全 文 ：短芒大麦耐盐碱新品系的生理生化和
分子生物学分析
陆一鸣1 ,李彦舫1 ,曹明富2 ,李喜文3 ,张亚兰1 ,杨柏明1 ,杨松涛1 ,程肖蕊1
(1 解放军军需大学植物基因工程研究中心 ,长春　130062;2 杭州师范学院生物系 ,杭州　310036;3 东北师范大学遗传所 ,长春　130024)
摘要:以经60Co物理诱变种子 、EMS诱变和耐盐反复筛选后已稳定 6 代的短芒大麦耐盐碱突变体 N1、T3、T4 、T5 及
其亲本野生短芒大麦为材料 ,进行耐盐碱生理生化指标(脯氨酸 、质膜透性)测定及 RAPD分析。发现突变体与野生型
相比 ,不仅在生理生化指标上有明显的差异 , 而且在 DNA水平上发生了突变。研究结果为耐盐碱突变体的真实性提
供了有力的证据 ,表明突变体 N1、T3、T4、T5 是耐盐碱短芒大麦新品系。
关键词:短芒大麦;耐盐碱突变体;脯氨酸;质膜透性;RAPD
Physiological-biochemistrical and Molecular Biological Analysis of
Salt-tolerant New Lines of Hordeum brevisubulatium(Trin.)Link
LU Yi-ming1 , LI Yan-fang1 , CAO Ming-fu2 , LI Xi-wen3 ,
ZHANG Ya-lan1 , YANG Bai-ming1 , YANG Song-tao1 , CHENG Xiao-rui1
(1 Researching Center of Plant Gene Engineering of Quartermaster University of PLA , Changchun 130062 ;
2
Department of Biology , Hangzhou Teachers-training College , Hangzhou 310036;
3
Institute of Genetics , Northeast Normal University , Changchun 130024)
Abstract:Four Hordeum brevisubulatium(Trin.)Link salt-tolerant mutants(N1 ,T3 ,T4 ,T5)derived from60Co irradi-
ation , EMS induction and salt tolerance selection and their original line(CK), were used as materials and all the mutants
have inherited stably for 6 generations.Distinct differences were revealed between the mutants and original line by using
physiological-biochemistrical indexes(proline , electric conductivity)and molecular marker (RAPD).The result showed
that compared with the original line , the mutants varied not only on the salt-tolerant indexes level , but also on the DNA
level , which provided a strong evidence for the truth of the mutants.This study showed that these mutants(N1 ,T3 ,T4 ,
T5)were salt-tolerant new lines of Hordeum brevisubulatium(Trin.)Link.
Key words:Hordeum brevisubulatium(Trin.)Link;Salt-tolerant mutants;Proline;Electric conductivity;RAPD
收稿日期:2001-04-09
基金项目:吉林省科委资助项目(970205-2)
作者简介:陆一鸣(1975-),男 ,浙江杭州人, 博士 ,生物化学与分子生物学专业。 Tel:0431-7971016-66174;Fax:0431-7895900;E-mail:luyi@public.
cc.jl.cn
　　土壤盐碱化是世界上限制农业生产的一个重要
环境因素。全世界有 3.8×108ha 盐碱土地 ,在我国
0.67亿 ha耕地中就有 10%耕地为盐渍化土壤 ,严
重影响着现代农业的发展 。开发利用盐碱荒地 ,使
之发挥出生产上的巨大潜力是农业生产上的一个重
要课题。短芒大麦 [ Hordeum brevisubulatium(Trin.)
Link]是禾本科大麦属中的一种多年生草本植物 ,俗
称野大麦 ,广泛分布于我国的东北 、华北 、内蒙古 、青
海及新疆等地 ,其草质柔软 、适口性好 ,各种家畜喜
食 ,营养价值较高 ,同时又具有较高的产量 ,除放牧 、
调制干草 、加工草粉外 ,又可在低湿地上种植 ,建立
人工草地 ,具有良好的生产性能及较高的经济价值。
因此培育短芒大麦耐盐碱新品种对在我国西部大开
发中改良盐碱地 ,实现“退耕还草”具有重要的意义。
中国农业科学　2002 , 35(3):282-286
Scientia Agricultura Sinica
为了正确评价作物品种的耐盐性 ,需要鉴定一
些与抗盐有关的生理生化指标。脯氨酸 、质膜透性
即是其中之一[ 1] 。RAPD(random amplified poly-mor-
phic, DNA), 即随机扩增多态性 DNA , 最初是由
Williams和Welsh 两个研究小组同时在 PCR技术的
基础上发展起来的一种分子标记[ 2 ,3] 。由于其检测
覆盖整个基因组 ,位点多 ,不受材料和环境条件的影
响等优点而被广泛应用于作物遗传育种的各个方
面 ,是鉴别品种 、品系(含杂交亲本 、自交系)的有力
工具 。本研究通过测定经耐盐筛选的短芒大麦耐盐
碱突变体再生后代的生理生化指标和 RAPD分析鉴
定 ,为培育耐盐碱短芒大麦新品种(系)奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料　供试材料 N1 、T3 、T4 、T5为野生短
芒大麦经60Co 物理诱变种子及 EMS 处理短芒大麦
幼穗 、幼胚 、成熟胚的愈伤组织和悬浮培养细胞 ,诱
导产生突变体 ,耐盐反复筛选得到同一单株的后代 ,
其耐盐性不同 ,均经过连续 6代自交选择 ,在株高 、
生育期 、分蘖数 、空瘪率等多项农艺性状上有较大的
差异[ 4] 。
1.1.2　主要试剂　200条 RAPD随机引物(10bp)购
自美国 Operon 公司;Taq 酶 、dNTP 、CTAB(Cety-ltri-
ethylammonium Bromide , 十六烷基三甲基溴化铵)购
自北京鼎国生物技术发展中心 。
1.1.3 　主要仪器 　752分光光度计 , 电导仪 ,
9600PCR扩增仪。
1.2　方法
1.2.1　培养与盐胁迫处理 　将各突变体和野生
(CK)种子用 0.1%HgCl2 溶液浸泡 5min消毒 ,用自
来水和蒸馏水冲洗后 ,于 37℃浸种 24h ,自来水暗培
养至根长约 2cm ,转移至光下(光强约 200μmol·m-2·
s-1)培养 ,光照时间每天 12h。当幼苗长至约 3cm
时 ,移于含 Hoagland营养液的砂基中培养 。每盆定
苗10株 ,每种 3次重复 ,分成 4个处理组(1.0%Na-
Cl 、1.5%NaCl 、2.0%NaCl 、2.5%NaCl)及 1 个对照
组 ,温室光照条件为自然光 , 昼夜温度约为 28℃/
14℃,每日定时灌水 2次 ,对照组除不加盐外 ,其它
如同处理组。苗龄 2周后 ,进行胁迫处理(各处理液
用Hoagland营养液配置),处理 10d后测定其生理生
化指标(脯氨酸含量和电导率值)。
1.2.2　短芒大麦叶片脯氨酸含量的测定　参照徐
晓峰等的方法[ 5]
1.2.3　短芒大麦电导率的测定　参照上海植物生
理学会编《植物生理学实验指导》的方法[ 6]
1.2.4　短芒大麦基因组 DNA 的提取　用 CTAB法
提取和纯化[ 7] (改良)总 DNA。在 50ml离心管中加
入 10ml CTAB 提取缓冲液(100mmol/L Tris.HCl
(pH8.0);20mmol/L EDTA;1.4mol/L NaCl;2%(w/v)
CTAB;2%β-巯基乙醇), 65℃预热 。称取 1g 冷冻干
燥叶片 ,在液氮中(加0.1g PVP ,石英砂)迅速研磨成
粉末后 ,把粉末转入含 CTAB 提取缓冲液的离心管
中 ,边加边搅拌使之混合均匀 。65℃水浴保温 0.5
～ 1h ,中间温和混匀几次 。冷却至室温后 ,加入等体
积氯仿:异戊醇(24∶1), 颠倒混匀 10min 。离心
(10000r/min ,10min ,20℃),去沉淀 ,将上清液移至另
一离心管;加入 0.1 体积的 10%CTAB 液(10%
CTAB 、0.7mol/L NaCl),轻轻混合 ,重复 1 次。加入
等体积的 1×CTAB沉淀缓冲液(50mmol/LTris.HCl ,
pH8.0;10mmol/L EDTA , 1%CTAB),轻轻混匀 ,室温
放置 30min 或更长(如无沉淀 ,可再加入沉淀缓冲
液 ,直至出现沉淀)。室温条件下 , 6000r/min 离心
5min ,去上清液 ,沉淀纯化 。将沉淀溶于 500μl 1mol/
LNaCl中 ,可置于 65℃水浴中助溶。加入 2倍体积
无水乙醇 , 于 -70℃沉淀 30min , 或 -20℃过夜。
15000r/min离心 2min ,去上清液 。用 65%、85%乙醇
漂洗沉淀 ,吹干 ,用 50μl 无菌水溶解 , -20℃保存。
DNA/RNA calculator测定 DNA样品 A260和 A280 ,计算
DNA样品的浓度 、纯度 ,其 A260/A280比值为 1.8±0.
1 ,符合 RAPD的要求 。0.7%琼脂糖凝胶电泳检测
提取的基因组 DNA。紫外灯下观察电泳结果并拍
照 。
1.2.5　RAPD 反应 　参考Williams 方法[ 3]略有改
动 。反应体系为 25μl ,其中含模板 DNA25ng , Taq酶
1U ,dNTP 终浓度为 0.1mmol/L , 10pmol 随机引物。
扩增反应条件:94℃预变性 4min , 94℃50s , 37℃30s ,
72℃1min ,循环 40 次。然后 72℃延伸 10min。扩增
产物按常规方法 , 用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物 ,在紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。
各扩增反应重复 3次。
1.2.6　PCR扩增结果的分析　对于扩增条带的有
或无 ,强反应带记“1” ,弱反应带重复出现记“1” ,弱
反应带出现但不重复记 “0” , 没有带记“ 0” , 即得
RAPD反应的原始数据。只记录那些电泳后条带清
晰的 RAPD条带。任意两个个体间的遗传变异用遗
2833 期　　　　　　　　　　　陆一鸣等:短芒大麦耐盐碱新品系的生理生化和分子生物学分析
传距离指数(F)来衡量[ 8] 。F 由公式获得:F=2Nab/
(Na+Nb),其中 Nab为 a、b两个体共享的 RAPD条
带数 ,Na 、Nb分别为 a 、b个体的 RAPD条带数 。
2　结果与分析
2.1　短芒大麦耐盐碱新品系生理生化指标的分析
2.1.1　叶片脯氨酸含量　各突变体与野生短芒大
麦在正常及盐胁迫条件下叶片脯氨酸的含量变化见
图1 。
图 1　叶片脯氨酸含量
Fig.1　Content of proline at leaves
　　从图 1可见 , 　(1)在正常条件下(对照组),各
突变体脯氨酸含量均高于野生短芒大麦(CK),差异
极显著(P<0.01),分别是野生型的 8.85倍 、11.94
倍 、12.40倍和 12.99倍;(2)盐胁迫后 ,各材料的脯
氨酸含量均升高 ,且随着盐浓度的增加而增加 ,但增
幅均不相同;突变体盐胁迫后脯氨酸含量和增幅均
明显高于其野生品系 ,在 2.5%NaCl盐胁迫下 ,突变
体的脯氨酸含量与野生短芒大麦含量相比 ,增幅分
别为 298.93%、253.11%、248.75%、359.31%。
2.1.2　叶片电导率　各突变体与野生短芒大麦在
正常及盐胁迫条件下相对电导率的变化见图2。
从图 2可见 ,(1)在正常条件下(对照组),野生
短芒大麦的相对电导率数值明显高于突变体 ,差异
显著(P<0.05);(2)盐胁迫后 ,随NaCl浓度的升高 ,
各材料的相对电导率均增高 ,但增幅均不相同 ,突变
体的相对电导率数值和增幅均明显低于其野生短芒
大麦 ,说明盐胁迫对这 4个突变体叶片质膜损伤程
度要小。
2.2 　短芒大麦耐盐碱新品系 DNA 水平变异
(RAPD)的分析
图 2　相对电导率的变化
Fig.2　Changes of electric condutivity
用 200条随机引物对野生短芒大麦和突变体N1 、T3、
T4 、T5 进行了 RAPD分析 。经统计共有 187条引物
有扩增产物 ,占总引物数的 93.5%,共扩增出 1023
条带 ,片段大小分布在 200bp ～ 3kb之间。不同引物
扩增出的片段数量不同 ,少的 1条 、多则 12条 ,平均
每个引物可扩增出 5.47条带 ,所得结果可在一定程
度上反映基因组的差异 。有 32 条引物能扩增出多
态性 ,占引物数的 16%,其中有 14 条引物(OPA9、
OPA18 、OPH13 、OPG19 、OPJ12 、OPJ13 、OPJ15 、OPJ18、OPJ19、
OPX13 、OPX17 、OPY8 、OPY12 、OPY15)在各突变体与野
生品系之间扩增出的多态性较好并谱带较清晰(图
3 ,表 1),揭示出DNA水平的差异 ,证明了各突变体
在 DNA水平上的突变和各突变体之间的差异。
为了进一步说明野生短芒大麦及各突变体之间
的变异程度 ,对多态性进行统计分析 ,计算遗传距离
(表 1 ,表2)。结果表明 ,各突变体确实发生了突变 ,
在 DNA水平上证明了突变体 N1、T3 、T4 、T5是耐盐碱
短芒大麦新品系 ,提供了充分的分子生物学证据 。
3　讨论
许多研究表明[ 9～ 12] ,作物在逆境条件下叶片脯
氨酸含量的增加与耐盐性有关 ,胁迫引起植物体内
代谢的改变 ,引起脯氨酸累积 ,从而增加原生质在缺
水情况下的水合作用;脯氨酸还参与细胞质内的渗
透调节 ,脯氨酸含量的增加 ,能维持膨压 、保护酶和
膜系统免受毒害 ,已有资料表明脯氨酸可以作为植
物对水分胁迫或盐胁迫的一种耐性生理指标;质膜
是活细胞与环境之间的界面和屏障 ,各种不良的环
境因素对细胞的影响往往首先作用于生物膜上;实
验证明 ,低温 、高温 、干旱 、盐碱和大气污染物等的伤
284　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中　国　农　业　科　学　　　　　　　　　　　　　　　　　　35 卷
图 3　引物 OPY15 、OPJ12、OPJ13的扩增产物
Fig.3　Amplified product of the primer OPR15 , OPJ12 , OPJ13
表 1　野生短芒大麦与各突变体之间多态性统计1)
Table 1　Polymorphism of wildness and mutants
引物
Primer
碱基序列 N1 T3 T4 T5
OPA 9 5′GGGTAACGCC 3′ + +
OPA18 5′AGGTGACCGT 3′ - +
OPG19 5′GACGCCACAC 3′ + + +
OPH13 5′GTCAGGGCAA 3′ - +- +-
OPJ12 5′GTCCCGTGGT 3′ - +
OPJ13 5′CCACACTACC 3′ + + + +
OPJ15 5′TGTAGCAGGG 3′ + + +
OPJ18 5′TGGTCGCAGA 3′ - - -
OPJ19 5′GGACACCACT 3′ + -
OPX13 5′ACGGGAGCAA 3′ + + + +
OPX17 5′GACACGGACC 3′ + + + +
OPY 8 5′CCCGTTGCCT 3′ + +- +- -+
OPY12 5′ACAGGTGCGT 3′ + +- - +
OPY15 5′GGACAACGAG 3′ -+ +- -+ +-
1)　“+”代表与野生品系相比有特异扩增产物的存在 , “ -“代表与野生品系相比缺失某一扩增产物
　“+”With the peculia amplif ied product comparing wi th the original line , “ -”Without a amplified product comparing with the origined line
表 2　野生短芒大麦及各突变体之间遗传距离的分析1)
Table 2　Genetic distance of wildness and mutants
材料 A与 B
Materials A , B Na Nb Nab 遗传距离 D
CK , N1 994 1008 980 0.02598
CK , T3 994 1005 983 0.01651
CK , T4 994 1004 985 0.01401
CK , T5 994 1001 982 0.01554
N1 , T3 1008 1005 984 0.02235
N1 , T4 1008 1004 985 0.02087
N1 , T5 1008 1001 982 0.02240
T3 , T4 1005 1004 980 0.02439
T3 , T5 1005 1001 986 0.01694
T4 , T5 1004 1001 980 0.02244
1)　Na 、Nb分别为A 、B 材料的 RAPD图谱中各自显现的总带数;Nab
为材料 A与材料 B在图谱中相同的带数遗传距离 D=1-2Nab/
(Na+Nb)
　Na 、Nb refer to the tolal bands in RAPD atlas with materials A and B , re-
spectively;Hab refers to the same D in RAPD at laswith materials A and B
害都会影响质膜的结构和功能 ,从而表现出膜的透
性变大 ,因此 ,用电导率法测定质膜的透性已被广泛
应用于植物抗逆性研究之中 ,认为可以根据膜的透
性变化情况作为鉴定植物种或品种抗逆性的指标。
在本研究中突变体N1 、T3 、T4 、T5 所测定的脯氨酸和
电导率结果都表明其耐盐性强 ,因此 ,根据耐盐性的
生理生化指标判断 ,可认为这 4个突变体是耐盐碱
短芒大麦新品系 ,但尚缺乏分子生物学的直接证据。
RAPD分子标记技术由于其检测覆盖整个基因
组 ,位点多 ,不受材料和环境条件的影响而被广泛应
用于作物遗传育种的各个方面 ,能够有效地鉴别植
物不同种 、亚种 、变种 、地理类型及栽培品种 、品系乃
至单株间的差异 。如相继被用于芹菜[ 13] 、月季 、菊
花等园艺作物[ 14]以及小麦[ 15] 、水稻[ 16] 、大麦[ 17] 、大
2853 期　　　　　　　　　　　陆一鸣等:短芒大麦耐盐碱新品系的生理生化和分子生物学分析
豆[ 18]等农作物的品种鉴别 ,本研究首次利用 RAPD
技术对野生短芒大麦和各耐盐碱突变体进行了分
析 ,在 DNA水平上证明了突变体 N1 、T3 、T4 、T5 是耐
盐碱短芒大麦新品系 。通过诱变来改良作物的性状
已成为育种的主要途径之一 ,但诱变涉及基因组的
多大范围 ,很少有人了解 ,只有陈受宜等对水稻 、小
麦的有关突变体进行了分子水平的鉴定[ 19 、20] ,而对
于短芒大麦的突变体从未见报道。本研究根据农艺
性状 ,综合生理生化指标和 RAPD分析 ,证实突变体
N1 、T3 、T4、T5是耐盐碱短芒大麦新品系 ,这在短芒大
麦耐盐碱机理及遗传研究中将具有重要的理论和实
践意义。
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