全 文 ：四川畜牧兽医·2009·06期·总第 224期
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2.3 70 d 平均日增重 试验组
平均日增重 1 081 g，极显著（t=
12.23＞t0.01（18）＝2.878）高于对照组
（807 g）33.95％，详见表 2。
2.4 料肉比 按照日采食干物
质计算，试验组为 5.8，极显著低
于对照组（7.8），详见表 2。
2.5 经济效益 试验期 70 d
内，试验组较对照组头均多增加
饲料成本 28 元，但增加体重
19.6 kg，折算人民币 156.8元，增
加纯收入 128.8元（见表 3）。
3 小结与讨论
3.1 全株青贮玉米的营养浓度
高，饲喂 10月龄肉牛 70 d，平均
日增重达 1 081 g，比对照组高
33.95%。肉牛增重快，能大幅度
缩短育肥期，是育肥优质肉牛必
不可少的饲料。
3.2 全株青贮玉米饲喂肉牛的
料肉比为 5.8，饲喂 70 d后，较
对照组增加纯收入 128.8元，经
济效益十分显著。推广全株青贮
玉米育肥肉牛可以节省种植和
养殖劳动力，实现饲料均衡供
应，特别利于规模化、集约化、标
准化饲养，即产业化饲养。
3.3 种植青贮玉米，与多花黑
麦草轮作，能够充分利用土地资
源，有效进行时空配置，实现高
效草地农业系统的协调发展。
3.4 用全株青贮玉米育肥肉牛
是当前农民增收的有效途径之
一。
3.5 本试验因青贮料数量有
限，仅进行了 70 d的饲喂试验，
而全程育肥试验有待今后进一
步研究。 ■
参考文献（略）
生长于四川西北部高原沙
地的赖草极具特色，不仅生命
力强能适应高原气候，而且具
有抗旱、抗寒、耐盐碱、抗病虫
害等优良特性，在当地被用作
首选牧草来治理高寒地区的草
原沙化问题，是当地生态建设、
植被恢复十分重要的生态草
种。本文从分子生物学的角度
对赖草的抗旱机制进行研究，
以便搞清楚赖草抗旱的基本原
理，从而为进一步的品种改良
和运用现代育种技术培育具有
优良抗旱能力同时又能适应青
藏高原生态环境的优良牧草打
下基础。
1 试验材料
1.1 试验材料及其培养 赖草
植株采自地处四川省西北部高
原的阿坝州红原县瓦切乡，土壤
主要为亚高山草甸土，草地类型
为亚高山草甸。样品培养于珠江
牌人工气候箱中（型号：LRH-
800-GS），并从光照、温度、湿度
等条件来模拟高原气候特点，采
用原产地的沙土进行盆栽培养。
2 方法
2.1 供试材料的处理 利用
三种常见干旱诱导方法进行
中图分类号：S812.6 文献标识码：B 文章编号：1001-8964（2009）06-0029-03
叶煜辉 1，陈 艳 1，杨满业 2，江明锋 1
（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.四川省草原研究院，四川 成都 610041）
摘要：利用根际水分胁迫、脱落酸（ABA）和聚乙二醇（PEG）三种不同诱导方式，从干旱胁迫
前后的赖草叶组织中提取 RNA，通过 RT-PCR 方法获得单一片段，PCR 产物经胶回收直接测序。
测序结果表明，所得到的赖草 EST 序列长 207bp，其编码的 60 个氨基酸与多种植物 Fe-SOD 氨
基酸序列的同源性达到 60%以上。
关键词：赖草；干旱胁迫；铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）
收稿日期：2009-03-17
作者简介：叶煜辉（1982-），男，硕士，
主要从事分子生物学与基因工程方面
的研究。 E-mail：2552393yyh@163.com
赖草 序列的克隆及分析
试
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处理，包括：普通干旱诱导；脱
落酸（ABA）诱导；聚乙二醇
（PEG6000）干旱诱导。由于赖草
种子结实率低，基本为根生植
物，所以难以通过种子同期萌发
并设置对照组来进行干旱诱导。
水分胁迫：将培养于人工气
候箱中的幼嫩赖草植株取出，在
空气相对湿度保持在 40%～60%
的情况下采用根际水分胁迫，连
续胁迫 5 d后，提取胁迫前后的
叶组织 RNA；ABA诱导：用配制
成 0.1mmol/L的 ABA浇灌幼苗，
继续生长 24h，诱导 LEA基因的
表达，诱导生长 24 h，提取诱导
前后的叶组织 RNA；PEG诱导：
用高浓度 PEG6000 300 g/L 来
处理幼苗，观察叶片，大约诱导
生长 24 h 后出现褐化或萎缩，
提取诱导前后的叶组织 RNA。
2.2 引物设计 引物设计根据
大麦 HVA1 基因 Genbank 登录
号（X∶78205）与东北农业大学马
媛媛等人已克隆到的羊草
HVA1 基因部分序列的比对结
果，在保守区设计引物一对。上
游引物 Hva1-part1f：5′-GAGAA
GACCGGGCAGATGATG -3′；
下游引物 Hva1 -part2R：5′ -
CTGCCGGTCTGGTCCTTGC-3′，
由成都金杰生物技术公司负责
合成。
2.3 总 RNA 提取 经诱导的
赖草用 DEPC 处理水反复冲洗
叶片，用灭菌滤纸吸去表面水
滴。称取赖草叶组织约 0.6 g采
用 Trizol法提取总 RNA，具体操
作如下：用 DEPC水浸泡处理过
的剪刀将叶片剪碎后置于-20℃
预冷的研钵中，倒入液氮并按每
100mg/mL的量加入 1mL Trizol
Reagent，在研钵中研磨至粉状，
于室温下静置 5min待其完全融
化；将液体移入 2.5mL EP管中，
每管 1mL，然后加入 1/5 Trizol
体积的氯仿，混匀，室温下静置
5 min；12 000 g 4℃离心 10 min，
将上层清液转移至新的 EP 管
中，并加入与上清液等体积的异
丙醇，室温静置 10min；12000 g
4℃离心 10min，弃上清，向沉淀
中加入 1mL的 75%乙醇，混匀；
再次 12 000 g 4℃离心 5min，弃
上清保留沉淀，干燥 2～3 min
后，加入适量的 RNA-Free水进
行溶解，并取 0.5μL作电泳检测
（结果见图 1）。
2.4 SMART 技术反转录合成
cDNA SMART 技术是近年来
较为常见的合成全长 cDNA的一
种方法，该技术有诸多优点，利于
获得全长 cDNA。本实验的
SMART试剂盒购自 clonetech公
司，按试剂盒说明书进行操作。
首先合成 ss-cDNA，操作
如下：在处理过的 0.2 mL PCR
管中加 3 μL总 RNA（约 1 μg），
1 μL CDS Primer，1 μL Smart
Ⅱ A Oligonucleotide primer，
混合后短暂离心，70 ℃温育
2 min 后冰浴 2 min，短暂离
心；继续加入 1 μL DTT，1 μL
dNTP，2 μL 5 ×f i rs t -strand
buffer，1 μL BD PowerScript
Reverse Transcriptase；混匀，短
暂离心后于 42℃温育 1 h，最后
在冰浴中终止反应。单链产物
于-20℃下冻存。
第二步合成 ds-cDNA，操作
如下：在 PCR反应体系（50 μL）
中 加 入 5 μL ss -DNA，1 μL
dNTP，1 μL Smart PCR primer，5
μL 10 ×BD Advantage 2 PCR
buffer，1μL 50×BD Advantage 2
Polymerase Mix，37 μL ddH2O，
混匀后短暂离心。PCR 反应参
数为：95℃ 1min；95℃ 30s，65℃
30 s，68 ℃ 4 min，共 26 个循
环；68 ℃ 6 min。
2.5 Fe-SOD基因片段的扩增
PCR 反应体系（25 μL）操作如
下：2 μL 10×buffer，2 μL MgCl2，
1μL dNTP，1μL HVA1-part1f，
1μL HVA1-part2R，2μL cDNA，
0.3 μL r -Taq，15.7 μL ddH2O。
反应参数为：94 ℃ 2 min；94 ℃
1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，
共 30个循环；72℃ 5min。反应
结束后取 5 μL PCR产物用 1%
琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收、
测序。
2.6 Fe-SOD 基因在三种诱导
方式前后的扩增 利用上述设
计好的引物对水分胁迫前后、
ABA 诱导前后、PEG 诱导前后
不同诱导状态下的赖草样品进
行 PCR扩增。
3 结果与分析
3.1 总 RNA提取结果 由赖草
RNA 提取结果可见，28SRNA、
18SRNA 较亮（见图 1），说明
RNA降解不严重可以满足实验
需要。
3.2 Fe -SOD 片段扩增 以
HVA1 为模板设计的引物在赖
草干旱诱导 5 d 后的样品中扩
增出了一条大约 550bp 的单一
条带（见图 2）。
3.3 测序结果及分析 由于
PCR 产物胶回收后未经 TA 克
隆而是直接测序，所以序列实
测 207bp 比电泳时显示的序列
要短，利用 DNAMAN 软件进行
翻译后见图 3。通过 NCBI
BLAST-X 发现该序列编码的
5S
18S
28S
图 1 提取的总 RNA电泳图谱
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60个氨基酸等电点 pI为 9.08，
并且与多种植物的 Fe-SOD 氨
基酸序列的同源性达到 60%以
上。
3.4 Fe-SOD 基因在三种诱导
方式前后的扩增 Fe-SOD基因
在干旱胁迫条件下的表达量明
显高于正常状态下该基因的表
达量（见图 4），说明三种诱导方
式对赖草样品都起到了干旱胁
迫作用，导致赖草体内抗旱相关
基因的高表达。
3.5 不同植物间 Fe-SOD 的进
化分析 通过 NCBI BLAST-X
发现与赖草 Fe-SOD 同源性较
高的序列有很多，其中包括紫苜
蓿、豌豆、辣椒、莴苣属、柑橘以
及马铃薯等 6种不同植物。它们
的 Fe-SOD 部分氨基酸序列与
本研究中推断出的赖草 Fe-SOD
氨基酸部分序列的同源性分别
为 69%、69%、68%、67%、64%和
63%；通过 DNAMAN软件构建
进化树（见图 5）得知，赖草 Fe-
SOD与豌豆、紫苜蓿的 Fe-SOD
从进化上讲亲缘关系相对较近。
4 讨论及结论
4.1 植物抗旱基因工程具有
巨大的应用潜力，因此，对抗旱
相关基因的克隆引起了人们极
大的兴趣。目前，已经克隆到许
多与抗旱相关的基因。赖草作
为一种抗旱能力较强的植物受
到了研究者的重视，近年来大
量的研究人员对赖草属内植物
进行了细胞分子水平的研究，
取得了一定的成果。但有关克
隆到赖草属植物的抗逆基因的
报道相对较少，克隆到赖草属
植物与抗旱有关的基因片段的
报道更少。研究的滞后，给赖草
属内很多植物作为一种优质种
质资源的利用带来了很大的局
限。
4.2 本研究针对四川省西北部
高原地区沙生赖草耐旱性强的
特点，采用一般干旱诱导、ABA
诱导、PEG诱导三种不同方法来
诱导赖草抗旱相关基因的高表
达，以获得赖草抗旱相关基因。
实验结果表明，所得到的赖草的
EST序列大小为 207bp，该序列
编码的氨基酸序列中有 60个氨
基酸与诸多植物的 Fe-SOD 在
氨基酸序列上的一致性超过
60%，可以认定此片段功能与
Fe-SOD相似。Fe-SOD在植物
体内起抗氧化作用，在植物受干
旱胁迫时能够增强植物的抗旱
能力。
SOD 是一种含金属的抗氧
化酶，根据 SOD所结合的金属
原子不同，植物 SOD可分为三
种类型：Mn -SOD、Cu/Zn -SOD
和 Fe-SOD。Cu/Zn-SOD主要位
于细胞质和叶绿体中，Mn-SOD
主要位于线粒体中，Fe-SOD 一
般位于一些植物的叶绿体中。
本实验以赖草叶组织为样品来
提取 RNA，进行反转录获得
cDNA，并以此为模板进行 PCR
扩增，所得结果为赖草 Fe-SOD
EST序列，由此也证明了 Fe-SOD
存在于叶绿体中。通过构建进化
树我们还发现，赖草的 Fe-SOD
与豌豆和紫苜蓿的 Fe-SOD 的
亲缘关系相对较近。
本研究获得的赖草 Fe -
SOD的 EST片段为进一步运用
RACE 技术等方法克隆赖草中
Fe-SOD 全长基因提供了有效
参考，也为利用荧光定量技术
检测三种不同诱导方法下赖草
干旱胁迫前后抗旱相关基因表
达量的差异奠定了基础。 ■
参考文献（略）
CAGGGCAGGCTAGCCACCCCACGCCCCCTTCTTTCATGCCGCACAGGTATGGAACCATGA
TTTCTATTGGCGATCAATGAAACCTGGCGGTGGAGGCAAGCCCCCGGAACGGCTTCTAAA
GTTTATAAACAGAGACTTCGGATCCTATGACGGCATGATCAAACAATTCATGGATGCTGC
ACTAACTCAGTTCGGTTCTGGATGGGT
R A G * P P H A P F F H A A Q V W N H D
F Y W R S M K P G G G G K P P E W L L K
F I N R D F G S Y D G M I K Q F M D A A
L T Q F G S G W
181
61
121
41
61
21
1
1
图 3 赖草 Fe-SOD序列的测序结果及其对应的氨基酸序列
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