全 文 ：环糊精包合物中桂皮醛、丁香酚、苍术素的含量［J］． 中
国实验方剂学杂志，2013，19(3) :86-88．
［13］ 黄 进，杨国宇，李宏基，等． 抗氧化剂作用机制研究进
展［J］． 自然杂志，2004，26(2) :74-77．
［14］ 汤务霞，陈明涛，阙晓莉． 抗氧化剂 BHT 和维生素 E 对
菜籽油的抗氧化研究［J］． 中国食品添加剂，2011(4) :
59-62．
［15］ 穆筱梅，钟振声． 维生素 E、维生素 C 和 BHT 对大豆磷
脂脂质体的抗氧化作用［J］． 大豆科学，2006，25(4) :
434-437．
［16］ 刘成梅，冯妹元，刘 伟，等． 天然维生素 E 及其抗氧化
机理［J］． 食品研究与开发，2005，26(6) :205-207．
表面活性剂-超声协同提取山香圆叶总黄酮工艺的优化
罗开沛， 李小芳* ， 林 浩， 罗 佳， 杨 露， 刘海霞
(成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，四川省中药资源系统研究与开发利用重点实
验室—省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137)
收稿日期:2016-01-04
基金项目:四川省教育厅重点项目 (15ZA0094) ;四川省科技厅“苗子工程”重点项目 (2016ＲZ0037)
作者简介:罗开沛 (1991—) ，男，硕士生，研究方向为中药新制剂、新剂型、新技术。Tel:15351218131，E-mail: luokaipei @
126． com
* 通信作者:李小芳 (1964—) ，女，教授，博士生导师，研究方向为中药新制剂、新剂型、新技术。Tel:13808195110，E-mail:lixi-
aofang918@ 163． com
摘要:目的 优化表面活性剂-超声协同提取山香圆 Turpinia arguta Seem． 叶总黄酮工艺。方法 在单因素试验基础
上，以十二烷基硫酸钠 (SDS)用量、液料比、乙醇体积分数为影响因素，总黄酮提取率为评价指标，Box-Behnken
设计优化提取工艺。结果 最佳条件为十二烷基硫酸钠用量 0. 64%，液料比 25 ∶ 1，乙醇体积分数 50%，超声温度
60 ℃，超声时间 40 min，总黄酮提取率为 3. 48%。结论 该方法简单、节能、省时，可用于山香圆叶总黄酮的提取。
关键词:山香圆;叶;总黄酮;表面活性剂-超声协同提取;Box-Behnken设计
中图分类号:Ｒ284. 2 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2016)12-2585-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 12. 012
Optimization of surfactant assisted ultrasonic extraction for total flavonoids from
Turpinia arguta leaves
LUO Kai-pei， LI Xiao-fang* ， LIN Hao， LUO Jia， YANG Lu， LIU Hai-xia
(College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;The Ministry of Education Key Laboratory for Standardization of Chinese
Herbal Medicine;Key Laboratory for Systematic Ｒesearch，Development and Utilization of Chinese Medicine Ｒesources in Sichuan Province—State Key Labo-
ratory Breeding Base Co-founded by Province and Ministry，Chengdu 611137，China)
ABSTＲACT:AIM To optimize the surfactant assisted ultrasonic extraction process for total flavonoids from Tur-
pinia arguta Seem． leaves． METHODS Based on single factor test，sodium dodecyl sulfate (SDS)amount，liq-
uid-solid ratio and ethanol concentration were determined to be the influencing factors，and Box-Behnken design
was applied to optimizing the extraction with the extraction rate of total flavonoids as an evaluation tool． ＲESULTS
The optimal conditions were determined to be 0. 64% for sodium dodecyl sulfate consumption，25 ∶ 1 for liquid-
solid ratio，50% for ethanol concentration，60℃ for ultrasonic temperature，and 40 min for ultrasonic time at
3. 48% total flavonoids extraction rate． CONCLUSION This energy and time saving，and yet simple method can
be used for the extraction of total flavonoids from T． arguta leaves．
KEY WOＲDS:Turpinia arguta Seem．;leaves;total flavonoids;surfactant assisted ultrasonic extraction;Box-
Behnken design
5852
2016 年 12 月
第 38 卷 第 12 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
December 2016
Vol． 38 No． 12
山香圆叶又称两指剑、七寸钉等，为省沽油科
植物山香圆 Turpinia arguta Seem． 的干燥叶，其味
苦，性寒，归肺、肝经，具有清热解毒、利咽消肿
之效，主治咽喉肿痛、乳蛾喉痹等病症［1］。现代
研究表明，总黄酮是其主要有效部位，具有抗菌、
抗炎、增强免疫等药理作用［2-4］。目前，对山香圆
叶总黄酮提取的研究较少，仅有回流提取法［5］和
微波提取法［6］，均存在一定缺陷，如前者溶剂用
量大、提取周期长，而后者对仪器设备要求较高，
对药物和溶媒选择性较强，而且存在安全隐患。
表面活性剂-超声协同提取是近年来兴起的一
种提取方法，兼顾了表面活性剂的润湿、增溶作用
和超声波的振动、空化效应，具有减少耗能、缩短
时间、提高得率等优点，尤其适用于黄酮类化合物
的提取［7-8］。本实验采用该方法提取山香圆叶总黄
酮，首先对可能影响提取率的因素进行考察，确定
主要因素及其大致范围，再通过 Box-Behnken 设计
进一步优化提取工艺，旨在为山香圆叶资源的合理
开发提供理论基础。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 PS-60A超声波清洗器 (成都雅荣实验
仪器有限公司) ;UV-6000 紫外可见分光光度计
(上海美谱达仪器有限公司) ;UPT-I-10T 超纯水器
(成都超纯科技有限公司) ;BP211DAG 电子天平
(十万分之一，德国 Satorius公司)。
1. 2 材料 芹菜素对照品 (成都曼思特生物科技
有限公司，批号 MUST-15032610)。山香圆叶 (江
西青峰药业有限公司) ，由成都中医药大学药学院
蒋桂华教授鉴定为正品。吐温-20、吐温-80、司盘-
80、十二烷基磺酸钠 (SBS)、十二烷基苯磺酸钠
(DBS)、十二烷基硫酸钠 (SDS)、乳化剂 OP-10
(成都市科龙化工试剂厂) ;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 表面活性剂-超声协同提取方法 取山香圆叶
粗粉 1 g，加入适量表面活性剂和乙醇溶液，超声
(40 kHz、350 W)提取一定时间，过滤，即得供
试品溶液。
2. 2 总黄酮测定方法
2. 2. 1 对照品溶液的制备 精密称取芹菜素对照
品 5. 10 mg，置于 50 mL量瓶中，甲醇超声溶解后
定容，摇匀，得到 0. 102 mg /mL对照品溶液。
2. 2. 2 测定波长的选择［9］ 将对照品溶液和供试
品溶液分别稀释至一定浓度，在 200 ～ 500 nm波长
之间进行扫描，发现两者均在 268. 5 nm 波长处有
最大吸收，故选择 268. 5 nm作为检测波长。
2. 2. 3 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液
0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 mL，置于 25 mL 量瓶
中，甲醇定容，在 268. 5 nm 波长处测定吸光度，
以芹菜素质量浓度 (C)对吸光度 (A)进行线性
回归，得标准曲线 A = 0. 076 7C + 0. 028 8 (r =
0. 999 6) ，表明芹菜素在 2. 04 ～ 10. 20 μg /mL范围
内线性关系良好。
2. 2. 4 含有量的测定 取山香圆叶粗粉 1 g，在一
定条件下超声提取，过滤，得到样品液，量取适量
并稀释至适宜浓度，在 268. 5 nm 波长处测定吸光
度，将其代入“2. 2. 3”项下标准曲线以计算总黄
酮含有量。
2. 3 单因素试验
2. 3. 1 表面活性剂种类对提取率的影响 称取 7
份山香圆叶粗粉，每份 1 g，置于烧瓶中，加入
0. 5%不同表面活性剂和 60% 乙醇，固定液料比
20 ∶ 1，在 50 ℃下超声 30 min，过滤，即得提取
液，按“2. 2. 4”项下方法测定总黄酮含有量，计
算提取率 (总黄酮含有量 /药材质量) ，结果见表
1。由表可知，阴离子型表面活性剂提取率普遍高
于非离子型，这可能与其增溶水量大于后者有
关［10］，其中又以十二烷基硫酸钠的提取效果最好，
而且价格便宜，因此选择其作为表面活性剂。
表 1 表面活性剂种类对提取率的影响
Tab. 1 Effects of surfactant types on extraction rate
表面活性剂 类型
亲水亲油平衡值
(HLB)
提取率 /%
吐温-20 非离子型 16. 7 2. 21
吐温-80 非离子型 15. 0 2. 46
司盘-80 非离子型 4. 30 1. 52
十二烷基硫酸钠 阴离子型 40. 0 3. 23
十二烷基磺酸钠 阴离子型 13. 0 3. 04
十二烷基苯磺酸钠 阴离子型 10. 6 2. 97
乳化剂 OP-10 非离子型 14. 5 2. 65
2. 3. 2 表面活性剂用量对提取率的影响 在液料
比 20 ∶ 1、乙醇体积分数 60%、超声温度 50 ℃、
超声时间 30 min 条件下，考察 0. 4%、0. 5%、
0. 6%、0. 7%、0. 8%十二烷基硫酸钠用量对总黄
酮提取率的影响。结果，提取率先随用量增加而升
高，但当用量大于 0. 6%后反而有所降低，这可能
是由于表面活性剂达到临界胶束浓度后，形成的胶
团与其他物质结合，减弱了对黄酮类化合物的增溶
作用，导致提取率有所下降。因此，选择 0. 5%、
0. 6%、0. 7%用量作进一步优化。
6852
2016 年 12 月
第 38 卷 第 12 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
December 2016
Vol． 38 No． 12
2. 3. 3 液料比对提取率的影响 在乙醇体积分数
60%、十二烷基硫酸钠用量 0. 6%、超声温度
50 ℃、超声时间 30 min 条件下，考察 10 ∶ 1、
15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1 液料比对总黄酮提取
率的影响。结果，液料比增加会提高总黄酮提取
率，但大于 20 ∶ 1 后，其他杂质也会相应增加，导
致其溶出受到干扰。因此，选择 15 ∶ 1、20 ∶ 1、
25 ∶ 1 液料比作进一步优化。
2. 3. 4 超声温度对提取率的影响 在液料比 20 ∶
1、乙醇体积分数 60%、十二烷基硫酸钠用量
0. 6%、超声时间 30 min 条件下，考察 40、50、
60、70、80 ℃超声温度对总黄酮提取率的影响。
结果，随着温度升高，提取率逐渐增大，可能是由
于高温加快了分子运动而有利于其溶出;当温度达
到 60 ℃时，总黄酮溶解度已基本趋于饱和，增幅
明显变缓。从节约成本角度考虑，固定超声温度为
60 ℃，不作后续优化。
2. 3. 5 超声时间对提取率的影响 在液料比 20 ∶
1、乙醇体积分数 60%、十二烷基硫酸钠用量
0. 6%、超声温度 50 ℃条件下，考察 20、30、40、
50、60 min 提取时间对总黄酮提取率的影响。结
果，超声时间越长，提取率越高，但增长幅度不明
显，考虑到时间过长不仅浪费能源，而且会缩短仪
器的使用寿命，还可能提取出更多的无效成分，故
最终固定超声时间为 40 min，不作后续优化。
2. 3. 6 乙醇体积分数对提取率的影响 在液料比
20 ∶ 1、乙醇体积分数 60%、十二烷基硫酸钠用量
0. 6%、超声时间 30 min 条件下，考察 30%、
40%、50%、60%、70%乙醇体积分数对总黄酮提
取率的影响。结果，当乙醇体积分数为 50% 时，
提取率最大;继续增加体积分数，提取率反而明显
下降，可能此时易提取出一些极性较小的杂质
(如叶绿素) ，从而阻碍了总黄酮溶出。因此，选
择 40%、50%、60%乙醇体积分数作进一步优化。
2. 4 Box-Behnken设计
2. 4. 1 方法 参考文献 ［11］ 并结合单因素试
验，根据 Box-Behnken 设计原理［12］，以总黄酮提
取率 (Y)为评价指标，十二烷基硫酸钠用量
(A)、液料比 (B)、乙醇体积分数 (C)为影响因
素进行优化，因素水平见表 2，设计结果见表 3。
2. 4. 2 模型拟合 应用 Design-Expert 8. 0. 6 软件
分析实验数据，拟合多元线性回归方程为 Y =
3. 25 +0. 096A + 0. 069B － 0. 12C (r = 0. 445 8) ，二
次多项式回归方程为 Y = 3. 41 + 0. 096A + 0. 069B +
0. 12C + 0. 04AB + 0. 01AC + 0. 12BC － 0. 15A2 －
0. 028B2 － 0. 15C2 (r = 0. 983 6) ，由于后者 r 值较
大，即模型拟合情况良好，故对其进行方差分析，
结果见表 4。由表可知，整体模型 P ＜ 0. 01，表明
该响应面模型显著性较高;失拟项 P ＞ 0. 05，表明
该模型试验误差小，可对总黄酮提取进行分析及
预测。
表 2 因素水平
Tab. 2 Factors and levels
因素
水平
－ 1 0 1
A十二烷基硫酸钠 /% 0. 5 0. 6 0. 7
B液料比 15 ∶ 1 20 ∶ 1 25 ∶ 1
C乙醇 /% 40 50 60
表 3 Box-Behnken设计结果
Tab. 3 Box-Behnken design results
编号
A十二烷基硫酸
钠 /%
B液料比 C乙醇 /% Y提取率 /%
1 0 0 0 3. 39
2 1 1 0 3. 43
3 － 1 0 1 2. 85
4 0 1 － 1 3. 28
5 0 － 1 1 2. 95
6 0 1 1 3. 31
7 0 0 0 3. 46
8 0 0 0 3. 41
9 0 0 0 3. 37
10 1 － 1 0 3. 20
11 － 1 0 － 1 3. 15
12 1 0 1 3. 09
13 1 0 － 1 3. 34
14 － 1 － 1 0 3. 11
15 － 1 1 0 3. 18
16 0 － 1 － 1 3. 39
17 0 0 0 3. 42
表 4 方差分析
Tab. 4 Analysis of variance
来源 离均差平方和 自由度 F值 P值
模型 0. 5 9 46. 53 ＜ 0. 000 1
A 0. 074 1 61. 94 0. 000 1
B 0. 038 1 31. 60 0. 000 8
C 0. 12 1 96. 29 ＜ 0. 000 1
AB 0. 006 4 1 5. 35 0. 054
AC 0. 000 6 1 0. 52 0. 493 3
BC 0. 055 1 46. 16 0. 000 3
A2 0. 098 1 81. 84 ＜ 0. 000 1
B2 0. 003 2 1 2. 66 0. 146 8
C2 0. 095 1 79. 18 ＜ 0. 000 1
残差 0. 008 4 7 — —
失拟项 0. 003 8 3 1. 09 0. 448 1
纯误差 0. 004 6 4 — —
总离差 0. 51 16 — —
7852
2016 年 12 月
第 38 卷 第 12 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
December 2016
Vol． 38 No． 12
2. 4. 3 响应面分析 根据回归方程绘制三维效应
面图，见图 1。
图 1 三维效应面图
Fig. 1 Three-dimensional response surface graphs
2. 4. 4 验证试验 通过以上分析，得到最佳条件
为表面活性剂用量 0. 64%，液料比 25 ∶ 1，乙醇体
积分数 50. 09%，总黄酮提取率预测值 3. 5%。为
了便于实验操作，将其修正为表面活性剂用量
0. 64%，液料比 25 ∶ 1，乙醇体积分数 50%。进行
3 批验证试验，测得总黄酮提取率分别为 3. 53%、
3. 45%、3. 47%，平均值 3. 48% (ＲSD ＜ 2. 0%) ，
与预测值接近，表明所建立的模型预测性良好，准
确性较高。
2. 5 不同提取方法的比较 根据优化得到的最佳
工艺条件，与回流法和超声法进行比较，结果见表
5。由表可知，表面活性剂-超声法对总黄酮的提取
率高于同条件下的超声法，提取率提高 7. 74%;
相较于回流提取法，其提取温度降低，提取时间明
显缩短，提取率提高 21. 25%，具有节能、省时、
高效等优点。
3 讨论
前期预实验参考文献 ［14］，以芦丁为对照品
来测定总黄酮含有量，但在样品液中加入 NaNO2-
Al(NO3)3-NaOH 后，并没有出现特征性酒红色，
而且在 510 nm波长处没有与对照品相似的吸收峰。
查阅文献发现，只有含邻二酚羟基，而且其邻位没
有发生取代结构的物质才会出现显色反应和
510 nm波长处的吸收峰［15-16］，而山香圆叶主要的
黄酮类成分为芹菜素及其苷类等，苷类一般在 5 或
7 位取代，如女贞苷、野漆树苷和芹菜素-7-新橙皮
糖苷等［17-18］，并不存在邻二酚羟基结构。因此，
本实验以芹菜素为对照品，直接测定山香圆叶中总
黄酮的含有量，该方法操作简便，重复性好。
表 5 3 种提取方法的比较 (n =3)
Tab. 5 Comparison of three extraction methods (n =3)
提取方法 提取溶剂(乙醇)/% 液料比 提取温度 /℃ 提取时间 /min 提取次数 /次 提取率 /%
乙醇回流法［13］ 70 10 ∶ 1 80 120 3 2. 87
超声法 50 25 ∶ 1 60 40 1 3. 23
表面活性剂-超声法 50 25 ∶ 1 60 40 1 3. 48
由单因素试验可知，用量相同而亲水亲油平衡
(HLB)值不同的表面活性剂的增溶效果有所差
异，而且同种表面活性剂的用量不同，增溶效果也
不同。临界胶束浓度 (CMC)是影响其增溶能力
的主要因素，CMC 越小，增溶能力越强;CMC 越
大，增溶能力越弱。根据实验结果可知，在 50%
乙醇、温度 60 ℃的条件下，0. 5% ～ 0. 7%十二烷
基硫酸钠的 CMC较小，增溶效果显著。
目前，对山香圆叶提取工艺的优化均选用正交
设计，存在预测性不理想、精准度低等缺点，而本
实验采用 Box-Behnken设计进行研究。前期对提取
次数进行了考察，发现第 1 次提取率为 88. 23%，
第 2 次为 6. 51%，第 3 次为 2. 76%，3 次总提取率
达 97. 50%，但考虑到能源成本和浓缩效率，确定
以提取一次为宜。
研究结果显示，表面活性剂-超声法的提取率
较高，其原因可能是黄酮类物质通常与糖结合，形
成相对分子质量较大的苷类，而表面活性剂对大分
8852
2016 年 12 月
第 38 卷 第 12 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
December 2016
Vol． 38 No． 12
子有良好的增溶作用，有利于总黄酮溶出。文献
［19］报道，表面活性剂的复配体系较单一的表面
活性剂对药物的提取效果更佳，其能否提高山香圆
叶总黄酮的提取率有待作进一步研究。然而，表面
活性剂的加入可能会增加杂质的溶出，其本身也是
一种杂质，给后续纯化带来一定困难，因此其在提
取方面的应用还需深入探索。
参考文献:
［1］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典:2010 年版一部
［S］． 北京:中国医药科技出版社，2010:28．
［2］ 詹怡飞，张建军，毛友昌，等． 山香圆含片抗菌作用的试验
研究［J］． 江西中医学院学报，2005，17(2) :55-55．
［3］ 张 磊，李 俊，余世春，等． 山香圆总黄酮的抗炎作用
［J］． 安徽医科大学学报，2003，38(3) :185-188．
［4］ 张 磊，李 俊，余世春，等． 山香圆总黄酮体外对大鼠佐
剂性关节炎免疫功能的影响［J］． 中国药理学通报，2007，
23(1) :106-110．
［5］ 曾 贤，陈世华，黄佩蓓，等． 山香圆总黄酮提取工艺的研
究［J］． 现代中药研究与实践，2015，29(5) :46-48．
［6］ 吴 珊，李小芳，舒 予，等． 正交优化-微波辅助提取山
香圆叶总黄酮的工艺研究［J］． 成都中医药大学学报，
2014，37(2) :15-17．
［7］ 魏 巍，郭伟英． 响应面优化表面活性剂协同超声提取合
欢花总黄酮的工艺［J］． 中药材，2015，38(3) :606-609．
［8］ 聂 阳，黄勇红，李 博，等． 表面活性剂-超声协同提取
甘木通总黄酮工艺的研究［J］． 中成药，2013，35(9) :
2040-2042．
［9］ 李桂兰，贺智勇，薛雨晨，等． 闪式提取法用于大蝎子草总
黄酮的工艺条件研究［J］． 中成药，2015，37 (7) :
1603-1605．
［10］ 杨转萍，罗仓学，李 祥． 超声波-表面活性剂协同萃取黄
姜中薯蓣皂苷的工艺研究［J］． 食品科学，2010，31(22) :
46-49．
［11］ 宫 坤，詹小龙，郭中婷，等． 表面活性剂辅助提取石榴叶
中总黄酮工艺的研究［J］． 食品工业科技，2014，35(23) :
261-264．
［12］ 张文秀，朱卫丰，聂鹤云，等． Box-Behnken 响应面法优化
马钱子提取工艺［J］． 中成药，2015，37(9) :1932-1936．
［13］ 吴 珊． 山香圆分散片的制备工艺及质量标准研究［D］．
成都:成都中医药大学，2014．
［14］ 罗宪堂，熊友香，余世平． UV法测定山香圆叶中黄酮类成
分含量［J］． 中医药研究，2002，18(5) :48-49．
［15］ 马陶陶，张群林，李 俊． 中药总黄酮的含量测定方法
［J］． 安徽医药，2008，11(11) :1030-1032．
［16］ 吴 珊，李小芳，罗 佳，等． 大孔树脂纯化山香圆叶中的
总黄酮［J］． 华西药学杂志，2014，29(6) :680-682．
［17］ 孙敬勇，孙 洁，武海艳，等． 山香圆叶化学成分研究［J］．
食品与药品，2012，14(5) :162-165．
［18］ 章光文，周国平，杨香菊，等． HPLC 法同时测定山香圆片
中女贞苷和野漆树苷的含量［J］． 药物分析杂志，2009，29
(6) :912-914．
［19］ 李 祥，兀 浩，文 星，等． 表面活性剂及其复配体系对
盾叶薯蓣中薯蓣皂苷提取率影响的研究［J］． 中成药，
2013，35(2) :407-411．
9852
2016 年 12 月
第 38 卷 第 12 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
December 2016
Vol． 38 No． 12