全 文 ：• 2191 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年6月第30卷第6期 CJTCMP , June 2015, Vol . 30, No. 6
·研究报告·
应用Box-Behnken设计优化毛蕊铁线莲的
超声提取工艺
郝宁1，韩宇2，路畅1，朴钟云1
（1沈阳农业大学，沈阳 110866；2辽宁中医药大学，沈阳 110032）
摘要：目的：采用Box-Behnken设计方法，研究了毛蕊铁线莲（lasiandra）总皂苷的超声提取工艺。方法：采
用超声提取法，以乙醇体积分数、料液比和超声时间为主要影响因子，以总皂苷含量为评价指标进行Box-Behnken
试验设计，考察最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺为23倍量72%的乙醇，提取3次，每次提取54min。结论：
Box-Behnken设计结合响应面分析法可以很好地对毛蕊铁线莲总皂苷提取工艺进行优化。
关键词：毛蕊铁线莲；Box-Behnken设计；响应面；总皂苷；超声提取
Optimization of ultrasonic extraction of clematis lasiandra by Box-Behnken design
HAO Ning1, HAN Yu2, LU Chang1, PIAO Zhong-yun1
( 1Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2Liaoning University of
Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China )
Abstract: Objective: Box-Behnken design was used to optimize the extraction technology of total saponins from
Clematis lasiandra. Methods: Ethanol concentration, solvent-solid and extraction time were selected as influencing factors during
extraction. The experiment which was based on concentrations of total saponins mathematical model was arranged according to
Box-Behnken central composite experimental design. Results: The best extraction technology was to extract for three times with
23 fold ethanol solution (72%), and 54min each time. Conclusion: The combination of Box-Behnken design and response surface
analysis can well optimize the extraction technology of total saponin from clematis lasiandra.
Key words: Clematis lasiandra; Box-Behnken design; Response surface method; Saponin; Ultrasonic extraction
通讯作者：朴钟云，沈阳市东陵路120号沈阳农业大学园艺学院，邮编：110866，电话：024-88487143，Email：zypiaosau@163.com
毛 蕊铁 线 莲 为毛茛 科 铁 线 莲 属药用 植物毛 蕊铁 线 莲
Clematis lasiandra Maxim.的干燥根及根茎。广泛分布于我国
云南、四川和甘肃等省区，是我国铁线莲属分布最广的种类
之一[1]。具有舒筋活络、清热利尿、祛湿止痛的功效[2]。主要含
有皂苷类和黄酮类成分，Xiangrong Tiana等从毛蕊铁线莲中分
离得到三萜皂苷类化合物具有显著的抗肿瘤活性[3-4]。本课题
组前期研究发现供试毛蕊铁线莲样品总皂苷含量为20.68mg/g
高于东北铁线莲6.45mg/g，具有良好的开发应用前景，查阅文
献未见关于毛蕊铁线莲提取工艺方面的报道。
响应面法（response surface methodology，RSM）是利用合理
的试验设计方法并通过试验得到一定组数数据，采用多元二次
回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方
程的分析来寻求最优工艺参数。该方法能够对因子水平及其交
互作用进行优化和评价，并可运用图形技术将这种函数关系直
观显示出来，具有试验次数少、周期短、精度高等优点，是一种
理想的试验优化方法[5-6]。
本试验以乙醇体积分数、料液比和提取时间3个因素为影
响因子，采用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型，以总皂
苷含量作为响应值，利用JMP和SAS软件进行数据分析，对毛蕊
铁线莲的超声提取工艺进行优化，旨在为毛蕊铁线莲的进一步
开发和综合利用提供科学依据。
材料
毛蕊铁线莲购于沈阳药店。经鉴定为毛茛科植物毛蕊铁
线莲Clematis lasiandra Maxim.的根和根茎。齐墩果酸对照品
（中国药品生物制品检定所，批号：110709-200505），其他试
剂均为分析纯。紫外可见分光光度计（754型，上海光谱仪器有
限公司）。
方法
1. 总皂苷测定方法的建立
1.1 标准曲线制备 精密称取齐墩果酸对照品适量，加甲醇
配成0.16mg/mL的溶液。精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、
1.0、1.2mL，分置量瓶中，沸水浴中挥干，依次加入新鲜配制的
5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL混匀，密塞，于60℃
水浴中加热20min，取出，冰水浴中冷却2min，加冰醋酸5mL，
拼版3.indd 2191 2015-5-28 12:53:07
• 2192 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年6月第30卷第6期 CJTCMP , June 2015, Vol . 30, No. 6
混匀。紫外-可见分光光度计540nm处测定吸光度。以含量（C）
与吸光度（A）进行直线回归，得回归方程A=10.574C-0.0145
（R2=0.9997），表明浓度在0.032-0.192mg/mL范围内，线性关系
良好[7]。标准曲线见图1。
A C
R      
图1 标准曲线图
1.2 供试品溶液制备 分别精密称取毛蕊铁线莲粉末
2.00g，置锥形瓶中，精密加入适量溶剂，超声提取一定时间，过
滤，用少量溶剂淋洗药渣，水浴蒸干得浸膏，用20mL水转移出
残留物，用同体积水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇提取液，
用正丁醇饱和水洗涤3次，每次10mL，洗液弃去，正丁醇层水
浴蒸干，加适量溶剂，超声助溶，定容于100mL容量瓶中，精密
吸取溶液0.2mL，按“1.1”项下处理，测定吸光度，计算总皂苷
的量[8]。
1.3 精密度试验 精密吸取供试品溶液1mL，按“1.1”项下
处理，测定结果并计算RSD（n=6）为0.75%。
1.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“1.1”项下处理，
测定其在不同时间吸光度，结果表明，吸光度值在0-60min
基本不变，RSD（n=6）为0.86%，因此测定应控制在60min内
完成。
1.5 重现性试验 称取同一批样品粉末，按“1.2”项下处
理，测定结果并计算RSD（n=6）为1.10%。
1.6 回收率试验 取已知总皂苷量的样品1g，加入0.16mg/mL
的齐墩果酸对照品溶液适量，按“1.2”项下处理，测定结果并计
算平均回收率为97.90%，RSD（n=6）为0.73%。
2. Box-behnken设计优化提取工艺 本试验根据Box-
behnken的中心组合设计原理，采用响应面法对毛蕊铁线莲的
总皂苷提取工艺进行优化。
结果
1. Box-Behnken试验因素水平及结果 本试验采用JMP软
件进行Box-behnken试验设计，综合前期的预试验结果及相关
文献报道[9-12]，选取主效影响因素乙醇体积分数（X1）、料液比
（X2）、超声时间（X3）为自变量，总皂苷含量（Y）为响应值，进
行响应面分析试验。因素水平和编码见表1。Box-behnken设计
编码和试验结果见表2。
2. 二次回归模型拟合及方差分析 根据表2中试验结果，
利用JMP软件对其结果进行二次回归分析，回归方程为：Y=1.37+
0.14X1+0.048X2+0.062X3+0.010X1X2+0.008X1X3+0.004X2X3-
0.320X1
2-0.077X2
2-0.10X 23（R
2=0.9829）。
表1 Box-Behnken试验因素水平
因素
水平
-1 0 1
乙醇体积分数X1（%） 60 70 80
料液比X2 1∶10 1∶20 1∶30
超声时间X3（min） 40 50 60
表2 Box-Behnken设计及试验结果
试验编码
乙醇体积分数
X1（%）
料液比
X2
超声时间
X3（min）
总皂苷提取率
Y（mg/g）
1 -1 -1 0 16.98
2 1 0 -1 18.31
3 1 1 0 19.73
4 -1 0 1 17.18
5 -1 0 -1 16.61
6 0 1 1 20.56
7 0 0 0 21.05
8 0 1 -1 19.15
9 -1 1 0 17.44
10 0 -1 1 20.35
11 0 -1 -1 18.51
12 0 0 0 21.09
13 1 -1 0 18.00
14 0 0 0 21.03
15 1 0 1 19.36
回归方程的方差分析结果见表3。结果显示，模型相关系数
（R2）为0.9829，纯误差较小，说明该方程模型拟合度非常好，
模型预测值与实测值之间具有高度的相关性，可靠性高。
表3 回归方程方差分析
方差来源 平方和 自由度 F值 Prob>F
X1 0.1513 1 54.9035 0.0007
*
X2 0.0181 1 6.5521 0.0507
X3 0.0303 1 10.9836 0.0211
*
X1X2 0.0004 1 0.1380 0.7255
X1X3 0.0003 1 0.0988 0.7659
X2X3 0.0001 1 0.0262 0.8777
X1
2 0.3774 1 136.9968 <0.0001*
X2
2 0.0217 1 7.8866 0.0376*
X3
2 0.0374 1 13.5936 0.0142*
模型 34.2777 9 31.9625 0.0007*
失拟合 0.5942 3 250.9369 0.0040*
纯误差 0.0016 2
总和 0.5958 5
注：*表示P<0.05。
拼版3.indd 2192 2015-5-28 12:53:09
• 2193 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年6月第30卷第6期 CJTCMP , June 2015, Vol . 30, No. 6
由各因素方差分析结果可知，X1和X3对提取率有显著影
响，各因素对总皂苷提取率的影响按大小排序依次为乙醇体积
分数、超声时间、料液比。二次项X1
2、X2
2和X3
2影响显著，交互
项X1X2影响不显著，其他交互作用微弱
[13-14]。
3. 响应面分析及最佳提取工艺条件的确定 利用JMP软件
绘制提取率响应面立体分析图和等高线图见图2-图4。各个因
素及其相互作用都可以从图中直接分辨出[15-16]。图2显示了超声
时间位于最佳值时，乙醇体积分数和料液比之间的协同作用，
图3显示了料液比位于最佳值时，乙醇体积分数和超声时间的
协同作用，图4显示了乙醇体积分数位于最佳值时，料液比和超
声时间的协同作用。3个参试因素之间具有相互作用，并存在最
佳效应，即响应面鞍点值。> >
> >
图2 Y=f（X1、X2）响应面立体分析图和相应等高线图> >
> >
图3 Y=f（X1、X3）响应面立体分析图和相应等高线图> >
> >
图4 Y=f（X2、X3）响应面立体分析图和相应等高线图
利用SAS软件，通过岭嵴分析得到响应极大值所对应的各
主要因素（X1、X2、X3）的编码值分别为0.209464，0.293745，
0.346177，即乙醇体积分数为72.1%、料液比为1∶22.9、超声时
间53.5min，此时提取率最大，为21.33mg/g。
4. 验证试验 为了验证回归模型的可靠性，根据推断的最
佳工艺参数进行验证试验[17-19]。在验证试验中，考虑到操作可
行性，将工艺参数修正为乙醇体积分数72%，料液比1∶23，超
声时间54min，根据模型计算出提取率为21.33mg/g，以此条件
进行3组验证试验，结果实测平均值为20.684mg/g，与模型值
非常接近，说明该模型比较可靠，故最佳提取工艺为23倍量乙
醇，乙醇体积分数为72%，提取时间54min。
5. 提取次数考察 根据试验得出的最佳工艺条件，进行
提取次数考察，毛蕊铁线莲分别选择提取1、2、3、4、5次，每次
54min，72%乙醇，料液比为1∶23，结果见图5。在提取3次时，总
皂苷提取率较高，随着提取次数的增多，提取率增加无显著性
差异，因此选择提取3次为宜。     
图5 提取次数对毛蕊铁线莲总皂苷提取效果的影响
提
取
率
（
%
）
讨论
本研究首次对毛蕊铁线莲超声提取工艺进行优化。利用
Box-Behnken设计和JMP、SAS软件分析确定出主效因子的最优
水平，得到最佳超声提取工艺为：72%的乙醇，料液比1∶23，提
取3次，每次提取时间54min。
Box-Behnken设计用于研究多因子系统中因子交互作用达
到最大响应值时所对应的最佳条件，其充分考虑到各因素的交
互作用，采用非线性模型拟合，可信度好，不但可优化出最佳工
艺，而且可以对提取率进行预测，其数据处理更加简便、科学。
同时克服了正交设计只能处理离散水平值，而无法找出整个区
域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷。本试验回归方
程预测值与验证试验实测值非常接近，说明回归方程能较真实
地反映各筛选因素的影响，建立的模型与实际情况是比较吻合
的，因此利用响应面法优化毛蕊铁线莲总皂苷的提取工艺是有
效可行的。
参 考 文 献
[1] 中国科学院《中国植物志》编委会.中国植物志.28卷.北京:
科学出版社,1980:112
[2] 江苏新医学院.中药大辞典.上海:上海科技出版社,1986:1632
[3] Xiangrong Tiana,Juntao Fenga,Haifeng Tang,et al.New cytotoxic
triterpenoid saponins from the whole plant of Clematis lasiandra
Maxim.Fitoterapia,2013,90(10):233-239
[4] 冯玲枫,翁美娅,田富饶,等.11种铁线莲属药用植物地上部分
总黄酮含量比较研究.中国现代中药,2011,7(13):14-18
[5] 郝学财,余晓斌,刘志钰,等.响应面方法在优化微生物培养基
中的应用.食品研究与开发,2006,27(1):38-41
[6] 曹小红,蔡萍,李凡,等.利用响应面法优化Bacillus natto TK-1产
脂肽发酵培养基.中国生物工程杂志,2007,27(4):59-65
[7] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京:中国医药科技
拼版3.indd 2193 2015-5-28 12:53:12
• 2194 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年6月第30卷第6期 CJTCMP , June 2015, Vol . 30, No. 6
出版社,2010:附录ⅤA
[8] 李海燕,郝宁,许永男,等.朝鲜白头翁总皂苷提取工艺的优化.
中药材,2010,33(4):617-620
[9] Rufeng Wang,Ping Chen,Fang Jia,et al.Optimization of
polysaccharides from Panax japonicus C.A. Meyerby RSM and its anti-
oxidant activity.International Journal of Biological Macromolecules,
2012,50(3):331-336
[10] Qian Xu,Yanyan Shen,Haifeng Wang,et al.Application of response
surface methodology to optimize extraction of flavonoids from
fructus sophorae.Food Chemistry,2013,138(3):2122-2129
[11] 苏柘僮,刘英,徐佳丽,等.应用Box-Behnken设计优化地榆皂苷
的闪式提取工艺研究.中草药,2012,43(3):501-504
[12] 孟宪军,李斌,李元甦,等.响应面法优化微波辅助提取北五味
子总三萜工艺.食品与生物技术学报,2011,30(1):20-24
[13] 陈学智,谢志军,温成平,等.中心组合设计优化小香勾总黄酮
提取工艺研究.中华中医药杂志,2013,28(4):1122-1124
[14] 马瑞丽,张蓉,徐秀泉,等.响应面分析法优化大血藤中总酚的
超声提取工艺.中成药,2012,35(2):404-407
[15] 李斌,孟宪军,李元甦,等.响应面法优化超临界CO
2
萃取北五
味子藤茎油工艺.食品科学,2010,31(20):132-136
[16] 夏道宗,于新芬,王慧铭,等.麦冬总黄酮提取的响应面法优化
及抗氧化性研究.中华中医药杂志,2009,24(12):1629-1632
[17] 李石清,张春椿,徐磊,等.响应面分析南方红豆杉枝条多糖
超声提取工艺及其抗氧化作用研究.中华中医药杂志,2013,
28(10):2942-2946
[18] 高义霞,景红艳,姜祖君,等.响应面分析法优化乳苣总黄酮提
取工艺的研究.中药材,2010,33(4):621-624
[19] 卢时勇,钱俊青,邹小明,响应面法优化超声提取白术有效成
分的研究.中国中药杂志,2006,31(7):549-552
（收稿日期：2014年3月19日）
非创伤性股骨头坏死中医体质类型与亚甲基四氢叶酸
还原酶C677T位点多态性的相关性研究
李盛华1，周明旺1，郭铁峰2，王晓萍1，孙凤岐2，穆欢喜2
（1甘肃省中医院，兰州 730050，2甘肃中医学院，兰州 730020）
摘要：目的：研究非创伤性股骨头坏死（NONFH）高发中医体质类型与亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）
677位点多态性的关系。方法：根据前期研究，笔者发现血瘀质、痰湿质、气虚质是NONFH的高发体质类型，根
据纳入与排除标准选择2011年1月-2013年8月在甘肃省中医院门诊、住院部对NONFH患者及非血缘关系健康志愿
者进行问卷调查，将调查病例所得数据资料建立数据库。从数据库中筛选出气虚质、痰湿质、血瘀质3种高发体
质患者，采集血液标本共93例NONFH患者（其中血瘀质32例、痰湿质31例、气虚质30例）及83名正常健康非血
缘关系志愿者。对每位受检者取血样3mL，提取DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行DNA测序，检测MTHFR677
位点多态性，并对结果进行统计学分析。结果：①MTHFRC677T位点病例组与对照组比较，病例组TT基因型的
发病风险是CC基因型的2.340倍（95%CI [1.050-5.217]，P=0.038），T等位基因的发病风险是C等位基因的1.667
倍（95%CI [1.092-2.545]，P=0.018），且具有显著差异（P<0.05）。②血瘀质病例组TT基因型的发病风险是
CC基因型的3.840倍（95%CI [1.196-12.328]，P=0.024），T等位基因的发病风险是C等位基因的2.255倍（95%CI
[1.232-4.126]，P=0.008），且具有显著差异（P<0.05）。结论：MTHFRC677T位点的突变使NONFH的发病风险
增高，MTHFRC677T位点可能与NONFH发病相关。MTHFRC677T位点的突变使血瘀质NONFH的发病风险增高，
MTHFRC677T位点基因多态性可能是痰湿质高发NONFH的分子生物学机制之一。
关键词：非创伤性股骨头坏死；亚甲基四氢叶酸还原酶；中医体质；血瘀质；痰湿质
基金资助：国家自然科学基金面上项目（No.81072821）
·研究报告·
拼版3.indd 2194 2015-5-28 12:53:12