全 文 ：驱虫斑鸠菊不同提取部位对小鼠 B16细胞黑素
合成及酪氨酸酶活性的影响
姚　莉1＊ , 李　茜1 , 尚　靖2＊＊
(1新疆医科大学附属中医医院药学部 , 新疆　乌鲁木齐　830000;2江苏南京市中国药科大学新药筛选中心 , 南京　210038)
摘要:目的　观察驱虫斑鸠菊不同提取部位对体外培养的小鼠 B16 细胞黑素合成和酪氨酸酶活性的影响。
方法　由驱虫斑鸠菊得到 3 种不同部位提取物 ,分别为母液(Q1)、乙酸乙酯提取物(Q2)及萃取后物质(Q3)。以
体外培养的小鼠 B16黑素瘤细胞为模型 ,以 3 个色素合成途径中的关键点为多靶点评价体系 , 其中采用 MT T 法测
定提取物对 B16小鼠黑素瘤细胞增殖的影响 ,采用 L-DOPA 氧化法测定对酪氨酸酶活性的影响 ,采用 NaOH 裂解
法检测黑素含量。结果　3 种提取部位对 B16 细胞都有一定的增殖作用 ,其中 Q1 、Q2 促进增殖作用明显(P <
0.01), Q3 有轻微的促进增殖的作用。 Q1、Q3 对酪氨酸酶有不同程度的激活作用并促进黑素的合成 , 其中 Q3 在
20 ～ 80μg/ml范围内促进 B16 细胞黑素合成作用明显(P <0.05或P <0.01),且 Q3以浓度依赖方式上调酪氨酸
活性。结论　驱虫斑鸠菊残留的水溶性部分是稳定的调节 B16 细胞黑素合成的活性部位。
关键词:黑素合成;小鼠 B16 细胞;驱虫斑鸠菊;活性部位
中图分类号:R-332;R34　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5551(2010)10-1191-04
Effects of different fraction from Vernonia Anthelmintica Willd on menlanin
synthesis and tyrosinase activity of B16 murine melanoma cell in vitro
YAO Li , LI Qian , SHANG Jing
(Department of Pharmacy , Aff i liated Tradit ional Chinese Med ical Hospital ,
X inj iang Medical Univ ersity , Urumqi 830000 , China)
Abstract:Objective　T o investigate the regulation of melanogenesis and ty rosinase activity in the response
of B16 murine melanoma cells to dif ferent fraction f rom Vernonia Anthelm intica Willd .Methods　The
samples we re prepared by so lvent ex traction , three ex tracts were go t ten f rom Vernonia Anthelmint ica
Willd , mothe r liquid(Q1), ethylace tate ex t ract(Q 2), wate r ex t ract(Q3).The culture B16 murine mela-
noma cells w as used as a model , three crit ical points in the route of melanogenesis as multiple target ap-
praisal sy stem.MT T was used to study the proliferation , the ty rosinase activi ty w as detected by L-DOPA-
O xidat ion , the melanin w as measured by NaOH-assay .Results　All of three f ract ion increased cell prolif-
eration , Q1 and Q2 signif icantly increased cell proliferation(P <0.01), while the function o f Q3 w as
slight.The ty ro sinase activity tests show ed that Q1 and Q3 stimulated the act ivity and increase melanin
content , 20 ～ 80μg/ml Q3 w ould obviously increase melanin content(P <0.05 , P <0.01), and upraise
the activi ty of ty ro sinase in a do se-dependent manner.Conclusion　Act ive fraction mainly exists on large
po lari ty , while w ater ex tract i s a stable active f raction.
Key words:melanogenesis;B16 murine cell;Vernonia Anthelmintica Wil ld ;activ e f raction
1191新疆医科大学学报　JOU RNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2010 Oct., 33(10)
＊
＊＊
作者简介:姚　莉(1982-),女 ,主管药师 ,研究方向:医院药学工作。
通讯作者:尚　靖 ,研究员。 E-mai l:shangjing2006@yahoo.com.cn。
　　驱虫斑鸠菊 (Vernonia Anthelmint ica Wil ld)
系菊科(Composi tae)一年生草本植物 , 为维吾尔
民间习用药材。其药用部位为驱虫斑鸠菊植物的成
熟果实 , 具有清除异常粘液质 、驱虫 、消肿 、散寒止
痛的作用 , 用于治疗湿寒性胃痛 、肝病 、白癜风
等[ 1] 。马慧军等[ 2] 报道总黄酮是治疗白癜风的主要
活性物质 ,但特点和作用机制不清楚。本研究对驱
虫斑鸠菊植物成熟果实的 3种不同部位提取物进行
药效学实验研究 ,旨在观察驱虫斑鸠菊不同提取部
位对小鼠 B16细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影
响 ,现报道如下 。
1　材料与方法
1.1　试剂 、仪器及细胞　RPMI1640 培养基(美国
GIBCO 公司),新生小牛血清(杭州四季青生物工程
材料有限公司), L-DOPA (左旋多巴 ,美国 Sigma
公司), MTT (四甲基偶氮唑蓝 ,上海华舜生物有
限公司),胰蛋白酶(美国 Sigma 公司),DMSO(二甲
基亚砜 ,Sigma 公司), 8-MOP(8-甲氧补骨酯素 ,江
苏溧阳市制药厂),小鼠 B16黑素瘤细胞(中国科学
院上海细胞库), Saf ire2 型微孔板酶联免疫检测仪
(瑞士 T ECAN 公司), IX71 倒置荧光相差显微镜
(日本 Olympus 公司),超净工作台(苏州艾可林净
化设备有限公司),BB 16型二氧化碳培养箱(德国
Hearous公司)。
1.2　药材提取浸膏及配制　驱虫斑鸠菊种子 300
g ,水煎煮 3次 ,合并煎煮液并浓缩成浸膏 ,得到的浸
膏经石油醚脱脂后为母液(Q 1),母液采用乙酸乙脂
萃取 ,其萃取物为 Q2(0.5 g)及萃取后物质 Q3(21
g)。8-MOP 为白色结晶 ,是一种呋喃香豆素类光敏
物 ,内服或外用 8-MOP 结合长波紫外线照射(PU-
VA)能使白癜风色素减退皮损复色 ,是临床使用最
多 、疗效得到公认的一种治疗白癜风的方法 ,为本实
验的阳性对照 。将 Q1 、Q2 、Q3 、8-MOP先用 DMSO
溶解 ,再用 RPM I 1640 稀释成贮存液 ,避光保存在
-20℃,临用前用新鲜培养基调至终浓度。
1.3　方法
1.3.1　MTT 法测细胞增殖率[ 3] 　将传代细胞的
浓度调节至 2.5×104 个/ml ,加入 96孔板 ,每孔0.1
ml后 ,用含不同浓度处理因素的新鲜培养液换液 1
次 ,置 37℃、5%CO 2 条件下继续培养 48 h ,每一处
理因素设立 3个复孔。结束前 4 h 加入 MT T 溶液
20 μl /孔 , 4 h 后弃上清液 ,每孔加入 150 μl DM-
SO ,充分振荡 ,置酶标仪测 A570。增殖率用每个细
胞加药处理组 A570 值占空白对照组 A570值的百
分率表示 ,每一处理因素重复测定 3次。
1.3.2　L-DOPA 氧化法测定酪氨酸酶活性　由张
汝芝等[ 4] 的方法经过调整 ,根据实验设计要求和培
养瓶规格选定细胞初始接种浓度为 5×105 个/瓶。
细胞接种 24 h 后 ,用添加药物的新鲜培养基换液 1
次 ,继续孵育 48 h 。收获大约 1×106 个细胞 ,离心
后 PBS 洗涤 2次 ,加入 20 mmol/L Tris-0.1%Tri-
onx-100 1 m l ,放入 4℃冰箱裂解 1 h , 1 000 r/min
离心 5 min ,取上清夜加入 96 孔板 ,每孔 100 μl ,再
加入 0.1% L-DOPA 反应液(PBS , pH =6.8)100
μl ,振摇 5 min后放入 37℃培养箱孵育 25 min 。于
分光光度计上测 A475值 。酪氨酸酶激活率用每个
细胞加药处理组 A475 值/细胞数占空白对照组
A475值/细胞数的百分率来表示。每一处理因素重
复测定 3次 。
1.3.3　黑素含量的测定[ 4-5] 　选定细胞初始接种浓
度为 5×105 个/瓶。细胞接种24 h后 ,用添加药物的
新鲜培养基换液 1次 ,继续孵育 72 h。收获大约 1×
107 个细胞 ,离心后PBS洗涤 2次 ,加入含1 mol/L的
NaOH(含 10%DMSO)吹打数次 ,放入 80℃水浴 30
min ,使黑素颗粒完全溶解 ,1 000 r/min离心 5 min ,
取上清夜加入 96孔板 ,每孔 100 μl ,于分光光度计测
A475值。黑素含量用每个细胞加药处理组 A475
值/细胞数占空白对照组 A475值/细胞数的百分率
来表示 。每一处理因素重复测定3次。
1.4　统计学处理　使用 SPSS16.0软件进行统计
学分析 ,所测数据以均数±标准差( x ±s)表示 ,配
对 t检验 ,检验水准α=0.05 。
2　结果
2.1　3种提取物对 B16 细胞形态的影响　在倒置
显微镜下观察 ,传代生长的 B16细胞主要为双极 ,
偶见三极生长的细胞。经驱虫斑鸠菊作用后 ,可以
发现 B16黑素细胞树突增多延长 ,树突边缘胞浆内
可见较多细小的棕黑色颗粒 ,见图 1。
图 1　驱虫斑鸠菊 3 个提取部位作用后 B16细胞形态(×200)
A:空白组;B:Q1(10 μg/ ml);C:Q2(10μg/ ml);D:Q3(10 μg/ ml)
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2.2　不同提取物对 B16 细胞增殖的影响　在实验
浓度范围内 ,同空白对照比较 , Q1 、Q2均能刺激细
胞增殖 , Q1 在 5 ～ 20 μg/ml 作用最明显 (P <
0.05),Q2在 10 μg/ml作用最强 (P <0.01), Q3
在(1.25 ～ 40 μg/ml)浓度范围有轻度刺激细胞增殖
的作用。对 B16 细胞增殖作用 Q2>Q1>Q3 ,见表
1。随药物极性的增大 ,部位达到最大增殖作用的浓
度增高 ,最高增殖率降低 ,初步预测对细胞有增殖作
用的活性物质向集中于极性低的部位。阳性对照药
物对 B16细胞增殖有轻微促进作用。
2.3　不同提取物对 B16细胞内酪氨酸酶活性和黑
素合成的影响 与空白对照组比较 ,在实验浓度范围
内 ,Q1和 Q3均能明显上调 B16细胞内酪氨酸酶活
(P <0.05或 P <0.01),并促进黑素合成 。在实验
浓度范围内 Q2有一定抑制酪氨酸酶活性的作用 ,
但对黑素含量无明显影响(P >0.05),Q3 在 20 ～
80 μg/ml浓度范围促进 B16细胞黑素合成作用明
显(P <0.05或P <0.01), 80μg/ml的Q3提取物
促进黑素合成和酪氨酸酶活性的作用与 40 μg/ml
的阳性对照 8-MOP 相当(P >0.05)。且 Q3以浓
度依赖方式上调酪氨酸活性 ,进一步说明酪氨酸酶
活性直接与黑素含量有关。对 B16细胞酪氨酸酶
活性和黑素合成的作用 ,Q3>Q1>Q2 ,见表 2 。
表 1　Q1 、Q2 、Q3 、8-MOP对 B16 细胞增殖率的影响( x±s , n=9)
处理因素 实验浓度(μg/ml)
1.25 2.5 5　　　 10　　 20　　 40　　
Q1 107.96±9.65 109.59±1.12 117.34±10.72＊ 116.36±5.55＊ 130.4±14.81＊＊ 121.35±11.07＊＊
Q2 108.64±1.20 111.47±4.08 115.43±6.20 132.75±4.37＊＊ 129.93±3.32＊＊ 116.72±1.71＊
Q3 110.32±6.35 109.30±1.33 115.50±11.82 113.77±2.41 105.08±12.38 107.06±2.82
8-MOP 104.83±4.96 115.43±7.63 116.69±9.83 113.41±7.73＊ 111.81±6.80＊ 116.08±8.54＊
　　注:与空白组比较 , ＊P <0.05 , ＊＊P <0.01
表 2　3 种提取物对 B16 细胞内酪氨酸酶活性和黑素含量的影响( x±s , n=9)
实验浓度
(μg/ ml)
酪氨酸酶活性
Q1 Q2 Q3　　　 8-MOP
黑素含量
Q1 Q2 Q3　　　 8-MO P
2.5 116.08±4.84 88.92±3.58 95.51±4.64 - 107.62±4.75 95.47±12.33 93.67±9.74 -
5 119.10±5.87＊ 109.38±4.51 93.16±3.58 - 110.58±4.60 93.05±18.84 82.95±13.41 -
10 120.33±18.64 95.77±6.54 89.50±16.36 - 98.80±2.18 107.98±22.70 80.01±25.22 -
20 145.23±5.69＊＊ 75.08±3.67 149.40±15.82＊＊ - 122.52±5.10＊ 92.41±24.91 156.88±14.34＊＊ -
40 128.65±4.93＊＊ 66.80±13.10 169.58±8.89＊＊ 183.91±26.33 145.04±7.48＊＊ 95.42±8.40 162.06±15.55＊＊ 202.47±37.28
80 115.14±9.58 73.22±5.87 174.42±18.08＊＊# - 125.60±10.12＊ 93.28±7.66 193.15±11.23＊＊# -
　　注:与空白组比较 , ＊P <0.05 , ＊＊P <0.01
3　讨论
细胞增殖 、酪氨酸酶活性 、黑素含量是 3种筛选
治疗色素障碍性疾病如白癜风药物的常用指标 ,其
中酪氨酸酶是色素疾病病因病理与药物干预色素代
谢的研究焦点。本实验在前期采用了 A375(人恶性
黑素瘤细胞)作为模型 ,检测药物的作用 ,发现 Q1 、
Q2 、Q3均有一定促进 A375细胞增殖的作用 ,但对
酪氨酸酶和黑素含量的作用不明显 。而邓瑞春等[ 6]
报道驱虫斑鸠菊注射液能促进 A375细胞增殖 ,上
调酪氨酸酶活性和黑素含量 ,与本实验前期结果不
大一致。Eberle等 [ 7] 报道 A375是一种酪氨酸酶和
黑素表达量很低的细胞系 ,因此在实验中很难检测
到酪氨酸酶和黑素含量 ,初步判定并不适用于作为
调节黑素代谢药物的筛选模型 。
B16小鼠黑素瘤细胞是一种高度黑素化的黑素
瘤细胞株 ,国际上常用于黑素合成的相关研究 ,因此
本实验以体外培养的 B16鼠黑素瘤细胞为模型 ,从
三方面来分析驱虫斑鸠菊的提取物 ,发现不同的提
取方式得到的提取物其药效有一定的差异:驱虫斑
鸠菊作用 72 h后 ,黑素细胞树突增多延长 ,树突边
缘胞浆内可见较多细小的棕黑色颗粒 ,提示驱虫斑
鸠菊可诱导黑素小体成熟化和向树突边缘转移 。在
实验浓度范围内(20 ～ 80 μg/ml),驱虫斑鸠菊 Q3
提取物对体外培养的的 B16细胞黑素合成作用明
显(P <0.05或 P <0.01),且以浓度依赖方式上调
酪氨酸活性 ,该作用在 72 h 达到高峰 。80μg/ml的
Q3提取物促进黑素合成和酪氨酸酶活性的作用与
40 μg/ml的阳性对照 8-MOP 相当 。初步表明调节
B16细胞黑素合成的活性部位主要集中于极性大的
溶剂中 ,即驱虫斑鸠菊残留的水溶性部分 。驱虫斑
鸠菊提取物 Q 1 、Q2均能刺激细胞增殖 , Q1 在 5 ～
20 μg/ml作用最明显(P <0.05), Q2在 10 μg/ml
作用最强(P <0.01),Q3 在(1.25 ～ 40 μg/ml)浓
度范围有轻度刺激细胞增殖的作用 ,而高浓度的
Q1 、Q2提取物(>100 μg/ml)对细胞生长有一定的
抑制作用。提示在实验中应根据 IC50调整驱虫斑鸠
菊的量 ,避免高浓度形成的药物毒性作用 。
(下转 1197 页)
1193新疆医科大学学报　JOU RNAL OF XINJIANG MEDICAL UNIVERSITY　2010 Oct., 33(10)
及样品各组分均能较好分离。因此选择了乙腈∶0.
2%磷酸缓冲盐作为流动相梯度洗脱。
4.4　未知物分析　从样品图(图 1B)可知 ,除已知
的芦丁和异槲皮苷外 ,至少还有 1种含量较高的物
质(保留时间为 4 、4.5 min),有待进一步研究确定 。
芦丁和异槲皮苷是药桑叶中主要的黄酮类成
分 ,可以作为药桑叶黄酮测定的指标。本实验采用
RP-HPLC 法 ,采用梯度洗脱方式 ,在 10 min内同时
测定了不同产地 、不同季节药桑叶中芦丁和异槲皮
苷的含量 ,结果表明不同产地药桑叶中芦丁 、异槲皮
苷的含量有一定的差异 ,可能是因为地理环境的不
同 ,天气 、温度变化的不同导致这些差异 。不同季节
的药桑叶中二者的含量也有明显的差异 ,说明采摘
时间越早桑叶中芦丁 、异槲皮苷的含量越高 ,并且随
着季节的变化含量有明显的降低。药桑叶中芦丁 、
异槲皮苷的含量有助于进一步研究其效应成分及质
量的有效控制。由于药桑叶中芦丁 、异槲皮苷的含
量受不同产地 、不同季节等多种因素的影响 ,作用因
素较为复杂 ,有待进一步的考察。
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[ 收稿日期:2010-06-02]
(上接 1193页)
　　黑素细胞合成黑素是一种多步骤 、多酶参与的
复杂过程 ,酪氨酸酶是黑素合成中最为关键的一种
限速酶 , TRP1和 TRP2同属于酪氨酸酶基因超级
家族成员 ,二者催化黑素合成的后续步骤 ,在黑素细
胞内它们与酪氨酸酶一起以多酶复合体形式存在 ,
并对该复合体起稳定作用 。雷铁池[ 8] 报道一些能上
调黑素合成作用的物质都与酪氨酸酶的表达有一定
联系 ,在此基础上分析活性成分的共同结构与对酪
氨酸酶表达的影响有待进一步的研究。
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