全 文 ：收稿日期:2012-05-23 接受日期:2012-09-19
基金项目:国家自然科学基金项目(81102609) ;福建省自然科学
基金项目(2011J05074) ;陈可冀中西医结合发展基金
(CKJ20110003)
* 通讯作者 Tel:86-591-22861988;liuxianxiang@ 163． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24:1837-1843
文章编号:1001-6880(2012)12-1837-07
基于响应曲面法的龙须藤多糖提取条件优化
蔡亮亮1，余方荣1，李西海2，叶蕻芝2，徐慧凤2，刘献祥2*
1福建中医药大学药学院;2 福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350108
摘 要:采用响应曲面法分析与确定龙须藤多糖提取工艺，通过单因素实验确定影响多糖提取的主要影响因
素，然后在单因素实验的基础上，采用响应曲面法分析提取因素对龙须藤多糖含量的影响，得出龙须藤多糖提
取的最优条件为:提取温度 100 ℃、提取时间 4 h、料液比 1∶ 23、提取次数为 2 次。在此条件下龙须藤多糖提取
率理论值为 3． 12%，实测值为 2． 98%。
关键词:龙须藤;多糖;响应曲面法;Box-behnken 设计
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A
Optimization of Extraction Conditions of Bauhinia championii Benth
Polysaccharide based on Response Surface Methodology
CAI Liang-liang1，YU Fang-rong1，LI Xi-hai2，YE Hong-zhi2，XU Hui-feng2，LIU Xian-xiang2*
1Department of Pharmacy，Fujian University of traditional Chinese Medicine;
2Fujian Academy of Integrative Medicine，Fujian University of traditional Chinese Medicine，Fujian 350108，China
Abstract:Response surface methodology was applied to optimize the main extraction conditions of Bauhinia championii
Benth polysaccharides ． The main influence factors was determined by single factor test and the results showed that opti-
mum extraction conditions were as follows:the extraction temperature was 100 ℃ and extraction time was 4 h，the liquid-
solid ratio was 23 and the extraction times was 2． These predicted values were also verified by validation experiments．
Key words:Bauhinia championii Benth;Polysaccharides;Response surface methodology;Box-Behnken design
龙须藤(Bauhinia championii Benth)又称梅花
入骨丹、九龙藤，系双子叶植物豆科类羊蹄甲属植物
多年生藤［1］，具有祛风除湿、行血气之功效，主治跌
打损伤，风湿骨痛、心胃气通［2］。主要分布在福建、
广东、江西等地，尤其在福建福州永泰县青云山地区
资源丰富。龙须藤多糖是龙须藤的主要有效成分之
一，在治疗骨性关节炎方面具有较高的应用开发价
值;影响多糖的提取率因素很多，其中，提取温度、提
取时间、料液比、提取次数是主要因素。响应曲面法
是评价指标和因素间的非线性关系的一种试验设计
方法，其原理是通过一些列确定性试验拟合为一个
响应面来模拟真实的极限状态曲面，从而很容易的
进行可靠性分析［3］。目前多种植物多糖用响应曲
面法进行测定，都能得到较高的提取率［4-6］，因此，本
文在单因素试验的基础上，结合响应曲面法，对龙须
藤多糖的提取工艺进行优化，以期为龙须藤多糖的
产业化开发提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
LXJ-低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪
器厂) ，DU-640 紫外可见分光光度计(美国 Beckman
公司)。D-无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品
检定所，批号:110833-200904) ，无水乙醇、苯酚、浓
硫酸(分析纯) ;龙须藤经福建中医药大学药学院杨
成梓副教授鉴定。
1． 2 方法
1． 2． 1 龙须藤多糖的提取
精密称取粉碎干燥后的龙须藤粉末 5 g，石油醚
脱脂并干燥，置圆底烧瓶中，按照设定好的条件(提
取温度、提取时间、料液比、提取次数)进行回流提
取，提取液趁热抽滤，制备多糖水提液，将其浓缩并定
容至 50 mL。分别量取上述定容溶液 10 mL置 50 mL
离心管中，加 40 mL无水乙醇，摇匀，4 ℃醇沉过夜、离
心，沉淀加水溶解，转移至 50 mL容量瓶，定容。
1． 2． 2 龙须藤多糖标准曲线制备
根据苯酚-硫酸法［7］，精密称取葡萄糖标准品
10 mg置 100 mL 容量瓶中水溶解并定容，制备 100
μg /mL的溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液 0、0． 2、
0． 3、0． 4、0． 5、0． 6、0． 7 mL置 7 个干燥具塞试管中，
加蒸馏水使最终体积均为 1 mL，摇匀，分别加入 5%
苯酚溶液 1 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸 5 mL，充分摇
匀沸水浴 15 min，室温冷却 15 min，于 490 nm 波长
处测定吸光度。龙须藤多糖按照上述方法测定吸光
度，计算多糖含量。
1． 2． 3 多糖提取率的计算
多糖提取率 /% = 多糖质量 /药材质量 ×
100%
1． 2． 4 单因素试验
固定提取时间 3 h、料液比 1∶ 25、提取 2 次的条
件下，分别以 60 、70 、80 、90 、100 ℃进行提取，考察
提取温度对多糖得率的影响。
固定温度 100 ℃、料液比 1 ∶ 25、提取 2 次的条
件下，分别提取 2 、3 、4 、5 、6 h，考察提取时间对多
糖得率的影响。
固定温度 100 ℃、提取时间 3 h、提取 2 次的条
件下，分别在料液比 1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30 的
条件下提取，考察料液比对多糖得率的影响。
固定温度 100 ℃、提取时间 3 h、料液比 1∶ 25 的
条件下，分别提取 1、2、3、4 次，考察提取次数对多糖
得率的影响。
1． 2． 5 响应曲面优化法试验
根据单因素试验结果，每个单因素选取提取率
比较高的 3 个水平，借助试验设计软件 Design-Ex-
pert． 8． 05b，采用 Box-Behnken 设计法。因素编码水
平见表 1。
表 1 试验因素水平编码
Table 1 Levels and factors of polysaccharides extraction test
因素 Factor -1 0 1
A提取温度 Extraction temperature(℃) 80 90 100
B 提取时间 Extraction time(h) 2 3 4
C 料液比 Ratio of soild / liquid(g． mL-1) 20 25 30
D 提取次数 Extraction times 2 3 4
2 结果
2． 1 多糖标准曲线的绘制
按 1． 2． 2 项操作，得出各份溶液的吸光度值 ，
以多糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方
程:Y = 0． 0091X-0． 0132，R =0． 9989
2． 2 单因素结果分析
2． 2． 1 提取温度对龙须藤多糖得率的影响
精密称取 5 份 5 g的龙须藤，加入料液比为 1∶
25 的水，提取 2 次，每次 3 h，将温度分别设定在 60、
70、80、90、100 ℃，研究温度对龙须藤多糖提取率的
影响，见图 1。
由图 1 可知，在 60-100 ℃温度范围内，随着提
取温度的升高，多糖得率显著增加，升高到 90 ℃，再
提高温度，多糖得率增加幅度较小，考虑到能耗及多
糖在较高温度下易降解，选择 90 ℃较适宜。
图 1 温度对多糖提取率的影响
Fig. 1 Effects of temperature on the extraction rate of poly-
saccharide
2． 2． 2 提取时间对龙须藤多糖得率的影响
精密称取 5 份 5 g的龙须藤，加入料液比为 1∶
25 的水，100 ℃、提取 2 次的情况下，将时间设定在
2 、3 、4 、5 、6 h，研究时间对龙须藤多糖提取率的
影响，见图 2。
由图 2 可知，在 2 ～ 3 h 之间，随着提取时间的
延长，多糖得率显著增加，3 ～ 5 h 之间多糖得率增
幅较小，在提取 5 h 后，多糖得率反而下降，提取时
间的延长，其它成分也被提取出来，因此提取时间选
择 3 h 较合适。
图 2 提取时间对多糖提取率的影响
Fig. 2 Effects of extraction time on the extraction rate
of polysaccharide
8381 天然产物研究与开发 Vol. 24
2． 2． 3 料液比对龙须藤多糖得率的影响
精密称取 5 份 5 g的龙须藤，100 ℃、提取 2 次、
每次 3 h、将料液比设定在 1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25、1
∶ 30，研究料液比对龙须藤多糖提取率的影响，见图
3。
由图 3 可知，在料液比较低时随着料液比的增
大，多糖得率也在增大，料液比在 1∶ 25 时多糖得率
最高，料液比超过 1∶ 25 时，多糖得率反而下降;这是
由于增大料液比可以使物料与溶剂接触面积增大，
使多糖被充分的提取出来，但料液比过大，也使其它
成分被过多溶出，消耗能量与时间，因此，料液比为
1∶ 25 时较为合适。
图 3 料液比对多糖提取率的影响
Fig. 3 Effects of ratio of material to solvent on the ex-
traction rate of polysaccharide
2． 2． 4 提取次数对龙须藤多糖得率的影响
精密称取 5 份 5 g的龙须藤，加入料液比为 1∶
25 的水，100 ℃提取 3 h;提取 1、2、3、4 次，研究提取
次数对龙须藤多糖提取率的影响，见图 4。
由图 4 可知，在提取 3 次时，多糖得率较高，考
虑到提取成本，因此选择提取 3 次较为合适。
2． 3 响应曲面实验
2． 3． 1 采用 Box-Behnken 设计，以提取温度、提取
图 4 提取次数对多糖提取率的影响
Fig. 4 Effects of extraction times on the extraction rate of poly-
saccharide
时间、料液比、提取次数为自变量，根据单因素试验
结果，设计四因素三水平的响应面试验，实验设计与
结果见表 2 利用 Design-Expert． 8． 05b软件对数据进
行分析，得二元多项回归方程:Y = 2． 42 + 0． 34A +
0． 27B-0． 078C + 0． 24D + 0． 29AB-0． 31AC-0． 1AD-
0. 053BC-0． 23BD +0． 07CD-0． 078A2-0． 18B2-0． 72C2
+ 0． 079D2。从表 3 可以看出模型的一次项提取温
度是极显著的(P ＜ 0． 0001) ，一次项提取时间(P =
0． 0002 ＜ 0． 001)是极显著的，提取次数(P = 0． 0005
＜ 0． 001)是极显著的。交叉相中温度与时间(P =
0． 0063 ＜ 0． 01)、温度与料液比(P = 0． 0036 ＜ 0． 01)
是高度显著的、时间与次数(P = 0． 026 ＜ 0． 05)是显
著的。二次项中提取时间(P = 0． 021 ＜ 0． 05)是显
著的，提取料液比(P ＜ 0． 0001)是极显著的，表明各
个影响因素不是线性关系。整体模型的 P ＜
0. 0001，表明二次方程模型显著，模型的失拟项 P
值为 0． 3922，大于 0． 05，说明模型选择合适，并且该
模型的总回归系数为 R2 = 94． 43，说明该模型与实
际试验拟合较好，可用于龙须藤多糖水浸提实验的
理论预测 。
表 2 Box-Behnken设计实验结果
Table 2 Box-Behnken experiment design and the results
实验号
No． 2 A B C D
提取率实测值(%)
Test number
提取率预测值(%)
Actual valu of yield
predictive valu of yield
1 0 0 0 0 2． 372． 42
2 1 0 0 -1 2． 61 2． 63
3 0 0 0 0 2． 47 2． 42
4 0 1 1 0 1． 67 1． 65
5 0 0 -1 -1 1． 43 1． 69
6 0． -1 1 0 1． 29 1． 40
7 1 0 -1 0 2． 53 2． 36
8 -1 1 0 0 1． 57 1． 80
9 0 0 -1 1 1． 89 2． 03
9381Vol. 24 蔡亮亮等:基于响应曲面法的龙须藤多糖提取条件优化
10 -1 0 0 -1 1． 96 1． 74
11 0 0 1 -1 1． 29 1． 23
12 0 0 0 0 2． 19 2． 42
13 1 1 0 0 2． 95 3． 06
14 0 0 0 0 2． 47 2． 42
15 -1 0 1 0 1． 46 1． 52
16 -1 0 -1 0 1． 09 1． 04
17 -1 0 0 1 2． 58 2． 42
18 0 1 0 1 2． 69 2． 60
19 0 1 -1 0 1． 98 1． 91
20 1 0 1 0 1． 64 1． 57
21 0 0 0 0 2． 62 2． 42
22 0 -1 -1 0 1． 39 1． 28
23 1 -1 0 0 1． 93 1． 95
24 0 0 1 1 2． 03 2． 01
25 0 1 0 -1 2． 73 2． 57
26 0 -1 0 1 2． 47 2． 51
27 1 0 0 1 2． 81 2． 90
28 0 -1 0 -1 1． 61 1． 59
29 -1 -1 0 0 1． 71 1． 84
表 3 回归分析结果
Table 3 Results of regression analysis
方差来源
Origin of variance
平方和
Sum of squares
自由度
Degree of freedom
均方
Mean square
F值
F value
P值
P value
A 1． 40 1 1． 40 42． 89 ＜ 0． 0001
B 0． 85 1 0． 85 25． 96 0． 0002
C 0． 072 1 0． 072 2． 21 0． 1596
D 0． 67 1 0． 67 20． 58 0． 0005
AB 0． 34 1 0． 34 10． 30 0． 0063
AC 0． 40 1 0． 40 12． 15 0． 0036
AD 0． 044 1 0． 044 1． 35 0． 2647
BC 0． 011 1 0． 011 0． 34 0． 5705
BD 0． 20 1 0． 20 6． 20 0． 0260
CD 0． 020 1 0． 020 0． 60 0． 4514
A2 0． 040 1 0． 040 1． 22 0． 2887
B2 0． 22 1 0． 22 6． 76 0． 0210
C2 3． 38 1 3． 38 103． 53 ＜ 0． 0001
D2 0． 041 1 0． 041 1． 25 0． 2829
模型 Model 7． 75 14 0． 55 16． 96 ＜ 0． 0001
残差 Residual Error 0． 46 14 0． 033
失拟项 Loss fitting term 0． 36 10 0． 036 1． 42 0． 3922
纯误差 Pure Error 0． 10 4 0． 025
* P ＜ 0． 05 显著作用;＊＊P ＜ 0． 01 高度显著;＊＊＊P ＜ 0． 001 极显著作用
0481 天然产物研究与开发 Vol. 24
2． 3． 2 响应曲面及等高线分析
图 5-10 是根据回归模型作出的相应的等高线
与响应面，显示了不同的交叉因素对多糖得率的影
响。等高线图上圆形表示交互作用不明显，曲率半
径较大的椭圆则表示交互作用显著，并且曲率半径
越大交互作用越显著;在等高线图上，在最大的椭圆
上取值，多糖得率最低，在最小的椭圆上取值，则表
示多糖得率最高，它们之间的等高线反映了多糖得
率的变化;响应面的最高点同时也是等高线最小椭
圆的中心点［8］。由表 3 知各因素对多糖提取率的影
响因素为:提取温度与料液比 ＞提取温度与提取时
间 ＞提取时间与提取次数 ＞料液比与提取次数 ＞提
取时间与料液比。
1481Vol. 24 蔡亮亮等:基于响应曲面法的龙须藤多糖提取条件优化
3 结论
本实验运用近几年发展起来的分析方法-响应
曲面法对龙须藤多糖的提取工艺进行优化，通过此
分析方法建立了水浸提龙须藤多糖的二次多项式模
型，对影响多糖提取率的因素及其交互作用进行探
讨。由 Design-Expert． 8． 0． 5b 软件分析处理，确定
龙须藤多糖提取的最佳工艺为:提取温度 100 ℃、提
取时间 4 h、料液比为 1 ∶ 23． 2、提取次数为 2 次，考
虑到实际的操作条件，将龙须藤多糖的提取条件修
改为:提取温度 100 ℃、提取时间 4 h、料液比为 1∶ 23、
提取次数为 2 次，理论计算提取率为 3． 12%，在此
基础上验证，提取率为 2． 98%，与预测值比较接近;
此实验优选出龙须藤多糖的提取实验条件，可以为
2481 天然产物研究与开发 Vol. 24
龙须藤药材开发、质量控制提供实验基础。
参考文献
1 Bai HY(白海云) ，Zhan QF(詹庆丰) ，Xia ZH(夏增华) ，et
al． Studies on the chemical constituents in vine stem of Bau-
hinia championii． Chin J Chin Mater Med (中国中药杂
志) ，2005:30:42-43．
2 Compile Group of Compliation of Countrywide Herbal Medi-
cine of China(《全国中草药汇编》编写组)． Compliation of
countrywide Herbal Medicine of China (全国中草药汇编)．
Beijing:Peoples Medicial Publishing House，1996． 374．
3 Muralidhar RV，Chirumamila RR． A response surface ap-
proach for the comparison of lipase production by Candida
cylindracea using two different carbon sources． Biochem En-
gin J，2001，9:17-24．
4 Huang S(黄森) ，Zha XQ(查学强) ，Luo JP(罗建平) ，et
al． Studies on the Extraction of Active Polysaccharide from
Dendrobium Huoshanense with Box-Behnken Method． Chin
Med Mat(中药材) ，2007:591-594．
5 Meng XJ(孟宪军) ，Li DN (李冬男) ，Wang YQ(汪艳群) ，
et al． Response Surface Methodology as An Approach for Op-
timization of Extraction of Water-soluble Polysaccharides
from Schisandra chinensis (Turcz．)Baill． Food Sci(食品科
学) ，2010，31:111-115．
6 Li G(李光) ，Li XL(李学兰) ，Sun HF(孙慧峰) ，et al． Op-
timization of Extraction of Dendrobium candidum Polysaccha-
rides Using Response Surface Methodology． Mod Chin Med
(中国现代中药) ，2011，13(9) :29-33．
7 Zhang WJ(张惟杰)． Biochemical research technology of gly-
coconjugates(糖复合物生化研究技术)． Hangzhou:Zhe-
jiang University Press，201l:128-185．
8 Wang AL(王安良) ，Yun X(云霞) ，Yang H (杨红)． Study
on the process of the Dioscorea opposite Thunb by micro-
wave-assisted extraction using response surface methodology．
Food Sci Technol (食品科技) ，2007，194(12) :
櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵
86-90．
(上接第 1856 页)
25 Sun ZG(孙志刚) ，et al． Egg decoction treatment of adeno-
carcinoma of digestive tract on Euphorbia fischeriana． J Qilu
Oncology(齐鲁肿瘤杂志) ，1998，5(3) :36．
26 Feng WJ，et al． A comparison of the in vitro antitumor activi-
ties of gnidimacrin with vincristin(VCR) and adriamycin
(ADM)． Cancer(癌症) ，1994，13:503-505．
27 Yu Y(于勇) ，et al． Study of treatment effects for leckemia on
Euphorbia fischeriana． Chin Pharml J(中国药学杂志) ，
2002，37:958-959．
28 Li XQ(李秀青) ，et al． The inhibiting effects of Euphorbia
fischeriana on Tuberculous Bacillus． Pharmaceutical J Chinese
People’s Liberation Army(解放军药学学报) ，2006，22:
153-155．
29 Xie QK(解庆珂)． Use value of Euphorbia fischeriana． Inner
Mongolia Foresty(内蒙古林业)1992，9:19．
30 Xu DC(徐德昌) ，et al． Killing trials of pesticide of Euphor-
bia fischeriana． China Beet and Sugar(中国甜菜糖业) ，
2004，(2) :5-7．
31 Zhang LM(张黎明)． Test of several forest pests control by
using the liquid extracted from Euphorbia fischeriana root．
Forestry Sci Tech(林业科技) ，2003，28(2) :25-26．
32 Gu YJ(顾雅静) ，et al． Studies of acarocidal activity of Eu-
phorbia fischeriana against Tetranychu cinnabarinus． J Shanxi
Agric Univ(山西农业大学学报) ，2007，27:394-396．
33 Wang B(王彬) ，et al． Euphorbia fischeriana Steud on killing
oncomelania snails and miracidiums of schistosoma． Anhui
Agric Sci Bull(安徽农学通报) ，2010，16(11) :46-48．
34 Li SH(李少华) ，et al． Study on antifungai activities of the
petroleum ether extract from Euphorbia fischeriana Steud a-
gainst Valsa Mali Miyabe et Yamada． J Shanxi Agric Univer
(山西农业大学学报) ，2009，29:559-561．
35 Zheng XB(郑小波) ，et al． Prevention and control of experi-
ments of piglets disease treated with traditional chinese medi-
cine wipe agent． Chinese J Tradit Veterinary Sci(中兽医学杂
志) ，2001，103(2) :4-8．
36 Zhao KJ(赵奎君) ，et al． Crude character and goods identifi-
cation of Euphorbia fischeriana． J China Pharm Univ(中国
药科大学学报) ，1998，25:11-13．
37 Tian JQ(田吉全)． Medicinal value of exploitation and utili-
zation on Euphorbia fischeriana． Forest By-product and Speci-
ality in China(中国林副特产) ，2010，106:93．
38 Zhang P(张萍) ，et al． Development of biological pesticide
and artifical cultivation of Euphorbia fischeriana Steud var
komarovina(prokh)Chu． Protection Forest Science and Tech-
nology(防护林科技) ，2005，68(5) :4-5．
3481Vol. 24 蔡亮亮等:基于响应曲面法的龙须藤多糖提取条件优化