全 文 ：第2 1卷
19 9 5年
第 1期
l 月
作 物 学 报
A CT A A GR ON O M I C A S IN IC A
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.
2 1
J n a
.
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.
1 9 9 5
普通小麦一顶芒山羊草异源附加系
的创建和鉴定
1
. 小麦花药培养对创建普通小麦一顶芒山羊草
异源附加系的作用
翁跃进 董玉深
(中国农业科学院作物品种资源研究所 , 北京 10 0 8 1)
提 要 通过顶 芒 山 羊 草 ( 通 e g ilo 声 。 o o o s a Zn = Z x = 14 , M M ) 与波斯 小 麦 ( rT ir ie u 。
详 rs ic u 阴 2n 一 4x 二 28 , A A B B) 杂交 , 人工合成遗传上 相对稳定的双二倍体 ( Z n = x6 = 42 ,
A A B B M M )
, 以此为桥梁 , 与普通小麦 ( rT l’t ic u 阴 ae st i vu 。 ) 品种 “ 欧柔 ” 进行正反杂 (回 ) 交 ,
借助花药培养过程中能产生非整倍单倍体和非整倍双倍体的特点 , 在改 良 C ,: 固体培养基上接种
花药 , 诱导愈伤组织 , 获得 14 5 株绿色花粉植株 , 从中选择 6 株 2n 二 4 的双倍体和 9 株 n = 2 的
单倍体 , 用 0 . 1% 秋水仙素加倍处理 n = 2 的单倍体 , 于花粉母细胞减数分裂时期进一步检查染色
体构型 , 选择出 6 份 21 对染色体并附加有 1对落后染色体的材料 。
关键词 顶芒山羊草 ; 异附加系 ; 花药培养
创建异源附加系对干遗传和育种工作很有意义 。 利用一套完整的附加 系可以进行一系列
的深入研究 , 例如 , 研究染色体组的亲缘关系 , 物种的起源和进化 , 基因的互作 、 定位和表
达 , 异源附加系还是创建异源代换系和易位系的基础 。 O’ M ar a ( 19 4 0) 首先提出了人工创
建小麦 一黑麦二体异附加系经典的双二倍体方法 , 后人在此基础上改良和派生出了 lF 杂种
法 、 桥梁 亲本 法 、 双倍体 回交 法和 单 倍体法 等 多种 方法 , 先后 创建 了黑麦 ( iR ley 和
C h a pm
a n , 19 5 8 ; R il e y 和 K im b e r , 1 9 6 6 ; E v a n s 和 J e n k i n , 19 6 0 ; D ir s e o l l 和 S e a r s ,
19 6 3 ; 马 缘 生 , 19 8 5 , 19 9 0 ; H u H a n (胡含 ) , 19 8 8 , 19 8 9 , 19 9 0 ) 、 长穗惬 麦草 ( A .
e zo n g a r u m ) ( s e h le h u b e : 和 s e b e s t a , 1 9 5 9 : 李振声等 19 8 5 ; 孙善澄等 , 1 9 5 5 ) 、 中I’ed 堰麦草
( A
.
in r e mr
e d i“ 阴 ) ( W i e n h u e s 一 o h l e n d o r f 1 9 6 0 , C a u d e r o n , 1 9 6 6 ; 何孟元 等 , 19 8 6 ) 、 大麦
( I
s la m
, 19 7 8 ; 李璋 , 19 9 0 ) 、 大赖草 (五力朔 u s g l’ga n t e su ) ( M u je e b一 K a z i , 1 9 8 3 ) 、 小伞山
羊草 ( K im b e r , 19 6 7 ; C h a p m a n 和 R i l e y , 19 70 ) 、 偏凸山羊草 ( o o s b a , 19 7 5 ) 、 簇毛麦
( H y d
e 等 , 19 5 3 ; S e a r s , 19 5 3 ; L i u , D . J . (刘大钧 ) , 19 8 6 , 19 8 5 ) 等 2 4 个属种的部分
或全套异附加系 ( S h e p h e r d 等 , 19 8 8 ) 。
顶芒山羊草 ( A eg ilo sP 。 口m os a) 起源于欧洲南部的希腊和土耳其等国 , 一年生草本 , 二
倍体 (2 n 二 14 , M M ) , 为山羊草属 中 M 染色体组的代表种 , 抗白粉病 , 抗麦杆蝇 , 其 ZM
染色体上携带有抗条锈基 因 Y r s 和抗杆锈基因 S r 3 4 ( R i le y 等 , 19 6 6 ; M o i n t o s h , 19 8 8 ) 。
iR le y ( 19 6 8) 曾利用经典的传统方法创建了一个普通小麦一顶芒山羊草 (2 M ) 附加系 。
本文将报道根据染色体工程的方法 , 通过远缘杂交结合花药培养 , 利用花药培养过程 中
收稿 日期 : 19 9 3一 0 3 一 16 , 终审完 毕 日期 : 1 99 4一 0 1一 0 9
作 物 学 报 21 卷
能进行配子选择的特点 .选取 2n= 4的非整倍性双倍体和染色体加倍处理 n一 2的非整倍
性 单倍体 , 将顶芒山羊草的染色体导入普通小麦 , 快速创建新的普通小麦 一顶芒山羊草异源
附加系 。
1 材料与方法
1 材料
研究所用 3 个基因型均 由中国农科院品资所麦类室提供 , 其产地和染色体组成见表
表 1 研究材料的编号 、 染色体组和来源
T a b l e 1 A e e es i
o n . u口映 sr , g e . o . e s a n d o ir ig o o f m a t e ir a l
种
S P e e l e s
编号或品种
N o
.
o r v a ir e t y
国家统 一编 一号
N a t i o n a l n u m b e r
染色体组
G e n o m e
来源
o ir 邵 n
顶芒山羊草 注 e g lo 那 e o m o s a Y 1 6 1 R M O I 2 5
波斯小麦 rT i r i e u m 尸 r s l M Y 3 4 1 7 A A B B
普通 小麦 T ir t一e u m a e s t i v u m 欧柔
o r o fe f z
M Y 2 2 5 5 A A B B D D
德国
G e r r n a n y
德国
G e r m a n V
智利
C h i l e
方法
合成 小 麦一项 芒 山 羊草双二倍体 10 月初播种顶芒山羊草 Y 1 61 和波斯小麦 P S S , n
2
月底移入温室 , 来年 2 月在温室内选取生长健壮的波斯小麦 P S 植株剪颖去雄并套袋 , 第 2
天授予顶芒山羊草 Y 16 1 的花粉 , 杂交后 13 一巧 天取 下杂交穗 , 统计结实率 (结实粒数 / 杂
交小花数 ) , 将杂交种子经 10 % 次氯酸钠浸抱消毒 10 分钟 , 无菌蒸馏水洗两次后 , 将杂种幼
胚移植到发育饱满的裸姆 “ 中国春 ” 胚乳上 , 在 N 6 培养基上暗培养一周后进入光培养 , 成苗后
经过 2一 3 次壮苗培养 , 4 月中旬移至大田 , 抽穗后套袋自交 , 结实者即为 自然加倍的双二倍
体 。 秋播前 , 通过根尖染色体检查 , 进一步确定染色体数目。 检查后的种子播种大田。
1
.
2
.
2 花药培 养 将小麦 一顶芒山羊草双 二倍体与普通小麦品种 “ 欧柔 ”正反交和回交 , 在
.F ,
、
F : 和 B C , 植株 中选单核 中期 , 形态 上挑旗后旗叶与第二叶相距 I G一 15 c m 的幼穗 ,
o4 c 低温 下预处理 3 天 , 70 % 酒精消毒 , 在改 良 C 17 固体培养基上接种花药 , 黑暗条件下
3 0o C 培养两天后转入 25 O C 恒温培养 , 见愈伤组织小米粒大小时 , 转入固体分化培养基光下
培养 , 成苗后劈羹转人 N 6 壮苗培养基上繁殖 各培养基的主要成分及用途详见表 o2
1
.
.2 3 细 胞学 鉴 定 根尖有丝分裂染色体检 查 :取饱满完熟的种子浸泡 24 小时 , 2 o2 C 发
芽 4 8 小时 , 或取壮苗培养基上花粉植株的乳曰 色根系 , 切取新生根尖 2一 3 m m , 《)- 4oC 冰
水处理 30 小时 , 卡诺固定液 I ( 9 5% 乙醉 3 :冰醋酸 l) 固定 2 个小时以上 , I N H C 1 6 o0 C 水
解种子根尖 13 分钟 , 花粉植株根尖 8 分钟 , 锡夫试剂染色 , 45 % 醋酸压片 , 选取分散较好
的分裂相 , 计数染色体 , 统计至少 5 个以上细胞作为该株的染色体数 。
花粉母细胞减数分裂期染色体行为检查 : 当植株旗叶与倒二叶叶间距为 5一 6 c m 时 , 选取
幼穗减数分裂 中期花药用卡诺固定液 I 固定 , 24 小时后转入 70 % 乙醇 中 5 分钟 , 蒸馏水洗
抱 5 分钟 , I N H 1C 60 ℃ 水解 8 分钟 , 锡夫试剂染色 , 1% 醋酸洋红压片镜检 , 检查花粉母
细胞减数分裂 中期 I的染色体行为 , 统计单价体 、 环形二价体 、 棒状二价体 、 三价体和四价
体的频率 。
1期 翁跃进等 : 普通小麦一顶芒山羊草异源附加系的创建和鉴定 1.
12.4 染 色体加倍 对经过根尖细胞检查确定为单倍体的植株 , 在 N 6壮苗培养基上培养 ,
当生长至 3一4 片叶龄时 , 去掉培养基 , 用 自来水反复冲洗根部 , 放人 0 . 1%的秋水仙素水溶液
中 (含 .2 5%二 甲基亚讽助渗 ) , 在 10 ℃ 恒温下分别浸泡分羹节以下 72 小时或 % 小时 , 移
至温室 , 正常管理 , 收获结实的种子 , 播种前进一步进行根尖细胞学检查 , 确定染色体数 。
表 2 花药培养中培养墓的主要成分和用途
T二 b l e 2 C o m pe oe . 七 a目 us es o f . 曰 iu . u s ed 1. 明出 e r e ul 臼叮 e
培养墓 M e d iu m 主要成分 C o m p o n e n t 用途 U se
诱导培养基 I n d u ce m e d iu m e l , + 2 / L Z, 4 一 n / L 6 一 B ^ P o t a t o e x t r a e t s o 。 诱导愈伤组织
分化培养基 R e g e n e r a t i o n m e id unz e , , + 2 / L K T o 万 / L I B A 诱导根芽形成牡苗培养基 s t r o n g s e d lin g m o d i u m N 6+ , o / L I A A 1 5 / L A s p a r a g i n e 2 0 / L L H 培 养扩繁壮苗
继代培养基 s u e e e s s io n m e d i u m C 、 : + o 、 6 / L K T 0 4 / L N A A 继代诱导根芽
2 结果与分析
花药培养 8 种材料共获得 145 株绿色花粉植株 , 经过根尖染色体检查鉴定 , 确定了 124
株的染色体数 , 其染色体数 目范围和分布频率见表 3 和图 1。
表 3 花粉植株的染色体傲目 (单位 : 株数 )
T a 七l e 3 C址。口 os . e 二m卜 r o f 卯业 . 内 . d e妞 (仙妞: n . m悦 r o f p l . . t )
_ _
_ 染色体数目 N O o f c h r o m o s o m e基因型 — 一一— 一二止二二匕竺匕二一一一二二二二兰二置兰立里止二兰二竺址—— 一 总计反 n晶 en .一一一遵鱼竺上些竺些一一一 一卫造竺鱼些竺一 扁 alt17 19 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 4 2 4 4 50 54欧柔 O r o fe n 2 8 2 2 14
(双二倍体 x 欧柔 )F , 1 1 1 3
( A m p址 di p lo id x o r o fe n ) F l
(双二倍体 x 欧柔 ) x 欧柔 F . 4 4
(A m p h i d ip lo id x o r o fe n ) x o r o fe n
欧柔 x (双二倍体 x 欧柔 ) 5 10 1 5
o r o fe n x (A m p ih d一p lo 一d x o r o fe n )
(欧柔 ` 双二倍体 ) F . 8 1 4 4 4 2 1
( o r o fe n x A m p ih d ip l o id ) F ,
(欣柔 x 双二倍体 )只 欧柔 2 2 2 14 2 1 1 3 4 2 3 3
( o r o fe n x A m p ih d iP l
o id ) x o r o fe n
欧柔 x (双二倍体 x 欧柔 ) 3 3
o r o fe n x (A m P h id iP l o id x O r o fe n )
(欧柔 x 双二倍体 ) F Z 4 6 ] 0 2 1 7 1 3 1
(O
r o fe o x A m p h id ip l o id ) F Z
总 计 T o at l 2 1 1 13 5 4 6 6 2 13 9 6 2 1 24
频率 (佗么) F er q u e n e y 一6 5 , 1 0 . 5 4 3石 4名 4名 1 6 一。万 7 3 4名 1 . 6 10 0
其中单倍体 ( n 二 2一) 5 4 株 , 非整倍单倍体 ( n = 1 7 , 19 , 20 , 2 2 , 2 3 , 2 4 ) 钓 株 , 单
倍体范围的植株共 9 4 株 , 占花粉植株的 75 .8 % 。 双倍体 ( Z n 二 4 2) 有 13 株 , 非整倍双倍
体 ( Z n 二 4 , 50 , 5 4) 有 17 株 , 双倍体范围共计 30 株 , 占全部花粉植株的 24 . 2% 。 花粉植株
染色体的分布频率明显 , 以 n = 21 的 单倍体和 Z n 二 42 的双倍体为两个分布中心 (见图 l ) ,
前者的分布频率 ( 43 . 5% ) 明显高于后者的分布频率 ( 10 . 5% ) , 说明花药培养的花粉植株
主要是单 倍体 , 直接来 自花粉粒 , 少数产生 了加倍效应 。 在单倍体范围内 , 除了 n 二 21 的
个体之外 , 还有 6 株 n 二 2 的个体 , 占全部花粉植株的 .4 8% ; 双倍体范围内除 了 2n = 42
的双倍体外 , 也有 9 株 Z n 二 4 的双倍体 , 占全部花粉植株的 7 . 3% 。 这些非整倍性的花粉
植株为人工创建异附加系提供了物质基础 。
作 物 学 报 21卷
对于 6 株加倍处理后 n 二 2的材料和 9株 Z n 二 4 的材料进一步在花粉母细胞( P M C )
减数分裂时期检查染色体构型 , 从 中选出 2 对正常染色体和 1 对落后染色体的材料 6 份
( 见图 2 和图 3) 。 由于没有发现四价体的染色体构型 , 因此 2 对 染色体排除 了四体的可
能 , 很可能是一个二体附加系 , 即普通 小麦的 21 对染色体加上 l 对与之不 同步的顶芒山羊
草的 M 染色体 。
1 9 2 1 2 3 25
ll
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L|L|
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40352巧105
蓦
显
染色体数
图 1 花粉植株染色体分布频 率
T h e fr e q u e n e y o f d i s t ir b u t i o n o f e hl o m o s o m e s o f Po l le n p la n t le t s
3 讨论
远缘杂交结合花药培养 , 开辟了染色体工程的新途径 , 特别是为创建异源附加系提供了
新的方法 。 远缘杂交导入了外源遗传物质 , 突破了 “ 种” 的局限 , 扩大了基因交流的范围 , 丰
富了遗传的变异 。 花药培养使这些遗传的变异快速稳定纯合 。 在较短的时间内 , 获得了大量
的单倍体 、 多倍体 、 混倍休和非整倍体 , 表 3 和图 l 表现 了花粉植株染色体数 目的丰富多
样 , 这就为创建异源附加系提供了物质基础 。 通过对远缘杂种花药培养 , 除 了直接获得的缺
体 、 异代换系 、 异附加系之外 , 单倍的非整倍体经过染色体加倍处理 , 也可以获得各种类型
的缺体 、 异代换系和异附加系外 , 如果考虑花药培养过程中出现端体染色体 , 染色体结构变
异 , 染色体重排和 核融合等 多种变异 类型 , 会得到更 多的特殊遗传材料 。 D e B u y s er 等
( 1 9 8 8 )
, 俞春江等 ( 19 90) 分别报道了花药培养过程 中染色体数 目的变异 , 在他们的培养过
程 中都发现了 4 株非整倍单倍体和非整倍双倍体 , 包括 n 二 2 的单倍体和 2n = 4 的双倍
体 。 M e t z , S . G .等 ( 19 8 8 ) 在花药培养两个冬麦基因型 C e n t u r k 和 N B 8 8 时 , 也在 2 7 5 株
绿色植株 中发现了 4 株 2 条染色体的单倍体花粉植株和 1 株 4 条染色体的双倍体花粉植
株 。 本试验也在配子选择中 , 得到 T 9 4 株 1 7 、 19 、 2 0 、 2 1、 2 2、 2 3、 2 4 条染色体的单倍体
和 30 株 42 、 4 、 50 、 54 条染色体的双倍体绿色植株 , 花药培养可以使这些远缘杂交的配子

科 作 物 学 报 2 1卷
好方法 。 本试验从 124 株花粉植株获得 了 4. 8 %的 n =2 的单倍体和 7. 3 %的 Z n ~ 4 的双倍
体 , 从 中选出 6 个二体附加系 , 只用了 2一 3 个世代就完成 了小麦 一顶芒山羊草附加 系的创
建工作 , 周期短 , 稳定快 , 节省了时间 , 同时也提高了选择效率 。 胡含 ( 19 8 8 ) 在培育八倍
体小堰麦 ( rT it cu 阴一A gr 口刃or n) 与普通小麦杂种花药的过程中 , 已证实用花药培养方法创
建小麦异源附加系比传统的杂交方法提高效率 18 . 2 倍 。
参 考 文 献
董玉深 、 许树军 、 周荣华等 , 19 90 , 植物细胞工程 与育种 , 北京工业大学出版社 , 北京 , 1 7 8一 18 c3
胡含 、 都子英 、 庄家骏等 , 19 7 9 , 遗传学报 , 6( 3) , 3 2 2一 3 3 0 。
胡含 , 19 90 , 植物遗传理论与应用研讨会文集 , 中国遗传学会 , 103 一 10 60
马缘生 、 郑先强 、 王葆军等 , 】9 8 5 , 武汉植物学研究 , 3`4) , 35 1一 3 5 5
陶跃之 、 胡含 , 19 89 , 遗传学报 , 16 ( 5) , 3 4 2一 3 4 7 。
俞春江 、 庄家骏 、 胡适全 , 19 90 , 植物细 胞工程与育种 , 北京工业大学 出版社 , 91 一9 5。
D e b u y s e r
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a e t A g o a t g r a s s (A e g i l o PS e o 巾 o s a S i b t h . e t S m . Z n 二 Zx = 14 , M M ) w a s c r o s s e d w i t h
a t e t r a P l o id w h e a t ( rT i t i
e u m 尸 r s i e u 川 V a r . e x Z h u k . Z n 二 4 x = 2 8 , A A B B ) . T h e e h r o m o s o m e s o f
t h e h y b ir d d o u b l e d s p o n t a n e o u s l y a n d a n a m p h i d i p lo i d ( A A B B M M ) w a s s y n t h e s i z e d a r t i if e i a ll y
.
A s a b ir d g e
,
t h e a m p h id i p ] o id w a s e r o s s e d a n d b a c k 一 c r o s s e d w i t h t h e “ O r o 几 n ” , a e o m i n o n
场 h e a t ( rT i t i e u用 a e s r i v u m L
.
) v a r i e t y
.
T h e a n t h e r s o f t h e F I
,
F Z a n d B C , w e r e e u l t u r e d o n im
-
p r o v e d C 1 7 m e d i u m a n d a n e u h a P l o i d s a n d a n e u d iP l o i d s w e r e o b t a i n e d
、
6 o f th e r e g e n e r a t e d p la n t s
w i t h Z n = 4 4 e h r o m o s o m e s a n d 9 o f t h e r e g e h e r a t e d P l a n t s w i t l l n = 2 2 e h r o m o s o m e s w e r e s e l e e t e d
.
A n d t h e l i , T h e 9 P l a n t s w e r e t r e a t e d w i t h 0
.
1马乞 e o l e h i e i n e . 6 o f t h e rn h a d 2 2 b i v a l e n t
e h r o m o s o m e s
,
i n e l u d i n g 1 p a i r o f d e l a y e d e h r o m o s )t m e s a n 入4 a t e P h a s e 1 . T h e y a r e p o s s l b i ll t y fo r
A e g ; lo 声 e o阴 。 , a d l s o m i e a d d i t io n l一n e s i n c `〕 m m o n w h e a t .
K e y w o r d s A e g i lo 那 (刀阴 。 , a ; A d d i t io n li r , e s二 A n t h e r e u lt u r e