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驱虫斑鸠菊中紫铆素、紫铆花素的分离及其对人A375黑素瘤细胞黑素合成作用的影响



全 文 :基金项目:国家自然科学基金资助项目(81260689)
作者简介:赵萍萍,女,研究生 研究方向:药理学 * 通讯作者:闫明,男,研究员 研究方向:药物分析与新药研发 Tel: (0991)
2322941 E-mail:yanming21cn@ sohu. com
驱虫斑鸠菊中紫铆素、紫铆花素的分离及其对人 A375 黑素瘤细胞黑素
合成作用的影响
赵萍萍,霍仕霞,彭晓明,高莉,白鹏,闫明* (新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所,新疆维吾尔医方剂学重点实验室,乌鲁木齐
830049)
摘要:目的 分离纯化驱虫斑鸠菊中紫铆素、紫铆花素,初步探讨这两种化合物对人 A375 黑素瘤细胞增殖及黑素合成作用的
影响。方法 采用硅胶、Sephadex LH - 20 反复柱层析分离纯化紫铆素、紫铆花素;分别采用 MTT 法、酶学法及 NaOH 法测定
这两种化合物对人 A375 黑素瘤细胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成的影响。结果 分离得到化合物紫铆素、紫铆花素,在
0. 50 ~ 10. 00 μg·mL -1内紫铆素、紫铆花素促进 A375 细胞增殖,且紫铆花素促增殖作用强于紫铆素(P < 0. 05) ;在 0. 10 ~
1. 00 μg·mL -1内两种化合物均上调酪氨酸酶活性;在 0. 50 ~ 5. 00 μg·mL -1内,紫铆花素促进黑素合成,紫铆素抑制黑素合
成。结论 紫铆素、紫铆花素可能是驱虫斑鸠菊的药效成分;紫铆花素促进 A375 细胞的增殖,且使 A375 细胞黑素合成增加,
紫铆素轻度抑制黑素合成。
关键词:驱虫斑鸠菊;紫铆素;紫铆花素;分离纯化;人 A375 黑素瘤细胞;黑素合成
doi:10. 11669 /cpj. 2013. 20. 008 中图分类号:R282 文献标志码:A 文章编号:1001 - 2494(2013)20 - 1724 - 04
Purification of Butin and Butein from the Vernonia anthelmintica Willd and Their Effects on Proliferation
and Melanogenesis of A375 Human Melanoma Cells
ZHAO Ping-ping,HUO Shi-xia,PENG Xiao-ming,GAO Li,BAI Peng,YAN Ming* (Laboratory of Traditional Uyghur
Medicine Prescription Urmuqi xinjiang,Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine,Urumqi 830049,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To purify butin and butein from the Vernonia anthelmintica Willd,and preliminary study their effects on
proliferation and melanogenesis of A375 human melanoma cells. METHODS Selica gel and Sephadex LH - 20 column chromatogra-
phy methods were used to separate butin and butein;their effects on proliferation and melanogenesis of A375 human melanoma cells
were studied by MTT method,enzyme method and NaOH method. RESULTS Butin and butein were isolated and identified. In the
concentration range of 0. 50 - 10. 00 μg·mL -1,butin and butein enhanced the proliferation of A375 human melanoma cells,and the
effect of butein was stronger than butin(P < 0. 05) ;in the concentration range of 0. 10 - 1. 00 μg·mL -1,both butin and butein in-
creased the activity of tyrosinase;in the concentration range of 0. 50 - 5. 00 μg·mL -1,butein stimulated melanogenesis,but butin in-
hibited melanogenesis. CONCLUSION Butin and butein may be the active components of Vernonia anthelmintica Willd;butein pro-
motes the proliferation and stimulates the melanogenesis of A375 human melanoma cells,however,butin mildly inhibites the melanogen-
esis.
KEY WORDS:Vernonia anthelmintica Willd;butin;butein;purification;A375 human melanoma cells;melanogenesis
驱虫斑鸠菊[1][Vernonia anthelmintica(L. )
Willd]为菊科(Compositae)斑鸠菊,属一年生草本植
物,是维吾尔医治疗白癜风的主要药材,其主要化学
成分为总黄酮类,药用部位为其成熟果实,具有激活
酪氨酸酶活性、提高黑素含量、调节机体免疫、改善
局部微循环等药理作用[2-3]。研究发现,驱虫斑鸠菊
不同乙醇浓度提取物的 13 个共有峰所对应化学成
分与其促进人 A375 黑素瘤细胞增殖作用有不同程
度的关联性,且脂溶性成分对细胞增殖作用贡献大
于非脂溶性成分[4]。本实验根据前期研究结果对
驱虫斑鸠菊中脂溶性成分进行分离、纯化,获得紫铆
素、紫铆花素两种单体化合物,并进行了结构鉴定,
同时,以体外培养人 A375 黑素瘤细胞作为模型,初
步探讨了紫铆素、紫铆花素对人 A375 黑素瘤细胞
的增殖及黑素合成的影响,为深入研究驱虫斑鸠菊
治疗白癜风的药理机制提供理论依据。
·4271· Chin Pharm J,2013 October,Vol. 48 No. 120 中国药学杂志 2013 年 10 月第 48 卷第 20 期
1 材 料
1. 1 药材及细胞
驱虫斑鸠菊药材(新疆维吾尔自治区维吾尔医
医院) ,经新疆维吾尔自治区维吾尔医医院艾尼瓦
尔鉴定为菊科植物驱虫斑鸠菊[Vernonia anthelmin-
tica(L. )Willd]的干燥成熟果实;阳性对照药甲氧
沙林(8-MOP,中国药品生物制品鉴定所,批号:
100437-200601) ;人 A375 黑素瘤细胞(上海中科院
细胞库提供) ,其他药品均由本实验室自制。
1. 2 仪器
核磁共振仪(Varian) ,1 H-NMR 600 MHz,13 C-
NMR 150 MHz;日本岛津(Shimadzu)高效液相色谱
仪:LC - 20AB 二元泵,SPD - M20A 检测器,SIL -
20A自动进样器,CTO -20A柱温箱,DGU -20A3 脱
气机,CBM - 20A 控制器,Empower 数据采集系统;
Milli - Q超纯水纯化系统(18 MΩ,Millipore 公司) ;
SGT7200HBT型超声清洗器(上海冠特超声仪器有
限公司) ;BS110S 电子天平(北京赛多利斯有限公
司) ;LDZX - 75KBS 型立式压力蒸汽灭菌器(上海
申安医疗器械厂) ;YJ - 875 净化工作台(中国上
海) ;MCO - 18AIC 型 CO2培养箱(日本 SANYO 公
司) ;MDF - 192 超低温冰箱(日本 SANYO 公司) ;
BIO-RAD550 型酶标仪(美国伯乐公司) ;XD - 101
倒置显微镜(中国江南光电)。
1. 3 试剂
乙腈、甲醇为色谱纯;超纯水;磷酸为分析纯;柱
层析硅胶(200 ~ 300 目)及薄层用硅胶 G 板(青岛
海洋化工厂,批号:20110203) ;Sephadex LH - 20(北
京绿百草有限公司,批号:17-0090-02) ;DMEM 干粉
培养基(美国 Gibco 公司,Lot No:1272628) ;胎牛血
清(FBS,美国 Hyclone 公司,Lot No:NVM0344) ;胰
酶、Troton X-100(Scientific Research Speclal) ;四甲
基偶氮噻唑蓝(MTT,美国 Amresco公司)。
2 方法与结果
2. 1 紫铆素、紫铆花素的提取分离及纯化
称取 2. 5 kg驱虫斑鸠菊药材,提取溶剂为体积
分数 85%乙醇溶液,10 /8 /8 倍溶剂用量,回流提取
3 次,时间为 2 h /1 h /1 h。获取干浸膏 250 g,依次
用石油醚、乙酸乙酯萃取,得乙酸乙酯提取物 25 g,
乙酸乙酯部分用硅胶柱色谱分离、三氯甲烷-甲醇
(20∶ 2、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1)系统进行梯度洗脱,再经
Sephadex LH -20 反复柱色谱(甲醇及三氯甲烷-甲
醇洗脱) ,结晶法纯化得到化合物紫铆素(35. 3
mg)、紫铆花素(43. 1 mg)。
2. 2 紫铆素、紫铆花素的结构鉴别及色谱峰归属
2. 2. 1 结构鉴别 紫铆素:淡黄色针晶(甲醇) ,
1H-NMR(600 Hz,CD3 OD)δ:7. 65(1H,d,J = 8. 4
Hz,H-5) ,6. 98(1H,d,J = 1. 8 Hz,H-2) ,6. 82(1H,
dd,J1 = 1. 8 Hz,J2 = 7. 8 Hz,,H-6) ,6. 80(1H,d,
J = 7. 8 Hz,H-5) ,6. 51(1H,dd,J1 = 2. 4 Hz,J2 =
8. 4 Hz,H-6) ,6. 36(1H,d,J = 2. 4 Hz,H-8 ) ,5. 35
(1H,dd,J1 = 3. 0 Hz,J2 = 12. 6 Hz,H-2) ,2. 98(1H,
dd,J1 = 12. 6 Hz,J2 = 16. 2 Hz,H-3b) ,2. 65(1H,dd,
J1 = 2. 4 Hz,J2 = 16. 2 Hz,H-3a) ;
13C-NMR(CD3OD)
δ:190. 5(C = O) ,165. 2(C-7) ,164. 4(C-9) ,146. 2
(C-4) ,145. 9(C-3) ,132. 0(C-5) ,129. 4(C-1) ,
119. 2(C-6) ,116. 0(C-2) ,115. 2(C-5) ,114. 7(C-
6) ,111. 1(C-8) ,103. 6(C-10) ,80. 5(C-2) ,44. 7(C-
3)。以上光谱数据与文献[5-6]报道的基本一致。
紫铆花素:黄色结晶。1H-NMR(CD3OD)δ:7. 86
(1H,d,J = 9. 0 Hz,H-6) ,7. 64(1H,d,J = 15. 0
Hz,H-β) ,7. 45(1H,d,J = 15. 0 Hz,H-α) ,7. 12
(1H,d,J = 2. 4 Hz,H-2) ,7. 04(1H,d,J = 7. 8 Hz,H-
6) ,6. 35(1H,d,J = 7. 8 Hz,H-5) ,6. 23(1H,d,J =
2. 4 Hz,H-3) ,6. 76(1H,d,J = 7. 8 Hz,H-5 ) ;13C-
NMR(CD3OD)δ:192. 8(C = O) ,167. 5(C-2) ,166. 3
(C-4) ,149. 9(C-2) ,146. 8(C-4) ,146. 1(C-β) ,
133. 2(C-6) ,128. 4(C-6) ,123. 6(C-α) ,118. 3(C-
1) ,116. 6(C-1) ,115. 8(C-5) ,114. 7(C-5) ,109. 1
(C-3) ,103. 8(C-3) ,以上数据与文献[6-7]报道的
紫铆花素基本一致。
2. 2. 2 色谱峰归属 分别称取“2. 1”项下获得的
驱虫斑鸠菊浸膏、分离纯化得到的紫铆素、紫铆花素
样品各 5 mg,10 mL量瓶定容,经 0. 45 μm微孔滤膜
过滤,续滤液进行 HPLC 分析。色谱条件为:Shim-
pack VP-ODS C18色谱柱(4. 6 mm ×150 mm,5 μm) ;
流动相:乙腈(A)-0. 5%磷酸水溶液(B) ;梯度洗脱,
0 ~ 70 min,10% ~ 32%乙腈;检测波长:220 nm;柱
温:30 ℃;流速:1 mL·min -1;进样量:10 μL。在相
同色谱条件下,同一化合物,其色谱峰的保留时间以
及紫外光谱图是一致的。根据这一原则,紫铆素保
留时间为tR = 28. 2 min,与药材指纹图谱当中的 1 号
色谱峰相对应;紫铆花素的色谱峰保留时间为
tR = 52. 15 min,但在驱虫斑鸠菊提取物的指纹图谱
中,tR = 52. 15min处并没有发现色谱峰。
2. 3 紫铆素、紫铆花素及 8-MOP对人 A375 黑素瘤
细胞增殖及黑素合成的影响
·5271·
中国药学杂志 2013 年 10 月第 48 卷第 20 期 Chin Pharm J,2013 October,Vol. 48 No. 20
2. 3. 1 细胞增殖的测定 采用 MTT 法[8-10]进行测
定,每次实验取同一代细胞。取对数生长期单细胞
悬液,调整细胞浓度,100 μL·孔 - 1,铺 96 孔板,
培养 24 h,加入含药液培养基和正常培养基,200
μL·孔 - 1,每一浓度设 4 个复孔,培养 48 h,于结
束前 4 h 加 5 mg·mL - 1 MTT 溶液 20 μL,继续培
养 4 h,加 DMSO 200 μL·孔 - 1,酶标仪于 490 nm
处测定吸光度值(A) ,实验重复 3 次。增殖率
(%)= (加药组 A - 空白组 A)/空白组 A ×
100%,结果见表 1。
与空白对照相比,在设定的浓度范围内紫铆素、紫铆
花素及 8-MOP均能刺激 A375 细胞增殖。紫铆素在
0. 1 ~ 0. 5 μg·mL -1内作用极显著(P < 0. 01) ,在
0. 5 ~ 1. 0 μg·mL -1作用显著(P < 0. 05) ,在质量浓
度大于 5. 0 μg·mL -1时,对细胞生长产生一定抑制
作用,且随浓度的增大,其对细胞增殖作用减弱;紫
铆花素在 0. 1 ~ 1. 0 μg·mL -1内及 10. 0 μg·mL -1
时差异极显著(P < 0. 01) ,在 1 ~ 5 μg·mL -1作用
显著(P < 0. 05) ,且随浓度的增大,其对细胞增殖作
用增强;8-MOP在 0. 5 ~ 10. 0 μg·mL -1内作用显著
(P < 0. 01) ,且随浓度的增大,其对细胞增殖作用总
体增强。
2. 3. 2 酪氨酸酶活性的检测 采用酶学法[8-10]检
测,每次实验取同一代细胞。取对数生长期单细胞
悬液,100 μL·孔 - 1,铺 96 孔板,培养 24 h,加入含
药液培养基和正常培养基,200 μL·孔 - 1,每一浓度
设 4 个复孔,培养 48 h 后弃培养液。用 PBS 冲洗 2
次,每孔加入 1 mol·L -1Triton X-100 溶液 50 μL,迅
速置 - 70 ℃冻存 30 min,随后室温融化使细胞完全
裂解,37 ℃预温后加入 0. 25% L-Dopa 溶液 10 μL,
置 37 ℃电热恒温水槽中反应 2 h,用酶标仪于 490
nm处测定吸光度值(A) ,实验重复 3 次。激活率
(%)=加药组 A /空白组 A × 100%,结果见表 2。
与空白对照相比,在设定的浓度范围内紫铆素、
紫铆花素均在一定程度上上调 A375 细胞酪氨酸酶
的作用。其中紫铆素在 1. 0 μg·mL -1、紫铆花素在
0. 5 ~ 1 μg·mL -1呈现显著性作用(P < 0. 05) ,与
0. 5 μg·mL -1的 8-MOP 相比存在统计学差异(P <
0. 05) ;紫铆素在 10. 0 μg·mL -1时,对 A375 细胞酪
氨酸酶活性明显有下调作用(P < 0. 05) ;在 0. 1 ~
1. 0 μg·mL -1下,紫铆花素的上调作用最大。随着
浓度的增大,且总体上紫铆素、紫铆花素及 8-MOP
对细胞酪氨酸酶活性的上调作用下降。
2. 3. 3 黑素含量的检测 采用 NaOH 裂解法[8-10]
检测,每次实验取同一代细胞。取对数生长期单细
胞悬液,100 μL·孔 - 1,铺 96 孔板,培养 48 h 弃培
养液,加入含药液培养基和正常培养基,200 μL·
孔 - 1,每一浓度设 4 个复孔,继续培养 48 h,倾去上
清液,用 PBS冲洗 2 次,加入 1 mol·L -1的 NaOH溶
液 150 μL,在 37 ℃作用 48 h,充分碱裂解细胞、溶
解黑素颗粒;用酶标仪于 490 nm 处测定吸光度值
(A) ,实验重复 3 次。黑素含量(%)=加药组 A /空
白组 A × 100%,结果见表 3。
与空白对照相比,其中紫铆素在设定的浓度范
围内黑素含量呈现下降趋势,黑素含量均减小(P <
0. 01) ;紫铆花素在 0. 5 ~ 5. 0 μg·mL -1时,促进
A375 细胞黑素的合成,且随浓度的增加,促进作用
增强,但无显著作用(P > 0. 05) ,浓度大于 5. 0 μg·
mL -1时,抑制 A375 细胞黑素的合成,与紫铆素相
比,抑制作用较弱( (P < 0. 05) ;8-MOP 在 0. 5 ~ 5. 0
μg·mL -1时,随着浓度的增大,促进黑素合成作用
增强,无显著差异(P > 0. 05) ,浓度大于 1. 0 μg·
mL -1时,抑制 A375 细胞黑素的合成。总体上紫铆
素、紫铆花素及8-MOP对A375细胞黑素合成的促
表 1 紫铆素、紫铆花素及 8-MOP对 A375 细胞增殖的影响 . n = 4,珋x ± s
Tab. 1 Effects of butin,butein and 8-MOP on proliferation of human melanoma cell line A375
ρ
/μg·mL -1
8-MOP Butin Butein
A Proliferation /% A Proliferation /% A Proliferation /%
0. 00 0. 463 5 ± 0. 085 6 0. 00 0. 463 5 ± 0. 085 6 0. 00 0. 463 5 ± 0. 085 6 0. 00
0. 10 0. 499 8 ± 0. 045 4 7. 82 0. 658 6 ± 0. 028 12) 42. 09 0. 660 8 ± 0. 022 52) 42. 47
0. 50 0. 634 1 ± 0. 043 12) 36. 81 0. 638 0 ± 0. 008 92) 37. 65 0. 618 6 ± 0. 031 32) 33. 46
1. 00 0. 653 8 ± 0. 014 52) 41. 06 0. 565 0 ± 0. 036 81) 21. 90 0. 637 2 ± 0. 053 52) 37. 47
5. 00 0. 611 8 ± 0. 037 22) 32. 00 0. 522 6 ± 0. 044 8 12. 75 0. 644 3 ± 0. 047 12) 39. 00
10. 00 0. 631 4 ± 0. 043 62) 36. 22 0. 461 5 ± 0. 009 0 -0. 43 0. 679 5 ± 0. 028 72) 46. 60
注:与生长对照组比较1)P <0. 05,具有显著性差异;与生长对照比较2)P <0. 01,具有极显著性差异,下同
Notes:compared with the normal control group,the difference being significant,1)P < 0. 05;compared with the normal control group,the difference being extremely signifi-
cant,2)P <0. 01
·6271· Chin Pharm J,2013 October,Vol. 48 No. 120 中国药学杂志 2013 年 10 月第 48 卷第 20 期
表 2 紫铆素、紫铆花素及 8-MOP 对 A375 细胞的酪氨酸酶
的影响 . n = 4,珋x ± s
Tab. 2 Effects of butin,butein and 8-MOP on tyrosinase of hu-
man melanoma cell line A375. n = 4,珋x ± s
ρ
/μg·mL -1
8-MOP Butin Butein
0. 00 100. 00 ± 0. 005 7 100. 00 ± 0. 005 7 100. 00 ± 0. 005 7
0. 10 132. 79 ± 0. 018 2 106. 31 ± 0. 015 3 111. 76 ± 0. 004 1
0. 50 103. 97 ± 0. 013 9 102. 02 ± 0. 007 5 149. 53 ± 0. 012 21)
1. 00 104. 75 ± 0. 016 3 143. 69 ± 0. 011 61) 137. 07 ± 0. 011 21)
5. 00 89. 56 ± 0. 008 6 99. 30 ± 0. 007 6 100. 86 ± 0. 010 1
10. 00 89. 95 ± 0. 011 7 59. 58 ± 0. 010 8 90. 73 ± 0. 010 4
表 3 紫铆素、紫铆花素及 8-MOP 对 A375 细胞黑素含量的
影响 . n = 4,珋x ± s
Tab. 3 Effects of Butin,Butein and 8-MOP on content of mela-
nin in human melanoma cell line A375. n = 4,珋x ± s
ρ
/μg·mL -1
8-MOP Butin Butein
0. 00 100. 00 ± 0. 015 3 100. 00 ± 0. 015 3 100. 00 ± 0. 015 3
0. 10 116. 59 ± 0. 017 8 55. 16 ± 0. 012 92) 96. 97 ± 0. 006 4
0. 50 125. 11 ± 0. 025 0 65. 02 ± 0. 006 22) 116. 03 ± 0. 017 7
1. 00 95. 52 ± 0. 011 9 69. 13 ± 0. 005 12) 121. 52 ± 0. 023 9
5. 00 68. 39 ± 0. 008 6 50. 82 ± 0. 007 42) 124. 66 ± 0. 011 7
10. 00 93. 72 ± 0. 014 3 42. 97 ± 0. 008 02) 88. 19 ± 0. 014 71)
进作用随浓度的升高而减弱。
3 讨 论
目前,对驱虫斑鸠菊治疗白癜风的具体作用物
质、靶点及机制的相关研究较少,而本实验为该药材
这些方面的研究提供了数据支持和理论依据。本实
验对驱虫斑鸠菊药材体积分数 85%乙醇提物浸膏
进行分离纯化,确定 2 个单体,分别为紫铆素和紫铆
花素。同时,对紫铆素、紫铆花素、该药材指纹图谱
峰进行色谱峰比对结果也表明紫铆素是该药材的化
学成分;而在药材指纹图谱中并没有找到与紫铆花
素相对应的色谱峰,可能原因是紫铆花素在驱虫斑
鸠菊药材中含量极少,在现有的检测条件下并不能
检测到,后续可借助气质联用、质谱联用、化合物对
应紫外色谱图比对等方法进行验证。紫铆素和紫铆
花素均为黄酮类成分,提示该药材中其他黄酮类成
分也可能是药效成分,需深入研究。
紫铆素、紫铆花素及 8-MOP 对人 A375 黑素瘤
细胞增殖,酪氨酸酶活性及黑素含量影响的实验结
果提示驱虫斑鸠菊中含量少的化学成分可能是治疗
白癜风药效成分。尚婧等[11]研究表明,驱虫斑鸠菊
提取物能抑制恶性黑色素瘤 A375 细胞的增殖,且
在一定范围内呈浓度依赖关系,该结果与本实验中
紫铆素在浓度大于 5. 0 μg·mL -1时的增殖结果基
本一致。人 A375 黑素瘤细胞的恶性增殖会引发黑
素瘤等相关肿瘤疾病。紫铆素作用 A375 细胞结果
提示,驱虫斑鸠菊药材中紫铆素可能与防治黑素瘤
等肿瘤相关疾病的发生相关,关于该药材抗肿瘤方
面的研究值得探讨。今后,将深入探索紫铆素和紫
铆花素的作用靶点和机制,结合体内药效实验、体外
相关细胞、分子实验,以求全面、综合评价紫铆素和
紫铆花素防治白癜风的药理作用机制。
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(收稿日期:2012-11-09)
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中国药学杂志 2013 年 10 月第 48 卷第 20 期 Chin Pharm J,2013 October,Vol. 48 No. 20