全 文 ：瓠瓜 ISSR-PCR反应体系优化
高　山1 , 许端祥1 , 林碧英1 , 钟开勤2
(1.福建省福州市蔬菜科学研究所 , 福建　福州　350012;2.福建农林大学园艺学院 , 福建　福州　350002)
收稿日期:2007-04-07初稿;2008-05-29修改稿
作者简介:高山 (1973-), 男 , 硕士 , 副研究员, 主要从事蔬菜遗传与育种研究
基金项目:福州市科技星火项目 (2005-03)
摘　要:利用正交设计 L 9 (34), 对瓠瓜 ISSR-PCR 反应体系的 4 因素 (dNTP、 引物 、 M g2+、 Taq 酶)在 3 水
平上进行优化试验 , 建立适合瓠瓜 ISSR-PCR反应体系 , 结果表明 , 在 25 μL 反应体系中 , 含 1×PCR buffer、
200 μmol· L-1 dNTP 、 0.5 μmol· L-1引物 、 2.5 mmol· L-1 MgCl2 、 30 ng模板 DNA、 0.75 U 的 Taq 酶为最佳
处理;通过 PCR梯度测验 , 瓠瓜 ISSR扩增适宜的退火温度比 Tm 值高 2 ～ 6℃。
关键词:瓠瓜;ISS R;正交设计;梯度 PCR
中图分类号:S 642.9 文献标识码:A
ISSR-PCR reaction system optimization for Lagenaria siceraria (Mol.)Stand
GAO Shan1 , XU Duan-xiang1 , L IN Bi-ying1 , ZH ONG Kai-qin2
(1.Fuz hou Institute o f Vegetable Crops , F uzhou , Fujian　350012 , China;2.Collegeo f Horticulture ,
Fuj ian Agriculture and Forestry University , Fuz hou , Fuj ian　350012 , China)
Abstract:The ISSR-PCR amplifica tion sy stem in Lagenaria siceraria (Molina)Stand was optimized by using o r-
thogonal design with 3 levels of 4 facto rs(i.e., dNTP , primer , Mg2+ and Taq DNA polymerase).The optimal reac-
tion conditions of ISSR-PCR w ere:1 ×PCR buffer , 200 μmol·L-1 dNTP , 0.5 μmo l·L-1 primer , 2.5 mmo l·L -1
MgCl2 , 30 ng template DNA and 0.75 U Taq DNA po lymerase in 25 μL reac tion vo lume.The optimized annealing
temperature was 2 ～ 6℃ highe r than the Tm o f the co rr esponding prime r by g radient PCR.
Key words:Lagenaria siceraria (M ol.)S tandl.;I SS R;o r thogonal design;g radient PCR
　　瓠瓜 [ Lagenaria siceraria (Mol.)Standl.] ,
别名瓠子 、扁蒲 、 蒲瓜 , 原产赤道非洲南部低地 。
瓠瓜在我国的栽培历史可上溯到新石器时代 , 是我
国栽培的葫芦科中最古老的蔬菜之一 , 其类型与品
种十分丰富 。但是我国对瓠瓜的种质资源研究甚
少 , 基于分子水平的遗传多样性研究还未见报道 。
国外相关文献也仅限于利用 RAPD标记对瓠瓜遗
传多样性的研究[ 1] 。
ISSR (inter simple sequence repeat )是一种
用微卫星引物 PCR扩增产生多态位点标记的技术 ,
具有简单重复序列 ( simple sequence repea t ,
SSR)、扩增片段长度多态性标记 (AFLP )的优
点和随机扩增多态性 (RAPD)标记的普遍性。相
对于 RAPD 技术 , 它使用了更长的引物 , 提高了
退火温度而具有更高的重复性 。由于是根据植物基
因组中广泛存在的 SSR 来设计引物 , 因此不需预
知基因组的序列 , ISSR 技术要比其他标记系统简
单。而且 SSR在真核生物中分布非常普遍 , 且串
联重复的数目是可变的 , 呈现高度多态性 , 能提供
更多的遗传信息。目前 ISSR技术在研究植物遗传
多样性研究中发挥了重要作用[ 2-6] 。
ISSR是由单一引物序列的 PCR标记 , 其反应
条件易受许多因素干扰。为了确保 ISSR分析结果
的可靠性和重复性 , 进行 ISS R反应体系的建立与
优化是十分必要的 。本试验采用正交试验设计 , 对
瓠瓜的 ISSR反应体系进行优化分析 , 并对退火温
度进行梯度测验 , 以期获得适合瓠瓜的 ISS R最佳
反应体系 , 为进一步利用该标记技术研究瓠瓜种质
资源的遗传多样性奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
瓠瓜材料为福州市蔬菜科学研究所瓠瓜课题组
收集的瓠瓜种质资源 , 采用穴盘育苗 , 待长至 2片
真叶时取嫩叶供试验用。试验用的 Taq 酶 、
dNTP 、引物和 Mg2+均购自上海生工生物工程技
术有限公司 。
福建农业学报 23(2):182 ～ 185 ,2008
F ujian Journal o f Agricultural Sciences
文章编号:1008-0384 (2008)02-0182-04
1.2　DNA 的提取
DNA 的提取采用微量 CTAB 的提取方法[ 7] ,
用紫外分光光度计检测 DNA 质量和浓度 , 并将
DNA 浓度稀释为 30 ng ·μL-1 。
1.3　PCR反应体系的正交试验与 PCR扩增
采用 L 9 (34)正交试验设计 , 对dNTP 、引物
(GA)8GC 、 Mg2+和 Taq酶浓度进行 4因素 3水平
筛选 , 方案如表 1和表 2。反应体系总体积为 25
μL , 包括 1×PCR buffe r、 30 ng 模板 DNA , 其他
各成分按表 2加样 , 最后用 ddH2O 补足 , 每个处
理 2次重复。
表 1　瓠瓜 ISSR-PCR 反应体系正交设计因素及水平
Table 1　Level of ISSR-PCR system factors in orthogonal de-
sign for bottle gourd
水平
因　素
dNT P
(μm ol · L -1)
引物
(μmol· L-1)
MgCl2
(mmol· L -1)
Taq酶
(U)
1 150 0.25 1.5 0.75
2 200 0.50 2.0 1.0
3 250 0.75 2.5 1.25
PCR 扩增反应在 PCR 仪 (Eppendorf M as-
tercy cler g radient)上进行 , 初步确定的 PCR扩增
程序[ 8] 为:94℃预变性 5 min;92℃60 s , 59℃70
s , 72℃120 s , 45个循环;72℃7 min;4℃保存 。
反应结束后 , PCR产物在含有 0.5 μg · mL -1 EB
的 1.8%琼脂糖 (BBI)凝胶中电泳 2 h , 在捷达凝
胶成像系统进行拍照分析。
表 2　瓠瓜 ISS R-PCR反应体系的正交设计
Table 2　Orthogonal design of the ISSR-PCR system for bottle
gourd
试验号
因　素
dNTP
(μmol· L -1)
引物
(μmol· L -1)
MgCl 2
(mm ol · L -1)
Taq酶
(U)
1 150 0.25 1.5 0.75
2 150 0.50 2.0 1.0
3 150 0.75 2.5 1.25
4 200 0.25 2.0 1.25
5 200 0.50 2.5 0.75
6 200 0.75 1.5 1.0
7 250 0.25 2.5 1.0
8 250 0.50 1.5 1.25
9 250 0.75 2.0 0.75
1.4　退火温度的确定
根据正交试验结果 , 选择适宜的反应体系设置
退火温度 (56 ±6)℃ (根据 Tm 理论公式 T =4
(G+C)+2 (A+T)计算 , 引物 (GA)8GC 的理
论 Tm 为 56.0℃), 在 PCR 仪 (Eppendo rf Mas-
tercycler gradient)上自动形成 12 个温度梯度:
50.0℃、 50.2℃、 50.8℃、 51.9℃、 53.3℃、
54.8℃、 56.5℃、 58.1℃、 59.7℃、 61.0℃、
61.9℃、 62.5℃。选用 12 条 ISS R引物 (引物序
列见表 3), 除退火温度不同外 , PCR扩增程序与
反应体系正交试验设计的反应程序相同。
表 3　12条引物各退火温度下的扩增结果
Table 3　Selected primers at different annealing temperatures
引物序列 Tm 值(℃)
退火温度(℃)
50.0 50.2 50.8 51.9 53.3 54.8 56.5 58.1 59.7 61.0 61.9 62.5
808 (GA)8GC 56.0 +/ - +/ - +/- +/ - +/ - +/ - +/ - ++ ++ - - -
809 (GA)8GG 56.0 - - - - +/ - +/ - + ++ ++ - - -
810 (GA)8 T 50.0 +/ - +/ - - +/ - ++ ++ - - - - - -
812 (GA)8C 54.0 +/ - +/ - +/- +/ - +/ - + + ++ ++ + - -
813 (CT)8 T 50.0 +/ - +/ - +/- ++ +/ - + +/ - - - - - -
816 (CA)8 T 50.0 - +/ - +/- ++ ++ +/ - +/ - +/ - - - - -
824 (TC)8G 54.0 +/ - +/ - +/- + ++ ++ +/ - +/ - - - - -
825 (AC)8 T 50.0 - - +/- +/ - ++ ++ + +/ - - - - -
826 (AC)8C 54.0 - - +/- +/ - +/ - +/ - +/ - + + +/ - ++ ++
827 (AC)8G 54.0 +/ - +/ - +/- +/ - +/ - +/ - +/ - + + +/ - ++ ++
829 (TG)8C 54.0 - - - - - - +/ - +/ - +/ - +/ - ++ ++
834 (AG)8CT T 56.0 - - - - - - + ++ + - - -
　注:+表示有扩增产物;++表示扩增效率高;+/ -表示扩增产物不清晰;-表示无扩增产物。
183第 2期 高　山等:瓠瓜 ISSR-PCR反应体系优化
1.5　ISS R优化扩增体系的验证
根据获得最佳反应体系和适宜的退火温度 , 用
引物 (AC)8C 对 38份瓠瓜材料进行 ISS R-PCR扩
增 , 最佳反应体系和适宜的退火温度进行验证。
2　结果与分析
2.1　ISS R-PCR正交实验设计的直观分析
PCR扩增的结果依据谱带的强弱及杂带的多
少 , 并结合试验目的 , 进行直观分析[ 9] 。从图 1 可
以看出 , 9个处理均扩增出比较清晰的条带 ,且不同
处理之间存在明显的差异;条带数最多的有 2 、3 、5 、7
号处理;其次是 4号处理;条带数比较少的是 1 、6 、8 、
9号处理;2 、5号处理主带清晰;1 、 4 、 6 、 8 、 9号处
理在 500 ～ 1 500 bp之间主带有缺失;3号处理背景
模糊且杂带多;7号处理则条带比较模糊 。5号处理
的条带亮度大于 2 号处理 。综合以上分析 , 在 9个
处理中 , 5号处理为最佳 , 即在 25 μL 反应体系中 ,
含 1 ×PCR buf fe r , 200 μmol · L -1 dN TP , 0.5
μmo l·L -1引物 , 2.5 mmo l·L -1 MgCl2 , 30 ng 模
板 DNA , 0.75 U的 Taq酶 。
2.2　退火温度的确定
PCR反应的退火温度取决于所选引物中 GC
碱基对的含量 。在 PCR反应中 , 退火温度的高低
直接影响到引物与模板 DNA 的特异性结合和扩增
条带的样式。由图 2可见 , 退火温度对 ISSR-PCR
扩增条带有明显的影响。当退火温度低于 Tm 时
(1 ～ 6号处理), 条带数少且模糊 , 有非特异性扩
增条带 , 背景呈弥散状;当退火温度为 56.5℃、
58.1℃、 59.7℃时 , 扩增条带数增多 , 条带逐渐清
晰 , 引物与模板的特异性结合增强 , 亮度增加;当
温度高于 61.0℃时 , 无扩增带产生。从表 3可以
看出 , 12条 ISS R引物的最佳退火温度一般都高于
其理论 Tm 值 2 ～ 6℃, 平均高 3℃。在 (AC)8的
3′加锚 “ T” 的引物 , 其最佳退火温度高于 Tm 值
3℃左右 , 而在 (AC)8的 3′加锚 “G” 或 “C” 的
引物 , 其最佳退火温度高于 Tm 值 4 ～ 6℃。
184 福建农业学报 第 23卷
图 3　引物 (AC)8C 对 38 个瓠瓜材料的 ISS R-PCR结果
Fig.3　Amplification effect of(AC)8C primer on 38 bottle gourd accessions
2.3　最佳反应体系和退火温度的验证
根据获得最佳反应体系用引物 (AC)8C 对 38
份瓠瓜材料进行 ISSR-PCR 扩增 (图 3), 退火温
度为 62℃(表 3), 反应程序其他参数不变 , 36个
供试材料均能扩增出条带 , 扩增片段 200 ～ 1 500
bp , 多态性条带数目多且清晰 。
3　讨论与结论
ISSR技术基于 PCR 反应 , 其原理与 RA PD
比较相似 , 所不同的是 ISS R所用引物序列来源于
简单重复序列区域 , 引物序列长 , 退火温度高 , 检
测多态性更灵敏 , 反应系统更稳定。但 ISSR仍易
受到反应体系各组分浓度 、扩增程序和退火温度等
诸多因素以及物种不同的影响 。已有诸多的文献阐
述了 PCR反应体系中各组分浓度对扩增的结果的
影响及其机理[ 10-11] , 本试验结果也证明了采用不
同的体系组合和退火温度其结果差异很大 。因此 ,
利用 ISSR标记时 , 首先都应先建立起合适的反应
体系并对其进行优化[ 5-6] 。
本试验采用正交试验设计的均衡分散 、 综
合可比以及可伸可缩 、 效用明确的特性 , 对影响
ISS R扩增的各组分进行筛选 , 可以避免单一因素
试验结果的不足 。试验表明 , 在采用正交试验设计
筛选最优水平组合时 , 应注意设计各组分各个水平
之间的梯度不宜过大 , 都应在 ISSR-PCR反应体系
的适宜范围 , 这样能较快地找到最优水平组合。本
试验对退火温度进行梯度测验表明 , 不同的 ISSR
引物有其特异退火温度 , ISS R引物最佳退火温度
一般高于其理论 Tm 值 3℃左右 。在 ISS R-PCR反
应中 , 选用不同的引物时 , 设置退火温度 (Tm ±
6)℃梯度进行单一因素的研究 , 可以较快获得最佳
的退火温度 。
参考文献:
[ 1] DECKER WALTERS D , STAUB J E , CHUNG S M , et al.
Diversity in landraces and cu ltivars of b ot tle gou rd (Lagenaria
siceraria:Cucurbitaceae)as as ses sed by random amp lified poly-
morphic DNA [ J] .Genet Resour C rop Evol , 2001 , 48:369
-380.
[ 2] BLAIRM W , PANA UD O , MCCO UCH S R.Inter-sim ple se-
quen ce repeat(ISSR)ampli ficat ion for analy sis of micro satellit e
mot if f requency and f ingerprint ing in rice(Oryza sat iva L.)[ J
] .Theor.Appl Genet , 1999 , 98:780-792..
[ 3] 马朝芝 , 傅廷栋 , STINE T UEVESSON , 等.用 ISSR标记技
术分析中国和瑞典甘蓝型油菜的遗传多样性 [ J] .中国农业科
学 , 2003 , 36 (11):1403-1408.
[ 4] 毛伟海 , 杜黎明 , 包崇来 , 等.我国南方长茄种质资源的 IS SR
标记分析 [ J] .园艺学报 , 2006 , 33 (5):1109-1112.
[ 5] 姜帆 , 高慧颖 , 陈秀萍 , 等.龙眼 ISSR-PCR反应体系的优化
及指纹图谱初探 [ J] .福建农业学报 , 2007 , 22 (3):256-
260.
[ 6] 林郑和 , 陈荣冰 , 陈常颂.茶树 ISSR-PCR反应体系优化研究
[ J] .福建农业学报 , 2006 , 21 (3):247-252.
[ 7] 王关林 , 方宏筠.植物基因工程[ M] .北京:科学出版社 , 2004.
[ 8] AMMON L , CLA UDE E , et al.Analysi s based on RAPD and
ISSR markers reveals closer simi lari ties among Cit rul lus and Cu-
cumis species th an wi th Praecit rullus f istulosus(S tocks)Panga-
lo [ J] .Genet ic Resources and C rop Evolut ion , 2005 , 52:465
-472.
[ 9] 何正文 , 刘运生 , 陈立华 , 等.正交设计直观分析法优化 PCR
条件 [ J] .湖南医科大学学报 , 1998 , 23 (4):403-404.
[ 10] 王彦华 , 侯喜林 , 徐明宇.正交设计优化不结球白菜 ISSR 反
应体系研究 [ J] .西北植物学报 , 2004 , 24 (5):899-902.
[ 11] 王佳 , 梁国华 , 缪旻珉 , 等.正交设计优化黄瓜 ISSR 体系
[ J] .分子植物育种 , 2006 , 4 (3):439-442.
(责任编辑:林树文)
185第 2期 高　山等:瓠瓜 ISSR-PCR反应体系优化