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利用荧光 mRNA差异显示技术克隆短芒大麦盐胁迫相关基因的 ESTs
陆一鸣 1 ,李彦舫 2 ,白杰英 2 ,颜宏利 1 ,贺　艳 1 ,孙树汉 1*
( 1. 第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室 ,上海 200433; 2. 解放军军需大学生物学教研室 ,长春 130062)
[摘要 ]　目的:获取短芒大麦盐胁迫相关基因的 ES Ts。方法:应用荧光 mRN A差异显示技术进行筛选 ,并利用反向 Nor th-
ern杂交方法对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性。结果: 共获得 32个与盐胁迫相关的 cDNA序列 ,并获得 GenBank注册
号。 BLAST同源性分析结果表明 , 13个与已知基因序列有同源性 , 19个为未知 ESTs。其类型分别为: 诱导表达型 , 22个 ;增强
表达型 , 7个 ;抑制表达型 , 3个。结论:通过荧光 mRN A差异显示技术获得了短芒大麦盐胁迫相关基因的 ESTs,对它们的进
一步研究将为短芒大麦耐盐分子机制的发现提供思路。
[关键词 ]　荧光 mRNA差异显示技术 ;短芒大麦 ;盐胁迫相关基因 ;反向 Nor th ern杂交
[中图分类号 ]　 Q 781　　　 [文献标识码 ]　 A　　　 [文章编号 ]　 0258-879X ( 2004) 02-0203-04
Cloning ESTs of salt-stress related genes from Hordeum brevisubulatum ( Trin. ) link with fluorescence
DDRT-PCR
LU Yi-Ming1 , L I Yan-Fang2 , BA I Jie-Ying2 , YAN Hong-Li1 , HE Yan1 , SUN Shu-Han1* ( Depa r tment o f Medical Genetics,
Colleg e o f Basic Medical Sciences, Second M ilita ry Medica l Univ ersity, Shanghai 200433, China; 2. Depar tment of Bio log y ,
Qua rte rmaster Unive rsity of PLA , Changch un 130062)
[ABSTRACT ]　 Object ive: To clone ESTs of salt-st ress related genes fr om Hordeum brevisubulatum ( T rin. ) Link. Methods:
In o rder to avoid false po sitiv e r esults in m RNA differ ential-display reverse-transcription polymerase chain reaction ( DDRT-
PCR) method, w e replaced r adioactiv e reagents with fluo rescent r eagents and confirmed th e r esults with rev erse No r thern hy-
bridization. Results: Thir ty-tw o cDN As sequences r ela ted w ith salt-stress w ere r evealed, which a ll obtained accession num-
ber in GenBank. BLAST analysis r ev ealed that 13 cDN As w ere homologous with th e repo r ted genes and the o th er 19 cDNAs
w ere new ESTs. Tho se cDNAs w ere o f 3 types: 22 w ere induced expression; 7 enhanced expression and 3 depressed expres-
sion. Conclusion: Fluo rescence DDRT-PC R in this paper is im po rtant fo r studying the salt-tolerant molecular mechanism of
Hordeum brev isubulatum ( Trin) Link.
[KEY WORDS]　 fluor escence DDRT-PCR method; Hordeum brev isubulatum ( T rin. ) Link; salt-stress related genes; rev erse
Nor thern hybridization
[ Acad J Sec M il M ed Univ , 2004, 25( 2): 203-206 ]
①
　 基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的
核心机制 [1 ]。因此 ,通过比较同一类细胞在不同生理
状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异 ,可
为分析生命活动过程提供重要信息 ,这就决定了该
领域成为分子生物学的研究热点之一。 1994年 Ito
等 [2 ]建立的荧光 mRN A差异显示技术——差异显
示的逆转录聚合酶链反应 ( di fferential-display re-
verse-transcription polymerase chain reaction,
DDRT-PCR)是对原有技术加以改进而建立的一种
快速、安全、可靠、敏感并且能同时检测大量样本的
m RNA差异显示方法 [3, 4 ]。
本研究通过对盐胁迫下和非盐胁迫 (正常条件 )
的短芒大麦叶片 mRNA进行差异表达分析 ,以期获
得盐胁迫相关基因 ,为植物耐盐分子机制的研究提
供依据。
1　材料和方法
1. 1　材料处理　取短芒大麦种子 ,用 0. 1% HgCl2
表面消毒 ,用蒸馏水冲洗 ,于 37℃浸种 24 h。 27℃ ,
自来水暗培养至根长约 2 cm,转移至光下 (每天光
照 12 h)、含 Hoag land营养液中培养。苗龄 2周后 ,
用 2. 0% NaCl(用 Hoagland营养液配制 )进行胁迫
处理 , 6 d后随机剪取叶片混合贮存在 - 80℃备用。
同时对照在正常 Hoag land营养液中培养 ,方法与
取材同上。
1. 2　总 RNA的提取　采用 TRIzol ( Gibco BRL)
试剂 ,按照说明书步骤提取盐胁迫下处理短芒大麦
·203·第 二 军 医 大 学 学 报Acad J Sec Mil Med Univ　 2004 Feb; 25( 2)
① [基金项目 ]　吉林省自然科学基金资助 ( 970205-2) .
[作者简介 ]　陆一鸣 ( 1975-) ,男 (汉族 ) ,博士 ,讲师 .
E-mail: luyi@ public. cc. jl. cn
* Corresponding auth or. E-mai l: sh sun 888@ hotm ail. com
叶片与未处理对照短芒大麦叶片的总 RNA。通过琼
脂糖凝胶电泳及紫外分光光度仪测定 D260 /D280。
1. 3　样品总 RNA的逆转录反应　采用 HIERO-
GLYPH
TM
mRNA Profile Sy stem Kit ( Beckman ) ,
用 7种 逆转录 T7 ( d T12 )锚定引 物 ( ancho red
primers, AP)为 3′引物 ,进行逆转录反应 ,其序列为
(其中下划线序列为 T7启动子引物序列 ): T7 ( d T12 )
AP1, 5′-ACG ACT CAC T AT AGG GCT T TT
T T T TT T TT G A-3′; T7 ( d T12 ) AP2 , 5′-ACG ACT
CAC TAT AGG GCT T T T T TT TT T TTG C-3′;
T7 ( dT12 ) AP4 , 5′-ACG ACT CAC T AT AGG GCT
T T T TT T TT T T TG T-3′; T7 ( dT12 ) AP6 , 5′-ACG
ACT CAC TAT AGG GCT TT T TT T T TT T TC
C-3′; T7 ( d T12 ) AP7 , 5′-ACG ACT CAC TAT AGG
GCT TT T T TT T TT T TC G-3′; T7 ( dT12 ) AP10 ,
5′-ACG ACT CAC TAT AGG GCT T TT T TT
T T T TT A G-3′; T7 (d T12 ) AP11 , 5′-ACG ACT CAC
T AT AGG GCT TT T TT T T TT T TA T-3′。
反应体系 20μl: 总 RN A 2μl ( 200 ng ) , T7
(d T12 ) AP 2μl ( 4μmol /L ) ,混匀 , 70℃ 5 min,立即
放于冰上 ; Steri le nuclease-free H2O 8μl, Super-
ScriptⅡ RT Buf fer 4μl, dN TP( 250μmol /L each)
2μl, DT T 2μl, SuperScriptⅡ RT enzyme 0. 2μl。
反应条件如下: 42℃ 5 min, 50℃ 50 min, 70℃ 15
min,反应结束后 4℃保存。
1. 4　荧光 DDRT-PCR　采用 Fluoro DDRT-PCR
Kit ( Beckman) ,以 4种 M13 r-ARP为 5′端随机引物
( 10 bp,其序列为: M13 r-ARP7 , 5′-ACA A TT TCA
CAC AGG ACT GCT AGG T A-3′; M13 r-ARP8 , 5′-
ACA AT T TCA CAC AGG ATG A TG CT A
CC3′; M13 r-ARP9 , 5′-ACA A TT TCA CAC AGG
A TT TT G GCT CC-3′; M13 r-ARP10 , 5′-ACA ATT
TCA CAC AGG ATC GAT ACA GG-3′。其中下划
线序列为 M13 rev erse-48序列 ) , 7种 TMR-T7
(d T12 ) AP为 3′端引物 [荧光标记 ,序列同逆转录
T7 ( dT12 ) AP引物 ] ,进行不同引物组合 ,对得到的
cDN A产物进行 DDRT-PCR。
反应体系 10μl: RT mix 3μl, 5′ARP 1. 75μl,
3′TM R-AP 0. 7μl, dN TP (各 250μmol /L ) 2μl,
PCR Buf fer 1μl, Mg Cl2 stock solution 0. 75μl,
Steri le nuclease-free H2O 0. 7μl, Taq ( Gibco ) 0. 1
μl。反应条件: 95℃ 2 min; 94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃
90 s, 4个循环 ; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 90 s, 30
个循环 ; 72℃ 7 min; 4℃ 保存。
1. 5　 DDRT-PCR产物变性聚丙酰烯胺凝胶电泳、
荧光扫描　采用 Genomyx LRS荧光差异显示分析
系统 ( Beckman,含 Genomyx LR电泳仪 , 61 cm凝
胶板 , Genomyx SC扫描系统 ,切胶工作台及定位刻
度仪 ) ,按照操作说明进行。 5. 6%变性 HR-1000胶 ,
以电压 3 000 V和功率 100 W的条件电泳 ,时间为
4. 5 h。
1. 6　差异片段的回收、再扩增、克隆与鉴定　根据
电泳差异条带的荧光扫描及定位标记 ,分离含差异
片段的凝胶 ,分离产物重新进行 PCR扩增 ,通用引
物: T7 , M13(- 48)。纯化扩增产物 ,与 pMD18-T载体
连接 ,转化 DH5α感受态菌 ,涂布含氨苄青霉素
( Amp
+ )和 IPTG /X-gal的 LB琼脂平板上 ,置
37℃ ,培养 12～ 16 h,挑选白色菌落震荡培养 ,碱裂
解法提取质粒 ,EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切鉴定 ,挑选
含目的片段的克隆。
1. 7　阳性克隆片段的核苷酸序列测定及同源性分
析　将鉴定后的阳性重组质粒用自动核酸序列分析
仪进行测序 ,采用生物信息学软件 DNAsis软件包
对测定的核苷酸序列进行分析 ;利用 BLAST将序
列与 GenBank+ EMBL+ DDBJ+ PDB中与已知序
列进行同源性比较。
1. 8　反向 Northern杂交鉴定 DDRT-PCR阳性差
异片段　提取盐胁迫下处理短芒大麦叶片与未处理
对照短芒大麦叶片的总 RNA,进行逆转录。 采用地
高辛 ( DIG)随机引物标记与检测试剂盒 ( Roche)对
总 cDN A探针标记 [5 ]。将克隆得到的含 DDRT-PCR
差异片段质粒 2μl于尼龙膜上 (印迹 )。尼龙膜放在
Whatman 3M滤纸上 ,用 10× SSC湿润 ,在滤纸上
干燥后 , UV交联 ( 120 000μl /cm2 ) 30 s;然后用
ddH2O轻轻洗涤 ,空气干燥。 将杂交液预热至杂交
温度 68℃ ,用 30 ml杂交液在 68℃不断转动预杂交
2 h。将 DIG标记 DNA探针 50μl(用 ddH2O补足 ) ,
沸水浴 5 min,在冰浴中迅速冷却。稍离心 ,加入到
25 ml预热的杂交液中 (终质量浓度为 25 ng /m l) ,
充分混匀 ,不能形成气泡。弃去预杂交液 ,迅速加入
探针 /杂交液 2. 5 ml /cm2 , 68℃杂交 6～ 16 h,过夜。
杂交后洗涤及检测按照试剂盒说明步骤进行。
2　结　果
2. 1　总 RN A完整性　紫外分光光度计检测 D260 /
D280为 1. 8～ 2,表明为纯的 RNA。1%的琼脂糖凝胶
电泳检测 ,可以观察到 2条典型的 18S和 28S条带。
2. 2　 DDRT-PCR结果　 2组样品 RNA进行差异
显示分析 ,部分电泳图谱见图 1,获得差异表达条带
(图 1中箭头所指 )。差异表达条带有两种类型:一种
·204· 第二军医大学学报　 2004年 2月 ,第 25卷
是一种组织中有条带而相对应位置上没有条带 ,另
一种是在两相互比较的组织中均有条带出现 ,只是
条带有强弱之分。
图 1　 DDRT-PCR的电泳结果
Fig 1　 Electrophoresis of DDRT-PCR product
M: TMR-labeled DN A mark er; C: Un-t reated cont rol;
S: Sal t-s t ress; arrow s indicate dif f erent f ragments
2. 3　反向 Northern杂交确定阳性差异片段　部分
杂交结果见图 2A、 2B的探针分别来源于盐胁迫处
理样品与未处理对照样品的总 RNA。差异表达片段
杂交结果与 DDRT-PCR结果一致 ,为阳性 ;否则为
假阳性 ,对此不做进一步分析。
图 2　反向 Northern杂交结果
Fig 2　Result of reverse Northern hybridization
A: Hyb ridi zed w ith cDN A probe prepared f rom sal t-s t res s; B: Hy-
bridized w i th cDN A probe p repared f rom un-t reated cont rol; P1:
cDNA of sal t-s t ress ( posit ive cont rol) ; P2: cDN A of un-treated con-
t rol ( positi ve con trol ) ; N: pMD18-T( negative cont rol)
2. 4　差异片段测序、生物信息学分析　将阳性差异片
段测序 ,经 BLAS T同源性分析 ,结合差异显示电泳图
谱及反向 Northern杂交 ,其在差异显示中的结果共有
32个 cDN A序列 ,其类型分别为:诱导表达型 , 22个;
增强表达型 , 7个;抑制表达型 , 3个 (表 1)。
表 1　 DDRT-PCR得到的差异片段
Tab 1　 Dif ferent fragments of DDRT-PCR
Frag men t
( si ze, bp)
Prim er
s et s
Sal t-
st ress
Cont rol
GenBank
accession
No.
HDL1 ( 547) AP11+ ARP7 + - CB556174
HDL2 ( 440) AP11+ ARP7 + - CB548522
HDL3 ( 681) AP11+ ARP9 + CB556175
HDL4 ( 476) AP11+ ARP8 + - CB518141
HDL5 ( 423) AP11+ ARP8 ± - CB548526
HDL6 ( 404) AP11+ ARP9 + - CB518152
HDL7 ( 646) AP11+ ARP10 + ± CB518144
HDL8 ( 591) AP11+ ARP10 ± - CB518153
HDL9 ( 473) AP11+ ARP10 ± - CB518145
HDL10 ( 420) AP10+ ARP8 + ± CB518146
HDL11 ( 403) AP4+ ARP8 ± - CB556176
HDL12 ( 424) AP1+ ARP8 ± + CB556177
HDL13 ( 347) AP1+ ARP9 + - CB518147
HDL14 ( 486) AP4+ ARP9 ± + CB518159
HDL15 ( 401) AP4+ ARP10 ± - CB518154
HDL16 ( 477) AP2+ ARP7 ± - CB548523
HDL17 ( 237) AP2+ ARP7 ± - CB548524
HDL18 ( 243) AP2+ ARP8 + - CB556179
HDL19 ( 614) AP6+ ARP7 ± + CB518142
HDL20 ( 473) AP7+ ARP7 ± CB556178
HDL21 ( 329) AP6+ ARP7 + ± CB518148
HDL22 ( 334) AP6+ ARP8 ± CB518149
HDL23 ( 259) AP6+ ARP8 ± CB518155
HDL24 ( 244) AP6+ ARP8 ± - CB518156
HDL25 ( 215) AP6+ ARP8 ± - CB556180
HDL26 ( 443) AP6+ ARP10 + - CB518150
HDL27 ( 232) AP7+ ARP7 + - CB518157
HDL28 ( 265) AP7+ ARP8 + - CB518151
HDL29 ( 213) AP7+ ARP8 ± - CB518158
HDL30 ( 334) AP7+ ARP10 + - CB548525
HDL31 ( 265) AP7+ ARP10 + - CB518143
HDL32 ( 220) AP7+ ARP10 + - CB548527
　+ , : Posi tive sig nal; ±: Weak signal; - : No sig nal
3　讨　论
DDRT-PCR自 1992年由 Liang等 [1 ]创建以
来 ,大量的实验结果表明 , DDRT-PCR对很多参数
都较为敏感。因此 , DDRT-PCR的反应条件必须仔
细设计 ,对其各个环节 ,诸如引物设计、 PCR条件的
优化、凝胶的选择以及不同的检测方法等方面做改
进 [6～ 9 ] ,且要经过必要的预实验加以确定 ,同时应保
证每次实验条件一致。本研究应用荧光 mRNA差异
显示技术 ,在实验过程中采用了 Bechman公司开发
出的 Genomyx LRTM mRNA差异显示系统及
Genomyx SC
TM荧光图像扫描系统 ,并应用其配套的
Fluo roDD and HIEROGLY PH mRNA Profile Ki t,
优化了 DDRT-PCR实验过程中的各个环节 ,得到
了稳定、可靠的实验结果 ,且使实验时间缩短至 2 d
内完成 ,同时避免了核素的污染及切割条带的盲目
性。植物的耐盐特性既受个体发育的生理、生化条件
环境变化所制约 ,同时也受系统发育的遗传基因所
·205·第 2期 . 陆一鸣 ,等 .利用荧光 mRNA差异显示技术克隆短芒大麦盐胁迫相关基因的 ESTs
控制。 近 10多年来 ,很多研究者从遗传的分子机制
上探讨植物的耐盐特性 ,并相继在很多作物中克隆
了与耐盐性有关的结构基因 ,对耐盐基因的表达特
性及染色体定位、通过转基因技术提高植物耐盐特
性也有初步的工作报道 ,但迄今为止还没有得到真
正耐盐植物 ,说明对于植物耐盐分子机制的研究还
相对滞后。 mRNA差别显示技术的建立为研究耐盐
基因在不同组织、不同器官、不同环境条件及不同发
育时期的差异表达提供了可能 ,为植物耐盐分子机
制研究提供了很多有价值的实验结果 ,如黑麦、水稻
等等 [10, 11 ]。
本研究利用荧光差异显示技术来分析盐胁迫及
非盐胁迫 (正常条件 )短芒大麦叶片之间的差异 ,从
而在分子水平上为耐盐机制的研究提供了一些实验
依据。但获得耐盐相关基因的 cDN A片段只是研究
植物耐盐分子机制这一项重大科研工作的小小开
端。 下一步的工作需要克隆耐盐相关基因的全长
cDN A以及全基因、进行基因结构与功能的研究、通
过转基因技术研究基因产物的功能 ,并将其用于生
产实践中。后续研究内容及设想包括:耐盐相关基因
的 cDN A全长的获得有待于相应盐胁迫下短芒大
麦的 cDN A文库筛选 ,也可利用 cDN A末端快速扩
增 ( rapid amplification o f cDN A ends, RACE)技术
获得该差异片段的 cDN A全长 ;对基因组文库进行
筛选 ,以获得全基因 ,并研究其功能 ;用获得的耐盐
基因进行转基因研究等。
[参 考 文 献 ]
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[收稿日期 ]　 2003-11-03　　 [修回日期 ]　 2003-12-15
[本文编辑 ]　尹　茶
(上接第 199页 )
网膜未发生病变 ,可能属于早期轴性视神经炎表现 ,治疗效
果较好。 因此 ,对于 EMB引起的毒性视神经炎应早发现、早
诊断、早治疗 ,以免发展到晚期出现不可逆的视神经萎缩。有
报道异烟肼也能造成中毒性视神经炎 [1 ]。异烟肼是最安全而
有效的抗结核药 ,其毒副反应主要有外周神经、肝脏毒性反
应等 ,极少引起视神经毒性反应。 有研究者曾提出对于血浆
肌酐质量浓度低于 120 mg / L( 1. 1 mmo l / L)者 ,每日给予 300
mg异烟肼仍安全 [2]。 而本例患者的血浆肌酐浓度是
0. 98 mmo l /L。但是 ,当异烟肼与 EM B联合应用会加强 EM B
对视神经的损害。因此 ,我们认为本例患者是由于肾功能衰竭
使 EM B在体内积蓄所致 ,异烟肼只是加强 EM B对视神经的
损害 ,并没有直接引起视神经炎。 在遇到异烟肼和 EM B联合
用药引起的中毒性视神经炎时 ,两者都应当停用。国外有文献
报道 [3] ,使用 EM B作为治疗结核的一线药时 ,并没有所谓的
安全剂量 ,中毒性视神经炎的发病率主要与年龄有关 , 60岁以
上年龄组的发病率明显高于 60岁以下年龄组的患者。
EM B引起的毒性视神经炎具有相当的隐蔽性 ,有时容
易漏诊。由于本病引起的视神经损害与其他原因的视神经损
害相似 ,单从眼科检查无法区别 ,如果不结合服药史很可能
出现漏诊误诊。因此 ,对于视神经炎患者 ,详细询问患者伴随
的非眼科病史和服药情况非常重要 ,否则会延误病情。
[参 考 文 献 ]
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[收稿日期 ]　 2003-07-14　　 [修回日期 ]　 2003-11-26
[本文编辑 ]　邓晓群
·206· 第二军医大学学报　 2004年 2月 ,第 25卷