１００）
Ａ：ＮＣ；Ｂ：１０μｍｏｌ／Ｌ左旋一叶萩碱；Ｃ：４０μｍｏｌ／ｌ左旋一叶萩
碱。
２．３　ＭＤＣ荧光染色检测自噬水平改变　如图４
所示，阴性对照组 ＭＤＣ染色荧光强度很弱且点
状结构很少；左旋一叶萩碱２０μｍｏｌ／Ｌ 处理组
ＭＤＣ染色荧光强度及点状结构均较阴性对照组
明显增加。
２．４　自噬基因Ｂｅｃｌｉｎ　１表达的情况　用 Ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＰＣＲ在ｍＲＮＡ水平检测Ｂｅｃｌｉｎ　１的表达变
·３５８·中国临床药理学与治疗学２０１４Ａｕｇ；１９（８）
化情况。结果发现，人非小细胞肺癌细胞中Ｂｅｃ－
ｌｉｎ　１表达基本缺失，但用不同浓度左旋一叶萩碱
处理４８ｈ后出现Ｂｅｃｌｉｎ　１表达的上调，且随浓度
的增加表达增强（图５）。Ｂｅｃｌｉｎ　１表达水平的变
化和细胞自噬活动的变化呈水平相关，说明左旋
一叶萩碱诱导Ａ５４９细胞Ｂｅｃｌｉｎ　ｌ基因的激活并
引起自噬。
图４　ＭＤＣ荧光染色检测肺癌Ａ５４９细胞自噬空泡的变
化（×４００）
Ａ：ＮＣ；Ｂ：２０μｍｏｌ／Ｌ左旋一叶萩碱。
图５　自噬基因Ｂｅｃｌｉｎ　１表达的情况（ｘ±ｓ）
与ＮＣ组比较ｂ　Ｐ＜０．０５。
３　讨论
近年来研究表明，Ｂｅｃｌｉｎ　１是抑制肿瘤发生、
发展的一个关键基因，表现在它可诱导肿瘤细胞
的自噬性死亡。细胞自噬是真核细胞中高度保守
的一种生理现象，并依赖于溶酶体［１２］。过度的自
噬作用最终将导致细胞死亡，即自噬性细胞死亡
（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ），称为Ⅱ型程序性细胞死
亡（凋亡被称为Ｉ型程序性细胞死亡）［１３］。这种
形式的细胞死亡表现为细胞浆中出现大量包裹着
细胞浆和细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成
分的降解。细胞中Ｂｅｃｌｉｎ　１高表达可以诱导细胞
自噬，甚至诱导高水平的自噬性细胞死亡。在治
疗肿瘤的化疗药物中，它莫昔芬、神经酰氨都是通
过上调Ｂｅｃｌｉｎ　１并抑制ＡＫＴ激酶的活化从而上
调自噬水平，诱导自噬性细胞死亡发生［１４］。Ｂｅｃ－
ｌｉｎ　１基因缺失或点突变将使细胞死亡能力明显
降低而导致肿瘤，Ｂｅｃｌｉｎ　１在多种人类肿瘤中表
现为单个等位基因的缺失和低水平表达，已有报
道卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、人非小细胞肺癌、子
宫内膜癌、宫颈鳞癌细胞均存在Ｂｅｃｌｉｎ　１单个等
位基因缺失或有不同程度的 Ｂｅｃｌｉｎ　１表达下
调［１５］。
左旋一叶萩碱作为一种植物提取的活性成
分，具有资源丰富的优点。最近大量研究表明，左
旋一叶萩碱对多种肿瘤细胞均具有抑制作用，但
有关左旋一叶萩碱抗肺癌作用的研究鲜有报道。
本研究首先使用不同浓度的左旋一叶萩碱作用
Ａ５４９细胞不同时间，ＣＣＫ－８法检测Ａ５４９细胞增
殖抑制情况，结果表明左旋一叶萩碱呈浓度和时
间依赖性抑制 Ａ５４９细胞增殖。通过 ＭＤＣ染色
和荧光显微镜观察结果进一步证实了左旋一叶萩
碱可以诱导Ａ５４９细胞自噬。本研究发现左旋一
叶萩碱可呈浓度依赖性上调自噬基因Ｂｅｃｌｉｎ　１
ｍＲＮＡ的表达水平。
综上所述，本研究表明左旋一叶萩碱作为一
种天然存在的化合物，能够抑制肺癌 Ａ５４９细胞
的增殖，并诱导其自噬，可为左旋一叶萩碱应用于
肺癌的临床治疗提供实验依据。
参 考 文 献
［１］　Ａｐｅｌ　Ａ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ａ　ｄｏｕｂｌｅ－ｅｄｇｅｄ　ｓｗｏｒｄ　ｉｎ　ｏｎｃｏｌｏ－
ｇｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００９，１２５（５）：９９１－９９５．
［２］　Ｙｕｅ　Ｚ．Ｂｅｃｌｉｎ　１，ａｎ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｇｅｎｅ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｅａｒ－
ｌｙ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｉｓ　ａ　ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ［Ｊ］．ＰＮＡＳ　Ｐｒｏ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ
ＵＳＡ，２００３，１００（２５）：１５０７７－１５０８２．
［３］　Ｗａｎｇ　Ｊ．Ａ　ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ　ＭＥＫ／ＥＲＫ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈ－
ｗａｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｖｉａ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　Ｂｅｃｌｉｎ　１［Ｊ］．
Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００９，２８４（３２）：１４１２－１４２４．
［４］　Ｊｅｍａｌ　Ａ，Ｂｒａｙ　Ｆ，Ｃｅｎｔｅｒ　ＭＭ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ　ｃａｎｃｅｒ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ［Ｊ］．ＣＡ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊ　Ｃｌｉｎ，２０１１，６１（２）：６９－
９０．
［５］　Ｚｅｎｇ　ＨＭ，Ｚｈｅｎｇ　ＲＳ，Ｚｈａｎｇ　ＳＷ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒｅｎｄ　ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　ｂｅｔｗｅｅｎ　１９８９ａｎｄ
２００８［Ｊ］．Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ，２０１２，３４（７）：５２５－５３１．
［６］　陈冬云，赵文英，吉兆宁．培美曲塞联合卡铂与吉西
他滨联合卡铂一线治疗晚期非鳞非小细胞肺癌的
临床观察［Ｊ］．中国临床药理学与治疗学，２０１３，１８
·４５８· Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｈｅｒ　２０１４Ａｕｇ；１９（８）
（１２）：１４０１－１４０５．
［７］　彭建中．一叶萩碱的药理与临床新进展［Ｊ］．宁夏医
学院学报，１９９４，１６（２）：１３４－１３７．
［８］　Ｐｕ　Ｈ，Ｚｈａｏ　Ｊ，Ｐｏｎｇ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｖｉｒｏｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ
［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇ　Ｙａｏ　Ｃａｉ，２００１，２４（４）：２７８－２８０．
［９］　Ｙａｎｇ　ＣＬ，Ｌｉ　ＬＱ，Ｓｈｕ　ＬＳ．Ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｐｌａｓ－
ｔｉｃ　ａｎｅｍｉａ［Ｊ］．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄ　Ｊ，１９８１，９（１１）：６６２－
６６５．
［１０］Ｃｈｅｎｇ　ＣＲ，Ｘｉａ　ＹＨ，Ｊｉ　ＺＮ，ｅｔ　ａｌ．Ｖｉｒｏｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂａｘ　ｅｘｐｒｅｓ－
ｓｉｏｎ　ｉｎｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ＳＷ４８０ ｃｅｌｓ ［Ｊ］．
Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，２０１２，６７（４）：３５１－３５４．
［１１］Ｘｉａ　ＹＨ，Ｃｈｅｎｇ　ＣＲ，Ｊｉ　ＺＮ，ｅｔ　ａｌ．Ｌ－Ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ＳＷ４８０ｃｅｌ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ
ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ［Ｊ］．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ，
２０１１，８２（８）：１２５８－１２６４．
［１２］Ｙａｎｇ　Ｚ，ＤＪ　Ｋｌｉｏｎｓｋｙ．Ｅａｔｅｎ　ａｌｉｖｅ：ａ　ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　ｍａｃ－
ｒｅａｕｔｏｐｈａｇｙ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌ，２０１０，１２（９）：８１４－
８２２．
［１３］Ａｂｒａｈａｍ　ＭＣ，Ｓｈａｈａｍ　Ｓ．Ｄｅａｔｈ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｃａｓｐａｓｅｓ，
ｃａｓｐａｓｅｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｄｅａｔｈ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌ，２００４，
１４（４）：１８４－１９３．
［１４］Ｓｃａｒｌａｔｔｉ　Ｆ．Ｃｅｒａｍ　ｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｉｎ－
ｖｏｌｖｅｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ　ａｎｄ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｅｃｌｉｎ　１［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２００４，２７９（１８）：
１８３８４－１８３９１．
［１５］Ｅｄｉｎｇｅｒ　ＡＬ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＣＢ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ
ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌ，２００３，４（６）：４２２－
４２４．
Ｌ－Ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ　ｓｍａｌ　ｃｅｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　Ａ５４９　ｃｅｌ
ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ＺＨＡＮＧ　Ｇａｎｇ，ＣＨＥＮ　Ｄｏｎｇ－ｙｕｎ，ＣＨＥＮＧ　Ｊｉｎｇ，ＪＩ　Ｚｈａｏ－ｎｉｎｇ
Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙｉｊｉｓｈａｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｗａｎｎａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗｕｈｕ　２４１００１，Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ　ＡＩＭ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆ　Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ
ｓｍａｌ　ｃｅｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　Ａ５４９ｃｅｌ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ．
ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ５４９ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ
ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
（６．２５，１２．５，２５，５０，１００，２００μｍｏｌ／Ｌ）ｗａｓ　ａｄｄｅｄ
２４ｈａｆｔｅｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ
ｐｌａｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２４，３６ａｎｄ　４８ｈ．ＣＣＫ－８
ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ　ｓｍａｌ　ｃｅｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　Ａ５４９　ｉｎ
ｖｉｔｒｏ．Ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ
Ａ５４９ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ－
ｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ．Ｔｈｅ　Ａ５４９ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（０，２０μｍｏｌ／Ｌ）ｏｆ　Ｌ－ｓｅ－
ｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｆｏｒ　２４ｈ．Ｔｈｅｎ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ
ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｆｏｌｏｗｉｎｇ　ｓｔａｉｎｉｎｇ
ｗｉｔｈ　ｍｏｎｏｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ（ＭＤＣ）．Ｔｈｅ　ｍＲ－
ＮＡ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　Ｂｅｃｌｉｎ－１ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅａｌ－
ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｐｒｅ　ａｎｄ　ｐｏｓｔ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｌ－ｓｅ－
ｃｕｒｉｎｉｎｅ．ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ａ５４９ｃｅｌｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｗｅｒｅ　ｄｅ－
ｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＣＣＫ－８ｍｅｔｈｏｄ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄ　ｔｈｅｒｅ
ｗｅｒｅ　ｄｏｓａｇｅ－ｔｉｍｅ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｔｈｅ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｃｅｌｓ　ｂｅｃｏｍｅ　ｓｍａｌ　ａｎｄ　ｒｏｕｎｄ，
ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｇｏｔ　ｌｅｓｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂ－
ｓｅｒｖｅｄ． Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ－ｔｒｅａｔｅｄ　ｃｅｌｓ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ
ｈｉｇｈｅｒ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ　ＭＤＣ－ｌａ－
ｂｅｌｅｄ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｉｎ　Ａ５４９ｃｅｌｓ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｂｅｃｌｉｎ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｗｉｔｈ　Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．ＣＯＮ－
ＣＬＵＳＩＯＮ：Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｈａｓ　ａｎ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ｅｆｆｅｃｔ
ａｇａｉｎｓｔ　ｈｕｍａｎ　ｎｏｎ　ｓｍａｌ　ｃｅｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　Ａ５４９
ｃｅｌ．Ｔｈｅ　Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｃａｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ｓｔｒｉｋｉｎｇ　ａｕｔｏ－
ｐｈａｇｙ　ｉｎ　Ａ５４９ｃｅｌ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｉｎ－
ｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ　ｉｓ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｕｐｒｅｇｕｌａｔ－
ｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｕｔｏｐｈａｇｙ　ｇｅｎｅ　Ｂｅｃｌｉｎ－１．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　Ｌ－ｓｅｃｕｒｉｎｉｎｅ；ｎｏｎ　ｓｍａｌ　ｃｅｌ　ｌｕｎｇ
ｃａｎｃｅｒ；Ａ５４９ｃｅｌ；ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ
本文编辑：储冀汝
·５５８·中国临床药理学与治疗学２０１４Ａｕｇ；１９（８）