全 文 ：西北农业学报　 2005, 14( 1): 1～ 5
Acta Agricultur ae Bo rea li-occidentalis Sinica
易变山羊草两个 y-型高分子量谷蛋白新亚基的
鉴定及基因编码区分子克隆
⒇
颜泽洪 , 郑有良 , 代寿芬 , 刘登才
(四川农业大学小麦研究所 ,四川都江堰　 611830)
摘　要: 利用 SDS-PAGE和分子克隆方法研究了易变山羊草的高分子量谷蛋白亚基及其基因。结果表明 ,四
倍体易变山羊草有 3个可表达的高分子量谷蛋白亚基。其中一个亚基的迁移率很慢 ,推测其为 Glu-U1x;另外
2个亚基的迁移率分别与中国春的 Bx7和 By8接近或更慢 ,利用一对特异扩增基因编码区的引物得到的扩增
片段长度分别为 2. 5 kb和 1. 9 kb。分子克隆得到阳性质粒 p2. 5和 p1. 9。基因测序结果显示二者均为 y型高
分子量谷蛋白基因 ,它们与普通小麦中已经报道的 y型高分子量谷蛋白基因在核苷酸和氨基酸序列上都存在
差异 ,是 2个不同的高分子量谷蛋白新基因。
关键词: 易变山羊草 ; 高分子量谷蛋白 ; 基因克隆
中图分类号: Q512+ 4　　　　文献标识码: A　　　　　文章编号: 1004-1389( 2005) 01-0001-05
Identif ication and Molecular Cloning of Two Novel y-type
High-molecular-weight Glutenin Subunit Genes from Aegilops Variables
YAN Ze-hong , ZHENG You-liang, DAI Shou-fen and LIU Deng-cai
( Tri ti ceae Research Ins ti tu te, Sich uan Agricultural Universi ty, Dujiangyan　 611830, China)
Abstract: The high mo lecula r w eight glutenin subuni ts and thei r encoding genes in Aegilops variables
were cha racterized by SDS-PAGE and molecular cloning. It ha s been suggested that 3 active high
molecular w eigh t g lutenin subuni ts could be sepa ra ted in Aegilops variable. Among them, the putativ e
Glu-1x type subuni t , has the slowest mobi li ty in SDS-PAGE, the other tw o , had much slow er or the
same mig rate mobili ty as Bx7 and By8, respectiv ely. The PCR amplification f ragments of these tw o
subuni ts g enes were 2. 5 kb and 1. 9kb. Tw o types of positiv e clones were obtained by mo lecula r
cloning. Sequencing of g ene coding regions indicated tha t they were tw o y type novel genes.
Key words: Aegilops variables; High molecular weight g lutenin; Gene cloning
　　谷蛋白 ( glutenin)和醇溶蛋白 ( g liadin)是普
通小麦种子中的 2大类贮藏蛋白。谷蛋白又分为
高分子量谷蛋白 ( HMW glutenin)和低分子量谷
蛋白 ( LMW glutenin) ,醇溶蛋白又包括α、β、γ和
ω四种组分 [1, 2 ]。高分子量谷蛋白因对小麦面粉面
团的弹性有重要影响而与小麦的加工品质密切相
关 ,从而得到广泛研究 [1, 2 ]。在普通小麦中 , 高分
子量谷蛋白亚基分别由位于第一同源群染色体
1A, 1B和 1D长臂上的 Glu-1A, Glu-1B和 Glu-
1D位点的多个 x和 y型等位基因编码 [3, 4 ] ,每一
基因位点可分别编码一个 x型和一个 y型蛋白亚
基 [4 ]。在绝大多数小麦品种中 ,由于受基因沉默的
影响。不同小麦品种的种子中常含有 3～ 5个数
量不等和组成各异的高分子量麦谷蛋白亚基。
在小麦及近缘物种中蕴藏着大量的普通小麦
栽培品种遗传背景中所不具备的高分子量谷蛋白
⒇收稿日期: 2004-10-08　　修回日期: 2004-10-26
基金项目:国家自然科学基金 ( 30370882) ;四川省教育厅和科技厅科研项目资助。
作者简介:颜泽洪 ( 1970- ) ,男 ,重庆石柱人 ,副研究员 ,从事小麦遗传与育种研究。 E-mai l: zhyan104@ 163. com
亚基 ,它们是改良普通小麦品质的潜在基因资源 ,
由于这些物种所具有的高分子量谷蛋白基因在各
自染色体上的位置具有相对的保守性 ,在功能上
与普通小麦来源的同类基因具有相似性 ,因而是
可以转移利用的高分子量谷蛋白新基因 ,极大地
丰富了改良普通小麦品质的基因来源。
易变山羊草 ( Aegilops variabil is Eig, 2n= 4x
= 28, UUSS)是分布在地中海和中东地区的一个
一年生四倍体物种。抗小麦叶锈、秆锈和根腐病以
及抗根结线虫等 [5, 6 ] ,是对小麦进行遗传改良的重
要资源。在本研究中 ,笔者对易变山羊草所具有的
高分子量谷蛋白进行了 SDS-PAGE分析并对其
基因编码区进行了分子克隆和序列测定 ,以期为
认识和利用易变山羊草物种中的高分子量谷蛋白
基因来改良普通小麦的品质提供理论依据。
1　材料与方法
1. 1　材 料
易变山羊草 ( Aegilops variabil is , U USS, 2n
= 4x= 28)材料 As28, As27和 As34以及小伞山
羊草 ( Ae. umbel lulata , U U, 2n= 2x= 14)材料
As2被用作高分子量谷蛋白亚基组成检测 ,普通
小麦 ( T . aestivum , AABBDD, 2n= 6x= 42)品种
中国春 (亚基组成: 7+ 8, 2+ 12)和川育 12( 1, 7+
8, 5+ 10)被作为高分子量谷蛋白标准对照 ,它们
均由四川农业大学小麦研究所收集保存。 其中 ,
As28被用作 DN A提取及基因分子克隆。
1. 2　方 法
种子蛋白提取和 SDS-PAGE分析按文献 [8 ]
的方法进行 ;按文献 [8 ]的方法从 As28的黄化苗
中提取 DNA。 PCR反应体系以及 PCR条件均按
照以前的方法 [9 ]进行 , PCR扩增所用引物序列为
P1: 5 -ATGGCTAA GCGGC / TT A /GGTCC
TCTT TG-3, P2: 5 -CT ATCACT GGCT A /
GGCCGACAA TGCG-3。
克隆于 pBlueScript SK(+ /-) T-载体中。 以
KpnI和 XhoI双酶切后再以核酸外切酶Ⅲ处理
制备亚克隆。 测序由 TaKaRa大连有限公司进
行 ,利用 N CBI网址中的相关软件进行 DNA序
列拼接和核酸与氨基酸序列分析。
2　结果与分析
2. 1　易变山羊草高分子量谷蛋白组成分析
SDS-PAGE分析表明 , 3份易变山羊草均可
分离出 3个可表达的高分子量谷蛋白亚基 (图 1,
第 2, 3和 4泳道 ) ,其中 As27和 As28两份材料
的高分子量谷蛋白带型完全一致 (图 1,第 2和 3
泳道 ) , 1份小伞山羊草分离出 2个高分子量谷蛋
白亚基 (图 1,第 5泳道 ) , 3份易变山羊草中迁移
率最慢的亚基与小伞山羊草的 Ux 略快或相当 ,
但均比普通小麦中国春和川育 12中迁移率最慢
亚基的迁移率还慢。
同时 ,以往的研究也表明由 U染色体组 Glu-
1位点编码的 x型高分子量麦谷蛋白亚基迁移率
很慢 [7 ]。因此 ,在易变山羊草中迁移率最慢的应
为 Glu-Ux。易变山羊草中的另外 2个亚基的迁移
率分别与中国春和川育 12的 Bx7和 By8的迁移
率十分接近或更慢。
由于易变山羊草为四倍体 ,理论上应该有 4
条可表达的高分子量谷蛋白亚基 ,而实际上仅检
测到三个亚基 ,这表明其中的一个亚基的基因沉
默而不编码可表达的蛋白亚基。但至于是 Sx , 还
是 Sy或 Uy暂时还不能确定。
1.中国春 Hexaploid wh eat Chines e Sp ring;
2. Aegi lop s variables ( UU SS) As28;
3. Aegi lop s variables ( UU SS) AS27;
4. Aeg ilops var iables ( U USS) AS34;
5. Aegi lop s umbelluta ( UU) AS2;
6. 川育 12 Hexaploid w heat Chuanyu 12
图 1　易变山羊草高分子量谷蛋白
亚基组成 SDS-PAGE分析
Fig. 1　 SDS-PAGE analysis of h igh molecular
glutenin subunit compositions of
Aegilops variabilis
2. 2　 PCR扩增和分子克隆
利用兼并性引物 P1 /P2,在易变山羊草材料
As28中同时扩增出了 3个 DNA片段 (图 2)。大小
分别是 3. 0 kb, 2. 5 kb,和 1. 9 kb。将 3个片段分别
·2· 西　北　农　业　学　报 14卷
回收并克隆到质粒载体后获得阳性克隆 p2. 5和
p1. 9。 p3. 0由于扩增和回收操作上的困难 ,未获得
阳性克隆。
1. DN A分子量标准 DN A molecular marker;
2. As28 PCR扩增 PCR amplif ication of
Aegilops va riabil is accession As28
图 2　 PCR扩增易变山羊草 As28的
高分子量谷蛋白亚基基因
Fig. 2　 PCR amplif icat ion of high molecular
weight gluten in subunit genes f rom Aegilops
variabilis accession As28
2. 3　核苷酸序列分析与比较
将 p2. 5和 p1. 9的 N、 C保守端序列分别与小
麦 A、 B、 D染色体组编码的基因进行比较 (表 1) ,发
现它们与所有 y型基因的一致性 (大于 90% )均
高于与所有 x型基因的一致性 (小于 90% )。因此 ,
p2. 5和 p1. 9均为 y型高分子量麦谷蛋白基因。据
此推测 ,四倍体易变山羊草沉默的是 Sx基因。
2. 4　氨基氨基酸序列分析
p2. 5和 p1. 9 N端均为 104个氨基酸 , 5个半
胱氨酸 ; C端 42个氨基酸 , 1个半胱氨酸。都有 21
个氨基酸的信号肽。这些都与小麦中已报道的 y
型高分子量谷蛋白基因的典型特征符合 ,进一步
证实了它们均为 y型高分子量谷蛋白基因 (图
3)。
p2. 5和 p1. 9在 N保守端有 4个氨基酸的差
异 , C保守端有 9个氨基酸的差异 ,都为替换 ,没
有缺失。究竟 p2. 5和 p1. 9是 Uy还是 Sy从目前
的测序结果上还不易区分 ,但可以表明二者是不
同的高分子量麦谷蛋白基因。
p2. 5和 p1. 9与普通小麦 A、 B和 D基因组
编码的 Ay , By9和 Dy10三个 y型基因都存在差
异。在 N保守端 , p2. 5和 p1. 9均与 Ay差异最大
(差异氨基酸数目分别是 14和 12个 ) ,与 By9都
分别有 5个氨基酸的差异 ,与 Dy10都分别有 4
个氨基酸的差异 ; C保守端的情况是 , p2. 5与
Dy10的差异最小 ( 3个氨基酸 ) ,与 Ay和 By9分
别有 10和 9个氨基酸的差异。P1. 9与 Dy10的差
异最大 ( 10个氨基酸 ) ,与 Ay和 By9分别有 4和
6个氨基酸的差异 (图 3)。
因此 , Uy和 Sy是两个不同的高分子量谷蛋
白新基因。
表 1　 p2. 5和 p1. 9与小麦高分子量麦谷蛋白基因的 N端氨基酸序列一致性比较
Table 1　 Identity of p2. 5 and p1. 9 with high molecular glutenin genes
derived from wheat in terms of N-terminal amino acid residues
基因序号
Genbank accession number
来源
Source
亚基类型
Type
与 p2. 5一致性 /%
Id en tity wi th p2. 5
与 p1. 9一致性%
Identi ty w ith p1. 9
X03042 Trit icum aestivum Ay 93 94
X61026 T . aestivum By9 94 95
X12929 T . aestivum Dy10 95 95
X03041 T . aestivum Dy12 96 95
X61009 T . aestivum Ax 1 87 82
M22208 T . aestivum Ax 2* 88 82
AF145590 T . aestivum AxNul l 88 82
X13927 T . aestivum Bx7 81 81
U19774 T . aestivum Dx2 88 82
X12928 T . aestivum Dx5 83 84
·3·1期　　　　　颜泽洪等:易变山羊草两个 y-型高分子量谷蛋白新亚基的鉴定及基因编码区分子克隆　　　　　　
* Ay, By9, Dy10在 Genbank中的序号分别为 X03042, X61026, X12929,有差异的氨基酸部位
直接以氨基酸标出 ,无差异部位则以横线表示
* The sequences of Ay, By 9 and Dy10 d eposi ted in Genbank are X03042, X61026 and X12929, respectiv ely. Th e amino acid s
dif f erences at th e same si te among 5 sequences are indicted by amin o acids residues, w hile th e same are indicted by sh ort bars.
图 3　 p2. 5和 p1. 9与小麦 Ay, By9和 Dy10在 N端 ( a)和 C端 ( b)的比较
Fig. 3　 Comparisons of amino acid of p2. 5 and p1. 9 with wheat high molecular
weight glutenin genes Ay, By and Dy10 in N ( a) and C ( b) terminal
3　讨 论
在本研究中 ,笔者对四倍体易变山羊草的高
分子量麦谷蛋白亚基及其基因进行了 SDS-
PAGE分析、分子克隆和序列测定 ,得到的两个克
隆均为 y型高分子量谷蛋白亚基。克隆到的 2种
类型的高分子量谷蛋白基因在核苷酸和氨基酸序
列均不完全相同 ,与已经发表的 y型亚基也存在
较大差异。因此 ,这是 2个完全不同的高分子量麦
谷蛋白基因。 这也说明 As28中不表达的高分子
量谷蛋白基因是 Sx。 然而 ,在四倍体易变山羊草
中具有 U和 S两种基因组 ,但由于一个染色体组
最多编码 2个高分子量麦谷蛋白基因 ,即一个 x
型 ,一个 y型。所以 ,这两个 y型亚基基因必然一
个来自 U染色体 ,一个来自 S染色体。 但到底哪
一个来源于 U组 ,哪一个来源于 S组 ,尚没有足
够的证据进行推测和判断。 易变山羊草中存在的
y型高分子量谷蛋白基因与来源于普通小麦来源
的高分子量谷蛋白基因在氨基酸组成上存在一定
的差异性但同时又在组成上有一定程度的类似。
这为它们具有与栽培小麦中本身所具有的高分子
量谷蛋白基因有大致相似的品质功能奠定了基
础。某些部位的有差异的氨基酸的存在 ,为它们具
有不同于已经发现的高分子量谷蛋白基因的潜在
的品质功能提供了可能。在普通小麦中 ,已有研究
表明 ,一些关键部位氨基酸的差异将可能导致其
品质功能的明显差异 ,这在 Dx5[13, 14 ] , Bx20[12 ]以
及变化的 Ax2* 亚基 [15 ]中有所体现。因此 ,今后
拟对 p2. 5和 p1. 9亚基进行转基因研究以研究其
具有的可能的品质功能。
参考文献:
[ 1 ]　 Kreis M , Shew ry P R, Ford e B G, et al . St ructure and
evolution of seed s to rage proteins and thei r genes wi th
particular reference to thos e of w heat, barely and rye[ J ] .
Oxford Surv Plan t Mol Cell Boi l, 1985, 2: 253～ 317.
[ 2 ]　 Payne P I, Harris P A, Law C N, et al . Th e High
molecular-w eigh t subuni ts of glu tenin: St ructure, genetics
and relationship to bread-m aking quality [ J ]. Ann l
Tech nol Argi, 1980, 29: 309～ 320.
[3 ]　 Payne P I, Holt L M , Law C N. Structural and g enetical
s tudies on the h igh molecular w eigh t su bunit s of wh eat
glutenin . part I, allelic variat ion in subunit s am ong st
variet ies of w heat ( Tr it icum aestivum ) [ J ]. Th eor Appl.
Genet. , 1981, 60: 229～ 236.
[4 ]　 Payne P I, Holt L M , Worland A J, et al . St ructural and
genetical s tudies on the high molecular w eigh t subuni ts of
w heat glu tenin . part III, telocent ric mapping of the
su bunit s genes on th e long arm of homologous g roup 1
ch romosomes [ J] . Th eo r Appl. Genet . , 1982, 63: 129～
138.
[ 5 ]　 Yu M Q F Person-Ded ryver, Jahier J. Resi stance to root
kno t nematode, Meloid og yne naasi ( Franklin) t rans ferred
f rom Aegi lops variabi lis Eig to b read wh eat [ J ].
Agronomic ( Paris ) , 1990, 6: 451～ 456.
[6 ]　 Spets ov P, Ivanov P , Ivanova I. Int rog ression of pow dery
·4· 西　北　农　业　学　报 14卷
mild ew resis tance f rom Aegilops ko tschyi into b read
w heat . Th e 9th intern [ J ]. Wheat Genet. Symp. ,
Canada. 1998 ( 2): 112～ 113.
[ 7 ]　 Law C N, Payn e P I. Genetical aspect of breeding for
imp roved grain protein conten t and type in w heat Journal
of Cereal [ J ]. Science, 1983, 1: 79～ 93.
[8 ]　 Wan Y, Liu K, Wang D, et al . High-Molecu lar-Weight
glu tenin sub uni t s in the Cylindropyrum and V er tebrata
section of th e Aegilops genus and identi fication of subuni ts
related to thos e encoded by th e Dx al leles of common
w heat [ J] . Th eor Appl Genet , 2000, 101: 879～ 884.
[9 ]　颜泽洪 ,万永芳 , 刘坤凡 ,等 .一种新型高分子量麦谷蛋白
亚基的鉴定及其与同源蛋白间氨基酸序列的差异 [ J ].科
学通报 , 2001, 46( 17): 1454～ 1459.
[10 ]　 Sudhi r Kumar, Koichi ro Tam ura, Ingrid B. Jak obsen,
and Masatoshi Nei MEGA2: Molecu lar Evolu tionary
Genetics Analysis sof tware [ M ]. Ari zona State
Universi ty, Tempe, Ari zona, U SA. 2001.
[11]　 Liu Z, Yan Z, Wan Y, et al . Analysi s of HMW g lutenin
su bunit s and th eir coding sequences in tw o diploid
Aegi lops species [ J] . Th eor Appl Genet, 2003, 106: 1368～
1378.
[12 ]　 Sh ew ry P R, Gi lbert S M , Savage A W J, et al . Sequence
and properties of HMW subuni t 1Bx 20 f rom pasta wh eat
( Tri ticum durum ) which is associated w ith poor end use
properties [ J ]. Th eor Appl Genet , 2003, 106: 744～ 750.
[13 ]　 Sugiyama T, rafals ki A, Peters on D, et al . A w h eat HMW
glutenin sub uni t gene reveals a high ly rep eated s t ructu re
[ J] . Nucleic Acids Res, 1985, 13: 8729～ 8737.
[14 ]　 Anderson O D, Greene F C. Th e characteri zation and
com parativ e analysi s of high molecular w eight g lutenin
genes f rom g enomes A and B of a hex aploid w h eat [ J ].
Th eo r. Appl. Gen et , 1989, 77: 689～ 700.
[15 ]　 Juhas z A, Tamas L, Karsai I, et al . Id enif icat ion , cloning
and characteri zation of a HMW glu tenin gene f rom an old
Hungarian w h eat variety, Banku ti l201 [ J ]. Euphytica,
2001, 119: 75～ 79.
·5·1期　　　　　颜泽洪等:易变山羊草两个 y-型高分子量谷蛋白新亚基的鉴定及基因编码区分子克隆