全 文 ：收稿日期:2004-04-15基金项目:国家自然科学基金(39700099);北京市科技新星计划项目(855871100)资助作者简介:郭光艳(1974-),女 ,河北邯郸人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事小麦遗传育种的研究工作;赵茂林为通讯作者。
利用 SSR鉴定普通小麦-多枝赖草二体异附加系
Line24中外源染色体同源群的归属
郭光艳1 ,李瑞芬2 ,张敬原2 ,葛荣朝1 ,赵茂林2 ,沈银柱1 ,黄占景1
(1.河北师范大学 生命科学学院 ,河北石家庄　050016;2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 ,北京　100089)
　　摘要:用 227 对小麦微卫星引物进行 PCR 扩增 , 76 对可在多枝赖草和耐黄矮病的普通小麦-多枝赖草二体异附
加系 Line24 的小麦亲本中国春 、丰抗 13 间检测到多态性。在这 76 对引物中 , 发现有 4 对引物能从 Line24 中扩增出
和多枝赖草相同而与 Line24 其他小麦亲本不同的扩增带。进一步用 Line24 和普通小麦杂交得到的 7 个不同的单体
异附加系进行验证 ,也得到同样的结果 , 说明这 4 对微卫星引物扩增出的特异带可以作为 Line24 中多枝赖草染色体
的分子标记。根据这 4对引物各自对应的微卫星标记位点在小麦染色体上的位置 , 说明 Line24 中附加的一对多枝赖
草染色体是第 3 , 5 , 6和 7部分同源群多枝赖草染色体相互易位形成的。
关键词:SSR;多枝赖草;二体异附加系;外源染色体;同源群归属
中图分类号:S512.1035　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2004)04-0014-04
Identifying the Homoeologous Groups of the Alien Chromosomes of
Triticum aestivum-Leymus multicaulis Disomic Chromosome
Addition Line Line24 Using SSR Markers
GUO Guang-yan1 , LI Rui-fen2 , ZHANG Jing-yuan2 ,GE Rong-chao1 ,
ZHAO Mao-lin2 ,SHEN Yin-zhu1 ,HUANG Zhan-jing1
(1.College of Life Science , Hebei Normal University , Shijiazhuang　050016 ,China;
2.Beijing Ag riculture Biotechnology Research Center ,Beijing Academy of Ag ricultural
and Forest ry Sciences ,Beijing 　100089 , China)
Abstract:Of the 227 wheat microsatelli te prime pairs used to amplify products f rom Leymus multicaul is ,
76 show ed polymorphisms among Leymus mul ticaulis , the common wheat parents Chinese Spring and
Fengkang No.13 of the Tri ticum aest ivum-Leymus mul ticaulis disomic chromosome addition line Line 24
which w as tolerant to Barley Yellow Dwarf Virus(BYDV).These 76 primer pairs can be useful for ident ifying
the homoeologous groups of the alien Leymus mult icaulis chromosomes of Line 24.Among them , 4 could am-
plify same product f rom Line 24 and Leymus mult icaulis , but different from Chinese spring and Fengkang No.
13.The same result w as obtained when using 7 different monosomic chromosome addition lines w hose parents
w ere Line 24 and different common wheat varieties as template.Therefore , these 4 microsatellites could be used
as molecular markers fo r the alien Leymus mul ticaulis chromosomes of Line24.According to the loci of the
products of those 4 microsatelli te prime pairs in w heat , it can be concluded that the Leymus mul ticaul is chro-
mosomes of Line 24 might contain the f ragments of 3Xm(Ns), 5Xm(Ns), 6Xm(Ns)and 7Xm(Ns)chromo-
somes of Leymus mul ticaul is.They must have exchanged chromosome fragments each other.
Key words:SSR;Leymus multicaul is;Alien disomic chromosome addi tion line;Alien chromosomes;Homoe-
ologous groups
华北农学报·2004 , 19(4):14-17
　　大麦黄矮病毒(BYDV)引起的小麦黄矮病常造
成小麦产量锐减 。而在小麦的多年生近缘属中蕴含
着丰富的遗传资源和广泛抗性[ 1] ,其中赖草属和偃
麦草属(Thinopyrum)有很高的抗性[ 2～ 4] 。目前利
用中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)为抗源
的工作进行得较为深入。已育成一些抗黄矮病的部
分双二倍体 、附加系和一些易位系材料。但实践证
明单一抗源随着时间和环境条件的变化 ,可能会造
成抗病性的降低 ,甚至丧失。因此 ,利用多种抗源进
行抗源轮换 ,或基因累加育成多抗品种 ,才能更好地
控制小麦黄矮病 。
1991 ～ 1993年 ,赵茂林先生首次选育出普通小
麦-多枝赖草 12种(缺少第 4 、第 5同源群)15个互
不相同的二体异附加系[ 5～ 7] 。采用我国小麦 BY-
DV 的主流株系 GPV 感染的麦二叉蚜接种返青幼
苗 ,对不同的普通小麦-多枝赖草二体异附加系抗
黄矮病特性进行鉴定 ,发现附加一对来源于多枝赖
草第 3部分同源群(附加 3 Xm(Ns))染色体的附加
系 Line24表现为高抗 ,其抗BYDV 水平相当于甚至
高于目前国际公认的抗病对照无芒中 4 ,是一个新
的黄矮病抗源[ 8] 。酶联免疫反应测定和病圃接种
鉴定结果 ,确定 Line24对我国流行的大麦黄矮病毒
主流株系 GAV -Ma 和西方国家流行的主流株系
PAV 也表现高度耐性(赵茂林)。贾继增先生用
RFLP对这些普通小麦-多枝赖草二体异附加系进
行研究时发现 ,除含有多枝赖草第一部分同源群染
色体的附加系外 ,其他附加系中附加的多枝赖草染
色体本身已经发生了相互易位。因此 ,利用多态性
高的分子标记对 Line24进行准确鉴定 ,是标记来源
于多枝赖草耐黄矮病基因的基础。
1　材料和方法
1.1　材料
　　本试验所用材料多枝赖草(2n=4x=28)、普通
小麦-多枝赖草二体异附加系 Line24(2n=44=22II)
表 1　7个小麦-多枝赖草单体异附加系系谱
材料编号 世代 染色体数 系　　谱
933 F1 43 莱州 953/小赖麦附加系 Line24反交
934 F1 43 莱州 953/小赖麦附加系 Line24
935 F1 43 莱州 953/小赖麦附加系 Line24
936 F1 43 莱州 953/小赖麦附加系 Line24反交
937 F1 43 95品 166-2/小赖麦附加系 Line24
939 F1 43 京冬 6号/小赖麦附加系 Line24
941 F1 43 京 411/小赖麦附加系 Line24
及 Line24培育过程中的普通小麦亲本中国春和丰
抗 13 , 7个源于 Line24 的单体异附加系(2n=43=
21II+1 I)及其小麦亲本(系谱见表 1),均由北京市
农林科学院北京农业生物技术研究中心草业生物技
术研究室赵茂林研究员提供 。
1.2　引物合成及 PCR条件
按照 Röder等[ 9]发表的微卫星引物序列 ,由上
海博亚公司合成 227对引物 ,微卫星引物序列见相
关文献[ 9] 。
PCR扩增反应的总体积为 20 μL:10 ×PCR
buf fer 2μL , dNTPs(各 2 mmol/ L)2μL ,25 mmol/L
MgCl2 1.4μL ,2μmol/L 上下游引物各 2.5 μL , Taq
酶 1U , 10 ng/ μL 模板 DNA 6 μL ,ddH2O 5.9 μL。
扩增程序为:94 ℃预变性 4 min , 再按每个循环
94 ℃1 min , 50 ℃, 55 ℃或 60 ℃ 1 min , 72 ℃ 1
min扩增 35个循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min 。PCR
扩增在 Perkin Elmer 9700 PCR仪上进行 。
1.3　PCR结果的电泳检测
20μL PCR反应产物加入 6 μL Loading buf fer
(98%无离子甲酰胺 , 10 mmol/L EDTA(pH 8.0),
0.25%二甲苯青 , 0.25%溴酚蓝),94 ℃变性 5 min
立即放入冰中冷却 5 min ,使之保持变性状态 。变
性后 PCR产物经 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,银
染检测。
2　结果与分析
用 227对小麦微卫星标记引物对多枝赖草 、普
通小麦-多枝赖草二体异附加系 Line24及 Line24
培育过程中用到的小麦亲本中国春和丰抗 13 核
DNA 进行 PCR扩增 ,其中有 76对引物可在多枝赖
草和中国春及丰抗 13间扩增出多态性标记 。这 76
对微卫星标记引物中 , 共有 4 对引物(WMS133 ,
WMS190 ,WMS314和 WMS400)从 Line24中扩增
出和多枝赖草相同的特异带:WMS133 -310bp ,
WMS190-175bp ,WMS314-135bp和 WMS400-
190bp ,而从 Line24的小麦亲本中国春和丰抗 13扩
增出与此不同的扩增带 ,随后又用这 4 对引物对
Line24与普通小麦杂交得到的 7 个单体异附加系
(系谱见表 1)进行 PCR扩增来验证 ,发现从这 7个
单体异附加系中也能扩增出与多枝赖草和 Line24
相同的扩增带 ,而从它们各自的小麦亲本中扩增出
的产物与这些特异带不同。因此 , WMS133 -
310bp , WMS190 -175bp , WMS314 -135bp 和
4期 郭光艳等:利用 SSR鉴定普通小麦-多枝赖草二体异附加系 Line24中外源染色体同源群的归属 15　
WMS400-190bp可作为 Line24中多枝赖草染色体
片段的分子标记。WMS133 ,WMS190 ,WMS314和
WMS400的扩增结果分别见图 1 ～ 4 。
1 marker(bp);2多枝赖草;3 Line24;4中国春;5 丰抗 13;6 单
体附加系 933;7单体附加系 934;8单体附加系 935;9 单体附
加系 936;10莱州 953;11 单体附加系 937;12 95 品 166-2;13
单体附加系 939;14 京冬 6号;15单体附加系 941;16 京 411
图 1　普通小麦-多枝赖草种质材料及
亲本微卫星WMS133 的扩增产物
1 marker(bp);2多枝赖草;3 Line24;4中国春;5 丰抗 13;6 单
体附加系 933;7单体附加系 934;8单体附加系 935;9 单体附
加系 936;10莱州 953;11 单体附加系 937;12 95 品 166-2;13
单体附加系 939;14 京冬 6号;15单体附加系 941;16 京 411
图 2　普通小麦-多枝赖草种质材料及
亲本微卫星WMS190 的扩增产物
1 marker(bp);2 多枝赖草;3 Line24;4 中国春;5 丰抗 13;6 单
体附加系 933;7 单体附加系 934;8 单体附加系 935;9 莱州
953;10 单体附加系 937;11 95品 166-2;12 单体附加系 939;
13 京冬 6号;14 单体附加系 941;15京 411
图 3　普通小麦-多枝赖草种质材料
及亲本微卫星 WMS314 的扩增产物
1 marker(bp);2 多枝赖草;3 Line24;4 中国春;5 丰抗 13;6 单
体附加系 933;7单体附加系 934;8 单体附加系 935;9 单体附
加系 936;10 莱州 953;11 单体附加系 937;12 95品 166-2;13
单体附加系 939;14京冬 6号;15 单体附加系 941;16 京 411
图 4　普通小麦-多枝赖草种质材料
及亲本微卫星 WMS400 的扩增产物
　　WMS133 ,WMS190 ,WMS314 和 WMS400 在
小麦染色体上的定位见表 2。从表 2 可以看出 ,
WMS133被定位于小麦 6B染色体短臂靠近着丝粒
表 2　WMS133、WMS190 、WMS314 、WMS400在小麦染色体上的定位 、序列 、退火温度 、及从小麦与多枝赖草中扩增产物比较
引物名称 WMS133 WMS190 WMS314 WMS400
所在染色体 6B 短臂 5D 短臂 3D长臂 7B 短臂
序列(5′※3′) L:ATCTAAACAA L:GTGCT TGCTG L:AGGAGCTCCT L:GTGCTGCCAC
GACGGCGGTG AGCTATGAGTC CTGTGCCAC CACTTGC
R:ATCTGTGACA R:GTGCCACGTG R:TTCGGGACTC R:TGTAGGCACT
ACGGTGAGA GTACCTTTG TCTTCCCTG GCTTGGGAG
扩增的微卫星重复 (CT)39 imp (CT)22 (CT)25 imp (CA)21
退火温度(℃) 60 60 55 60
扩增片段长度(bp) 128a 124b 201a 253b 182a 171b 143a 150b
多枝赖草特征带(bp) 310 175 135 190
　注:imp指不完美的简单重复序列 ,扩增片段长度数据 a 为Opata , b为 Synth.W7984为模板时的数据[ 9]
附近 ,WMS190被定位于小麦 5D染色体短臂端部
附近 , WMS314 被定位于 3D 染色体长臂上 , 而
WMS400被定位于 7B 染色体短臂端部附近 ,根据
基因的共线性关系 , Line24中附加的外源染色体不
止来源于一个同源群 ,而是包含了多枝赖草第 3 、第
5 、第 6和第 7部分同源群的遗传物质 ,因此推测这
对附加的多枝赖草染色体是由这 4个部分同源群的
染色体片段相互易位形成的 。
3　讨论
赵茂林[ 5] 曾采用同工酶等电聚焦技术鉴定出
line24来源于多枝赖草的第三部分同源群。贾继增
先生用 RFLP 分子标记对 Line24进行研究 ,初步发
现其中的多枝赖草染色体可能是由不同部分同源群
16　 华　北　农　学　报 19卷
染色体相互易位形成的 。Peil等[ 10]用小麦 SSR引
物对 Trit icum aest ivum-Aegi lops markgraf ii 二体
异附加系进行扩增 ,研究了 Aegilops markgraf ii 染
色体与小麦染色体的同源群关系 , Iqbal利用 SSR
成功鉴定了小麦-单芒山羊草(Aegi lops uniarista
Vis.)7N染色体异附加系[ 11] ,为使用微卫星标记鉴
定外源染色体的同源群归属提供了新思路。
本文首次用微卫星标记这种简单有效的方法对
Line24进行了研究 ,发现微卫星引物WMS314(被
定位于小麦染色体 3D长臂上)能从 Line24 和多枝
赖草中扩增出相同的产物 ,表明 Line24中含有来源
于多枝赖草第 3部分同源群的遗传物质 ,这与赵茂
林采用生化标记对 Line24鉴定的结果相一致 。但
除此之外 ,还有分别位于小麦 5D ,6B和 7B 染色体
上的小麦微卫星引物能从 Line24 和多枝赖草中扩
增出相同的产物 ,表明 Line24中附加的多枝赖草染
色体已经发生了相互易位 ,包含多枝赖草第 3 、第 5 、
第 6和第 7部分同源群的遗传物质 。
Hsiao 等[ 12]和李瑞芬[ 13]曾在异花授粉的蒙古
冰草(PP)和航道冰草(P′P′)F 1 花粉母细胞减数分
裂中期 I观察时发现有三价体和四价体的出现 ,推
断其中一个基因组中的两条染色体之间发生了相互
易位 。由此推测 ,同样是异花授粉的多枝赖草 ,在系
统发生过程中也很有可能在不同染色体间发生相互
易位。赵茂林[ 5] 曾观察到多枝赖草花粉母细胞减
数分裂中期 I 有四价体出现 ,说明多枝赖草染色体
片段间相互易位是很有可能的 。
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